王 娟，華 蓉，游金坤，鄧雅元，孫達鋒，楊璐敏，吳素蕊**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221）

農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與人們的健康息息相關(guān)。隨著工業(yè)經(jīng)濟的飛速發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品中重金屬含量及其危害引起了人們廣泛關(guān)注。2022年6月30日發(fā)布的《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB 762-2022）[1]中對污染物鉛、鎘、汞、砷、錫、鎳、鉻的限量做了進一步的細化和調(diào)整，其中對食品類別進行了重新劃分，尤其是對食用菌。因食用菌的生物學特性及加工保存特點，對其相關(guān)污染物限量的針對性更強，這對污染物檢測工作也提出了更高要求。

元素的化學形態(tài)與其毒性、生物可利用性、遷移性密切相關(guān)。汞在自然界中以3種形態(tài)存在，即單質(zhì)汞、無機汞和有機汞，在生物圈中易于遷移和轉(zhuǎn)化，最終可通過呼吸道、食物鏈等路徑傳遞給人類，威脅人類健康[2-6]。食用菌作為廣受人們喜愛的大型真菌，其重金屬安全問題一直備受關(guān)注[7-12]，因此其重金屬含量檢測數(shù)據(jù)的準確性對產(chǎn)品質(zhì)量的判定非常重要。

原子熒光法作為汞試樣測定的主要方法一直被廣泛應用[13-15]。同時，采用微波消解處理樣品具有消解速度快、消解效率高、分析準確度高、環(huán)保節(jié)能、平行性良好、重復性高等優(yōu)點[16-17]，是實驗室優(yōu)選的樣品處理方法。

不確定度是表征測量結(jié)果量值分散程度的參數(shù)，是對測定結(jié)果可靠程度的評定，是一個完整的定量分析結(jié)果不可或缺的組成部分[18-21]。通過評定不確定度，不僅可以對測量結(jié)果進行有效的質(zhì)量控制，分析影響結(jié)果準確性的關(guān)鍵試驗技術(shù)控制點，同時還可提高結(jié)果的可靠性和分析測試人員的技術(shù)水平，了解結(jié)果判定的風險，也便于實驗室間檢測結(jié)果的比對[22-23]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

重鉻酸鉀、硝酸、氫氟酸、氫氧化鉀，優(yōu)級純，重慶川東化工（集團）有限公司；硼氫化鉀（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；GSB 04-1729-2004汞標準溶液 （1 000±1） μg·mL-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；香菇粉分析標準物質(zhì)（指定值為 0.193 mg·kg-1，│Z│≤2時標準值為0.162 mg·kg-1～0.224 mg·kg-1， 標 準 物 質(zhì) 編 號P36471），廣州譜恩科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

Kylin 12型原子熒光光度計，北京吉天儀器有限公司；T-214電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；MARS 6微波消解儀，美國CEM公司；UPR-Ⅱ-10T超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司；單標線吸量管A級（1 mL），四川蜀玻（集團） 有限責任公司；單標線容量瓶A級（10 mL、25 mL、50 mL、100 mL），天津市天科玻璃儀器制造有限公司。

器具均按照國家的檢定規(guī)程要求進行檢定，計量性能見表1。

表1 器具計量性能Tab.1 Measuring performance of instruments

1.3 試驗設計

1.3.1 依據(jù)標準

1）檢測試驗：參照《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》（GB 5009.17-2021）[24]中的第一法——原子熒光光譜分析法，試樣采用微波消解。

2）不確定度計算：依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1-2012）[25]及《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）[26]，以評價試驗關(guān)鍵技術(shù)準確度。

1.3.2 試樣處理

稱取試樣0.2 g～0.3 g于微波消解內(nèi)管中，用少量純水潤濕，在通風櫥中加入硝酸8.0 mL，過夜。次日加入氫氟酸0.5 mL，混勻使樣品與消解液充分接觸。將內(nèi)管置于消解罐中密封，放入微波消解儀內(nèi)進行微波消解。微波消解升溫程序見表2。

表2 微波消解升溫程序Tab.2 Temperature rise procedure of microwave digestion

如表2所示程序進行微波消解，程序結(jié)束后冷卻至室溫。將消解內(nèi)管取出，緩慢泄壓放氣后打開蓋子，將內(nèi)管移入趕酸器。設置溫度150℃，加熱至管內(nèi)液體為1 mL左右，取出，冷卻至室溫。用純水多次洗滌內(nèi)管以便將液體全部轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用純水定容，混勻。同時按照以上相同的試劑和步驟進行空白試驗。放置0.5 h，上機測定。

1.3.3 校準系列溶液的制備

使用汞標準固定液（5%硝酸+0.05%重鉻酸鉀的混合溶液）作為定容介質(zhì)，將汞標準貯備液（1 000 μg·mL-1）稀釋配制成100 ng·mL-1的汞標準使用液。用1 mL單標線吸量管移取1 mL汞標準使用液于50 mL容量瓶中，使用體積分數(shù)為10%的硝酸溶液定容，混勻，配制成2 ng·mL-1的汞標準工作液。再使用原子熒光光度計自動配制標準系列溶液，質(zhì)量濃度分別為 0、0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、1.50 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1。自動配制標準曲線可最大限度避免由于試劑純度不高、玻璃器皿污染等隨機影響引起的測量結(jié)果準確度下降。

1.3.4 儀器工作參數(shù)

依據(jù)原子熒光光度計儀器使用說明書調(diào)節(jié)儀器至最佳工作狀態(tài)。汞測量條件：光電倍增管負高壓為270 V；燈電流為60 mA；原子化器溫度為200℃；載氣流量為400 mL·min-1；屏蔽器的流量為800 mL·min-1；讀數(shù)時間為16 s；延遲時間為1 s；測量方式為校正曲線法；讀數(shù)方式為讀取峰面積；載流為3%硝酸溶液；還原劑為0.5%硼氫化鉀+0.5%氫氧化鉀的混合溶液。

1.3.5 含汞量結(jié)果計算

根據(jù)《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》（GB 5009.17-2021）[24]中的原子熒光光譜分析法可知，總汞含量（X，mg·kg-1）計算公式為：

式中：ρ為試驗溶液中總汞含量（μg·L-1）；ρ0為空白液中總汞含量（μg·L-1）；V為試樣消解液定容總體積（mL）；m為試樣稱樣量（g）。

1.3.6 不確定度計算及分析

1）標準不確定度：選擇影響測定結(jié)果準確性的關(guān)鍵技術(shù)進行針對性分析，計算各技術(shù)點的標準不確定度。

2）合成標準不確定度：以各個關(guān)鍵技術(shù)的標準不確定度為基礎，計算并綜合分析合成標準不確定度。

3） 擴展不確定度：以合成標準不確定度為基礎，計算得到擴展不確定度。

4）準確度評價：最終以擴展不確定度評定試驗關(guān)鍵技術(shù)的影響，確定食用菌總汞含量測定的準確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵試驗技術(shù)分析

根據(jù)汞含量測定的試驗步驟及結(jié)果計算方法，重點對試樣稱量、試液定容體積、標準液中汞的含量、測量重復性和回收率試驗5個影響結(jié)果準確度的試驗關(guān)鍵技術(shù)點進行分析評定。這5個關(guān)鍵技術(shù)點的相對標準不確定度分別為：1）試樣質(zhì)量稱量的相對標準不確定度[urel（m）]；2）試樣消解液的定容體積相對標準不確定度[urel（V）]；3）試驗溶液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ）]；4）測量重復性的相對標準不確定度[urel（x）]；5）回收率隨機差異的相對標準不確定度[urel（R）]。對這5個標準不確定度進行綜合分析，確定影響測量結(jié)果的合成標準不確定度（u），即可計算整個檢測試驗的擴展不確定度（U），從而對試驗及測量結(jié)果進行準確度評價。

2.2 5個關(guān)鍵試驗技術(shù)點的影響評價

2.2.1 試樣質(zhì)量稱量影響評價

以試樣質(zhì)量稱量的相對標準不確定度[urel（m）]對試樣質(zhì)量稱量的準確度進行評價，考慮的不確定度分量包括電子天平檢定的不確定度 [u（m檢）]和稱量重復性的不確定度 [u（m重）]。

電子天平檢定不確定度 [u（m檢），g]計算公式為：

式中：a為區(qū)間半寬度（g）；k為包含因子。

查核試樣稱量時所用電子天平的檢定證書可知，當載荷為0≤m≤50 g時，其檢定結(jié)果的示值誤差為±0.000 2 g；按矩形分布處理，k??；代入公式（2） 進行計算，u（m檢） 為0.000 115 g。

稱量重復性的不確定度 [u（m重），g]計算公式為：

式中：s為標準偏差（g）；n為稱量重復次數(shù)（次）。

取同一試樣重復稱量10次（n=10），試樣質(zhì)量平均值為0.207 1 g；用貝塞爾公式法計算，得到試驗標準偏差s為0.004 97 g；代入公式（3） 進行計算，u（m重） 為 0.001 57 g。

試樣質(zhì)量稱量的相對標準不確定度[urel（m）]計算公式為：

式中：u（m檢）為電子天平檢定的不確定度（g）；u（m重）為稱量重復性的不確定度；m為樣品質(zhì)量（g）。

將公式（2）、公式（3） 計算所得的數(shù)據(jù)代入公式（4）進行計算，最終獲得試樣質(zhì)量稱量的相對標準不確定度urel（m）為0.007 60。

2.2.2 試樣消解液定容體積影響評價

試樣消解液的定容體積相對標準不確定度[urel（V）]主要受3個因素的影響，包括定容所用容量瓶容量允差引入的不確定度 [u（V差）]、定容溶劑因溫差產(chǎn)生體積膨脹引入的不確定度 [u（V溫）]以及定容重復性的不確定度 [u（V重）]。

消解液定容所用容量瓶容量允差引入的不確定度 [u（V差），mL]計算公式為：

式中：a為最大容量允差（mL）；k為包含因子。

計算u（V差）時，按照三角形分布處理，k取，代入數(shù)值可得u（V差） 為0.012 20。

定容溶劑因溫差產(chǎn)生的體積膨脹（環(huán)境溫度為24℃時） 引入的不確定度 [u（V溫），mL]計算公式為：

式中：V為移取體積（mL）；C為水的體積膨脹系數(shù)，即2.1×10-4℃-1；T為實驗室溫差（℃）；k為包含因子。

計算u（V溫）時，按照均勻分布處理，k取,代入數(shù)值可得u（V溫） 為0.003 20。

定容重復性不確定度[u（V重），mL]計算公式為：

式中：s（V） 為定容的標準偏差（mL）；n為定容重復次數(shù)（次）。

共重復定容了10次，即n=10，代入數(shù)值計算可得 u（V重） 為 0.012 100。

綜合3個貢獻因子，試樣消解液的定容體積相對標準不確定度[urel（V）]計算公式為：

式中：u（V差） 為定容體積誤差的不確定度（mL）；u（V溫）為定容溶劑因溫差產(chǎn)生的體積膨脹的不確定度（mL）；u（V重） 為定容重復性不確定度（mL）；V定為定容體積（mL），在制備消解液時其值為25 mL。

將公式（5） ～公式（7） 的數(shù)據(jù)代入公式（8）進行計算，urel（V）為0.000 700。

2.2.3 試驗溶液中汞的濃度影響評價

試驗溶液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ）]主要受2個因素影響：汞標準工作液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ1）]；標準曲線擬合熒光值隨機變異獲得汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ2）]。這2個因素又分別受多個因素影響，具體如下。

1） 汞標準工作液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ1）]

分析汞標準工作液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ1）]需要考慮多個因素，包括汞標準溶液純度的相對標準不確定度[urel（C0）]，以及工作液制備中使用的各器皿定容體積相對標準不確定度[urel（V）]。

汞標準溶液純度引入的相對標準不確定度[urel（C0）]計算公式為：

式中：U為汞標準溶液相對擴展不確定度；k為包含因子。

查標準物質(zhì)證書可得，汞標準溶液相對擴展不確定度U為1%，k為2。代入公式（9） 進行計算，urel（C0）=0.005。

汞標準工作液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ1）]計算公式為：

式中：urel（C0）為汞標準溶液純度的相對標準不確定度；urel（V10）、urel（V50）、urel（V100）、urel（V1）分別為10 mL容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶和1 mL單標線吸量管的定容體積的相對標準不確定度，計算公式為公式 （8）；n1、n2、n3、n4分別為 10 mL 容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶和1 mL單標線吸量管的數(shù)量（個）。

根據(jù)公式（5） ～公式（8），計算汞標準溶液梯度稀釋過程中各容器允差、定容溫度以及定容重復性引入的不確定度，結(jié)果見表3。

表3 汞標準溶液梯度稀釋定容體積引入的不確定度Tab.3 Uncertainty introduced by gradient dilution volume of mercury standard solution

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，代入公式（10）進行計算，urel（ρ1）為0.008 36。

2）標準曲線擬合熒光值隨機變異的汞含量[urel（ρ2）]

為確定熒光值隨機變異引入的不確定度，將配制好的標準系列溶液進行原子熒光光度計檢測，將相應的熒光值（Y）采用線性最小二乘法進行擬合，得到擬合曲線的線性回歸方程為：

該回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 6。

該標準曲線的標準差 [s（Y）]計算公式為：

式中：Yi為第i次測量的熒光值；a為截距，其值為61.327 1；b為斜率，其值為3 394.457 9；Ci為第i次測量對應的質(zhì)量濃度（ng·mL-1）；n為標準溶液測定的總次數(shù)（次），測量6個校準標準溶液樣品，每個濃度測3次，即n=18。

標準曲線擬合得到汞的質(zhì)量濃度不確定度[u（ρ2），ng·mL-1]計算公式為：

式中：s（Y）為標準曲線的標準差；P為樣品測定次數(shù)（次），其值為10；n為標準溶液測定的總次數(shù)（次），測量6個校準標準溶液，每個濃度測3次，即n=18；Ci為第i次測量對應標準曲線上的質(zhì)量濃度（ng·mL-1）；為試樣溶液中汞含量的平均值（ng·mL-1）；為標準系列溶液中汞含量的平均值（ng·mL-1）。

標準曲線擬合熒光值隨機變異獲得汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ2）]計算公式為：

式中：u（ρ2）為標準曲線擬合得到汞的質(zhì)量濃度不確定度（ng·mL-1）；為試樣溶液中汞含量的平均值，其值為 1.567 5 ng·mL-1。

將數(shù)值代入公式（14）進行計算，urel（ρ2）為0.003 37。

3）試驗溶液中汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ）]

綜上所述，測試液校準試驗過程中試驗溶液汞的質(zhì)量濃度相對標準不確定度[urel（ρ）]計算公式為：

式中：urel（ρ1）為汞標準工作液中的汞含量相對標準不確定度；urel（ρ2）為標準曲線擬合熒光值隨機變異獲得的汞含量相對標準不確定度。

將2個因數(shù)的數(shù)據(jù)代入公式（15） 進行計算，urel（ρ）為0.009 01。

2.2.4 測量重復性（隨機差異）影響評價

式中：sx為標準偏差；n為獨立重復測試次數(shù)（次）；為平均值。

按照1.3.2，取香菇粉消解液試樣（測試液）獨立重復測試10次，計算平均值及標準偏差，測量結(jié)果見表4。

表4 香菇粉中總汞含量試樣數(shù)據(jù)Tab.4 Sample data of total mercury content in Lentinus edodes powder

根據(jù)表4數(shù)據(jù)，將平均值和標準偏差數(shù)值代入公式（16）進行計算，urel（）為0.006 67。

2.2.5 回收率的隨機差異影響評價

回收率試驗即向試樣中加入已知量的被測組分，然后進行測定，檢查被加入的組分能否定量回收，以判斷分析過程是否存在系統(tǒng)誤差。

回收率的隨機差異引入的不確定度[urel（R）]計算公式為：

通過回收率重復性試驗，計算平均回收率及標準偏差，結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗結(jié)果Tab.5 Results of recovery test

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，將平均值和標準偏差數(shù)值代入公式（17）進行計算，urel（R）為0.011 1。

2.3 各關(guān)鍵影響因素綜合評價

2.3.1 相對標準不確定度（urel）

綜上，相對標準不確定度（urel）計算公式為：

式中：urel（m）為試樣質(zhì)量稱量的相對標準不確定度；urel（V）為試液的定容體積相對標準不確定度；urel（ρ）為試樣溶液濃度的相對標準不確定度；urel（x）為測量重復性的相對標準不確定度；urel（R）為回收率隨機差異的相對標準不確定度。

從2.2中可知，菇粉總汞測定過程中各因素的相對標準不確定度分別為：urel（m）=0.007 60；urel（V）=0.000700；urel（ρ）=0.00901；urel（）=0.00667；urel（R）=0.0111。將各數(shù)據(jù)代入公式（18）進行計算，得到合成相對標準不確定度urel為0.017 5。

對5個因素的貢獻率進行分析，結(jié)果詳見圖1。

圖1 各貢獻因子相對不確定度貢獻率Fig.1 Contribution rate of relative uncertainty of each contribution factor

如圖1所示，urel（R）的貢獻率最高，即回收率試驗是影響結(jié)果準確的主要因素；之后依次為urel（ρ）、urel（m）和urel（），分析可知測試濃度和校正曲線的影響同樣較大。

2.3.2 合成標準不確定度（u）

香菇粉中總汞測定過程各貢獻因子引入的合成標準不確定度（u） 計算公式為：

式中：urel為合成相對標準不確定度；為總汞含量（mg·kg-1）。

將數(shù)據(jù)代入公式（19） 進行計算，可得總汞測定過程中合成標準不確定度u為0.003 31 mg·kg-1。

2.4 擴展不確定度（U）評價

擴展不確定度（U）計算公式為：

式中：k為包含因子（取置信區(qū)間95%，k=2）

香菇粉中總汞含量（X，mg·kg-1）計算公式為：

代入數(shù)值，計算可得擴展不確定度U為0.006 6 mg·kg-1。即香菇粉中總汞含量的檢定結(jié)果為（0.189 0±0.006 6） mg·kg-1，符合證書規(guī)定值，檢測準確度高。

3 結(jié)論與討論

測量不確定度是考慮到各種因素對測量的影響所做的修正，是對測量過程是否持續(xù)受控，測量結(jié)果是否能保持穩(wěn)定一致的統(tǒng)計控制衡量方法。本研究中使用微波消解-原子熒光法測定香菇粉中的總汞含量為 （0.189 0±0.006 6） mg·kg-1（k=2），在證書規(guī)定的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果準確、可信。在測量過程和所使用的設備無變化情況下，該不確定度估計值可應用于今后實驗室總汞的結(jié)果判定和運用，也是數(shù)據(jù)溯源依據(jù)。

通過對各相對標準不確定度貢獻因子進行分析，測試液濃度、校正曲線和回收率檢測試驗是總汞結(jié)果準確性的最主要影響因素。可以通過調(diào)整標準曲線濃度范圍，從而有效降低不確定度，對準確測量食用菌中總汞含量具有一定的意義。同時檢測過程中應注意環(huán)境條件的準確控制，人員試驗操作水平的持續(xù)穩(wěn)定和規(guī)范，必要時增加標準不確定度的自由度，減小各貢獻因子的隨機差異和系統(tǒng)影響，提高檢測水平及可信度。