熊 薇，黃美霞，魏林婕，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學 藥學院，福建 福州 350122）

蛹蟲草（Cordyceps militaris Link）又名北冬蟲夏草、北蟲草，屬真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota） 子囊菌綱（Ascomycetes） 肉座菌目（Hypocreales） 麥角菌科 （Clavicipitaceae） 蟲草屬 （Cordyceps）模式種[1]。蛹蟲草具有與冬蟲夏草相似的活性成分，包括蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、氨基酸、超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase） 等，而且相比于冬蟲夏草，蛹蟲草價格更親民，因此被用作冬蟲夏草的替代品進行開發(fā)利用[2]。近年來，關(guān)于蛹蟲草子實體產(chǎn)量優(yōu)化和活性成分含量優(yōu)化方面的研究已獲得一些成果，但這些研究的重點都聚焦于子實體[3]。菌質(zhì)是指包含菌絲和培養(yǎng)基質(zhì)的復合固體發(fā)酵產(chǎn)物。有報道指出，固體發(fā)酵的蛹蟲草殘基中也含有蟲草多糖、蟲草素、SOD、多肽等有效成分[4]。因此試驗直接以菌質(zhì)為研究對象，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期縮短發(fā)酵周期，提高有效成分含量，有效節(jié)約成本。

蟲草素最早于1951年由德國科學家Cunningham等[5]從蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分離得到，又稱3’-脫氧核苷 (3-deoxyadenosine)，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗焦慮、降血糖、降血脂等藥理作用[6]。蟲草素在蛹蟲草中的含量甚至高于冬蟲夏草[7]，因此試驗以蟲草素含量為評價指標，對菌質(zhì)發(fā)酵時間和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為后期發(fā)酵菌質(zhì)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌株MF43，由福建農(nóng)林大學傅俊生課題組惠贈。

小麥和土豆均為市購；蟲草素（批號N1017AS，質(zhì)量分數(shù)≥98%），大連美侖生物技術(shù)有限公司；腺苷（批號N24D11W135689，質(zhì)量分數(shù)≥99%）、蔗糖（批號A25GS146834，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、麥芽糖（批號A02GS143905，質(zhì)量分數(shù)≥95%）、黃豆粉（批號S24F12H139852，粉質(zhì)粗細為80目～120目）、可溶性淀粉（批號A16GS145576）、維生素B1（批號D16N11S131243，質(zhì)量分數(shù)≥98%），上海源葉生物科技有限公司；酵母粉（批號2846115-02）、蛋白胨（批號2896804），OXOID公司；發(fā)酵用蠶蛹粉（水溶性，批號430H031），北京索萊寶科技有限公司；無水葡萄糖（批號20141008）、磷酸二氫鉀（批號20200915）、無水硫酸鎂（批號20140122），國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（批號I1140207111，質(zhì)量分數(shù)≤100%），默克股份兩合公司。

1.2 儀器

TDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠；全自動超聲波清洗機，湖北鼎泰恒勝科技設備有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；HPX-300BSH-III恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MGC-300H人工氣候箱，上海一恒科學儀器有限公司；ClassⅡType A2型生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；ZHWY-2112B全溫型大容量恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 菌懸液制備

從PDA斜面培養(yǎng)基中挑出0.5 cm×0.5 cm大小的母種菌塊，接種到PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿備用。取0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊接種到PD培養(yǎng)基中，在23℃、140 r·min-1條件下培養(yǎng)4 d～7 d，制成液體菌種。取5 mL液體菌種，加入30 mL無菌水混勻，制成菌懸液。

1.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)制備

稱取15 g小麥置于240 mL培養(yǎng)罐中（以下試驗均采用該規(guī)格培養(yǎng)罐），用蒸餾水浸泡1 h后濾去水分。按1.0∶1.2的比例加入營養(yǎng)液（每升營養(yǎng)液的配方為：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、VB 10.5 g），用聚丙烯透氣蓋封口，121℃滅菌30 min。在培養(yǎng)罐中接入3 mL菌懸液；在溫度為18℃、相對濕度為60%、黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中，在溫度為20℃、相對濕度為80%～90%、光照時間為10 h～12 h條件下培養(yǎng)至第15天取出干燥。

1.5 蟲草素含量測定

1.5.1 樣品制備

取發(fā)酵15 d的菌質(zhì)，60℃烘干，粉碎。準確稱取粉末1.0 g，加20 mL超純水進行超聲提取。提取時間為45 min，提取溫度為45℃。抽濾后，取濾液1 mL加入甲醇定容至5 mL，靜置，過0.22微孔濾膜后得到待測液。

1.5.2 標準品制備

精密稱取蟲草素1 mg置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，制成標準品貯備液。

1.5.3 高效液相色譜（HPLC）方法學建立

色譜條件：色譜柱型號為Welch Ultimate XBC18柱（4.6×150 mm，粒徑為5 μm）；流動相為V（甲醇） ∶V （水） =16∶84，流速為 1 mL·min-1，檢測波長為260 nm，進樣量為5 μL，溫度為30℃。取標準品貯備液，稀釋蟲草素質(zhì)量濃度分別為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1、14 μg·mL-1、16 μg·mL-1、18 μg·mL-1、20 μg·mL-1，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積。以蟲草素標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制得到標準曲線。

1.5.4 HPLC方法學驗證

1） 精密度試驗：取對照品 4 μg·mL-1、8 μg·mL-1和16 μg·mL-13個質(zhì)量濃度溶液，按上述色譜條件每個質(zhì)量濃度溶液連續(xù)測定3次，記錄峰面積。

2）重復性試驗：供試品溶液各取6份，按上述色譜條件每份連續(xù)測定3次，計算含量。

3） 穩(wěn)定性試驗：同一批樣品取3份，制備溶液，分別于0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h進樣，測定蟲草素峰面積。

1.6 單因素試驗篩選

1.6.1 碳源單因素試驗

以1.4中的營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，其他成分不變，分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉替換葡萄糖作為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標準，篩選最適碳源。

1.6.2 氮源單因素試驗

以1.4中的營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，其他成分不變，分別用蠶蛹粉、酵母粉、黃豆粉替換蛋白胨作為氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標準，以確定最適氮源。

1.6.3 料液比單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，設置不同料液比 （1.0∶1.0、1.0∶1.1、1.0∶1.2、1.0∶1.3、1.0∶1.4）進行培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標準，選擇最適料液比。

1.6.4 小麥裝料量單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，將小麥裝料量設置為9 g、12 g、15 g、18 g和21 g進行培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標準，確定最合適的小麥裝料量。

1.6.5 接種量單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，將菌懸液接種量設置為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL進行培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標準，以確定最合適的接種量。

1.6.6 培養(yǎng)時間單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，培養(yǎng)時間分別為 0、5 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d、21 d、23 d、25 d、27 d、29 d、31 d、33 d、35 d、37 d、39 d、41 d、43 d、45 d、47 d、49 d時取樣，以蟲草素含量為檢測標準，以明確蟲草素含量最高的時間。

1.6.7 腺苷質(zhì)量濃度單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，在營養(yǎng)液中加入質(zhì)量濃度分別為 6 g·L-1、12 g·L-1、24 g·L-1、48 g·L-1、96 g·L-1的腺苷，以蟲草素含量為檢測標準，以確定最合適的腺苷質(zhì)量濃度。

1.7 響應面優(yōu)化

在單因素篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行3因素3水平響應面法優(yōu)化。以上每個試驗重復3次。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設置碳源為可溶性淀粉、氮源為黃豆粉、小麥裝料量為15g、培養(yǎng)時間為17d為固定條件，選擇料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度3個因素進行響應面優(yōu)化試驗，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Tab.1 Response surface experiment factor level table

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品圖譜與樣品圖譜

以蟲草素標準品及樣品濃度為橫坐標，以對應色譜峰面積為縱坐標，繪制得到曲線詳見圖1。

如圖1所示，供試品溶液色譜圖中蟲草素的保留時間與標準品溶液色譜圖一致，說明樣品中含有蟲草素這一成分。

圖1 標準品（A） 與樣品（B） HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of standard (A)and sample (B)

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

利用HPLC在1.5.3色譜條件下對不同濃度標準品溶液進行測定，以峰面積（Y）對各質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，得蟲草素標準液線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999。

結(jié)果表明，蟲草素的質(zhì)量濃度在2 μg·mL-1～20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗結(jié)果

對標準品進行精密度試驗，測得蟲草素峰面積的相對標準偏差RSD（relative standard deviation） 為0.54%，表明儀器精密度良好，符合試驗要求。

2.2.3 重復性試驗結(jié)果

對樣品進行重復性試驗，測得蛹蟲草菌質(zhì)中蟲草素峰面積的RSD為0.85%，表明方法的重復性良好，符合試驗要求。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

對樣品進行穩(wěn)定性試驗，測得蛹蟲草菌質(zhì)中蟲草素峰面積的RSD為1.60%，表明供試品溶液中蟲草素在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 碳源篩選

使用不同碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，以葡萄糖組為對照，分析不同碳源對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響，詳見圖2。

根據(jù)圖2結(jié)果可知，不同碳源對菌質(zhì)蟲草素含量影響顯著（P<0.05）。其中碳源為可溶性淀粉時，菌質(zhì)中蟲草素含量最高，達0.98 mg·g-1。因此選擇可溶性淀粉作為后續(xù)試驗的碳源。

圖2 碳源對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.2 Effect of carbon source on the content of fungal substance

2.3.2 氮源篩選

以蛋白胨組為對照，分析不同氮源對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況，詳見圖3。

圖3 氮源對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the content of fungal substance

根據(jù)圖3結(jié)果可知，不同氮源對菌質(zhì)蟲草素含量影響顯著（P<0.05）。當?shù)礊辄S豆粉時，菌質(zhì)中蟲草素含量最高，達1 mg·g-1；當?shù)礊榻湍阜蹠r，菌質(zhì)中蟲草素含量最低。因此選擇黃豆粉作為后續(xù)試驗的氮源。

2.3.3 料液比篩選

以料液比為1.0∶1.2組為對照，不同料液比對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況，詳見圖4。

圖4 料液比對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the content of fungal substance

根據(jù)圖4結(jié)果可知，不同料液比對菌質(zhì)蟲草素含量也具有一定影響（P<0.05），可作為響應面考察因素。當料液比為1.0∶1.2時，菌質(zhì)蟲草素含量最高，達0.68 mg·g-1，因此選擇料液比1.0∶1.2進行后續(xù)試驗。

2.3.4 小麥裝料量篩選

以小麥裝料量為15 g組為對照，不同小麥裝料量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響情況，詳見圖5。

圖5 小麥裝料量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.5 Effect of wheat charge amount on the content of fungal substance

根據(jù)圖5結(jié)果可知，不同小麥裝料量對菌質(zhì)蟲草素含量有影響（P<0.05）。當小麥裝料量為15 g時，菌質(zhì)中蟲草素含量最高，達0.68 mg·g-1；當小麥裝料量為18 g時，菌質(zhì)蟲草素含量有所降低；當小麥裝料量增加到21 g時含量又有所提高，然而并未超過15 g時的蟲草素含量。因此，從經(jīng)濟適用角度考慮，以小麥裝料量為15 g進行后續(xù)試驗較為合理。

2.3.5 接種量篩選

以接入3 mL菌懸液組為對照，不同菌懸液接種量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響情況，詳見圖6。

圖6 接種量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.6 The effect of inoculum amount on the content of fungal substance

根據(jù)圖6結(jié)果可知，菌懸液接種量對菌質(zhì)中蟲草素含量影響顯著（P<0.05）。當接種量為2 mL時，菌質(zhì)蟲草素含量最高，達0.89 mg·g-1；當接種量為3 mL時，菌質(zhì)蟲草素含量降低；而后蟲草素含量隨接種量的增加而增加，但均未超過2 mL時的含量。因此，從經(jīng)濟適用角度考慮，選擇接種量為2 mL進行后續(xù)試驗較為合理。由于接種量在1 mL～3 mL時差異顯著，因此可將此因素選作響應面考察因素。

2.3.6 培養(yǎng)時間篩選

不同培養(yǎng)時間對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況詳見圖7。

圖7 培養(yǎng)時間對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.7 The effect of culture time on the content of fungal substance

根據(jù)圖7結(jié)果可知，培養(yǎng)時間對菌質(zhì)中蟲草素含量影響顯著（P<0.05），蟲草素含量先隨培養(yǎng)時間的增加而增加，到臨界點后數(shù)值維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。0～5 d時，是菌絲長滿培養(yǎng)基的階段，生長較緩慢，因此蟲草素積累也較緩慢；10 d左右菌絲長滿，且由黑暗培養(yǎng)轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蟲草素的含量隨著培養(yǎng)時間延長快速積累；在17 d時達到峰值，而后增長緩慢。這一現(xiàn)象與Wen[8]和胡龍[9]的報道相似，說明培養(yǎng)基中蟲草素累積到一定量后，延長培養(yǎng)時間對其含量影響不大。

2.3.7 腺苷質(zhì)量濃度篩選

添加不同質(zhì)量濃度的腺苷對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況詳見表8。

根據(jù)圖8結(jié)果可知，腺苷對菌質(zhì)中蟲草素含量影響顯著（P<0.05），可作為響應面考察因素。腺苷是蟲草素的前體化合物，添加腺苷有助于蟲草素的積累。當腺苷質(zhì)量濃度達到48 g·L-1時，菌質(zhì)中蟲草素積累最多，達到4.06 mg·g-1；與不添加腺苷的相比，蟲草素含量增加了4.97倍。

圖8 腺苷質(zhì)量濃度對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.8 Effects of adenosine mass concentration on substance content in mycoplasma

2.4 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)試驗設計方案，選取料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度作為自變量，以蟲草素含量作為響應面值設計響應面試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗結(jié)果Tab.2 Results of response surface experiment

根據(jù)表2響應面試驗結(jié)果，采用Design-Expert 10.0.7對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到蛹蟲草菌質(zhì)蟲草素含量（Y） 與料液比（A）、接種量（B）、腺苷濃度（C）的二次項多元回歸方程為：

該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.983 9。

對上述方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可知，該回歸模型極顯著（P<0.0001），失擬項不顯著（P>0.05），說明該模型成立。相關(guān)系數(shù)R2為0.983 9，說明模型擬合程度較好。R2Adj為0.963 2，R2Pre為0.879 9，二者差值小于0.2，說明試驗誤差小，方法可靠。模型中變量A、B、C、A2、B2、C2的P值均小于0.01，各因素對蟲草素含量的影響依次為C>B>A。

表3 試驗結(jié)果方差分析Tab.3 Analysis of variance of experimental results

2.4.1 響應面圖形分析

依據(jù)擬合的響應曲面形狀，研究不同料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度對蟲草素含量的影響。分別將料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度以0水平固定在模型中，從而獲得另外2個因素的交互影響結(jié)果。二次回歸方程的響應面及其等高線見圖9～圖11。

由圖9～圖 11可知，料液比 （A） 與接種量（B）、料液比（A） 與腺苷質(zhì)量濃度（C）、接種量（B）與腺苷質(zhì)量濃度（C） 之間均對蟲草素含量變化有一定交互作用，但作用不顯著。

圖9 料液比與接種量交互作用的等高線與響應面Fig.9 Contour line and response surface of interaction between solid-liquid ratio and inoculum amount

圖10 料液比與腺苷質(zhì)量濃度交互作用的等高線與響應面Fig.10 Contours and response surfaces of the interaction of solid-liquid ratio and adenosines mass concentration

圖11 接種量與腺苷質(zhì)量濃度交互作用的等高線與響應面Fig.11 Contours and response surfaces of the interaction between inoculum amount and adenosine mass concentration

2.4.2 最佳條件的預測及驗證試驗

通過Design-Expert 10.0.7軟件，預測蟲草素含量最高的發(fā)酵工藝條件為：料液比為1.000∶1.295、接種量為2.257 mL、腺苷質(zhì)量濃度為75.534 g·L-1，此時蟲草素含量為3.596 mg·g-1。結(jié)合實際操作情況，將最佳發(fā)酵工藝修正為：料液比為1.0∶1.3、接種量為2 mL、腺苷質(zhì)量濃度為76 g·L-1，在此條件下重復5次，得到蟲草素含量平均為3.718 mg·g-1，與預測值相對誤差小于5%。表明該方程與實際情況擬合良好，相應優(yōu)化模型真實可行，與優(yōu)化前相比，蟲草素含量提高了4.47倍，具有指導生產(chǎn)的實用價值。

3 結(jié)論與討論

在傳統(tǒng)工序中，蟲草素的主要來源是野生蛹蟲草子實體，然而野生蛹蟲草資源有限，因此多項研究對人工栽培蛹蟲草進行了嘗試。通過優(yōu)化栽培基質(zhì)和培養(yǎng)條件，提高子實體中蟲草素含量，該方法雖然能夠有效提高蟲草素含量，但發(fā)酵時間較長。近年來有學者對菌質(zhì)進行了檢測，發(fā)現(xiàn)菌質(zhì)中也含有蟲草素。因此可以直接對菌質(zhì)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以縮短培養(yǎng)周期。

試驗對發(fā)酵菌質(zhì)的碳源、氮源、料液比、接種量、小麥裝料量、培養(yǎng)時間、腺苷添加的質(zhì)量濃度進行了單因素分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，碳源為可溶性淀粉時，蟲草素含量較高。這是由于淀粉是大分子碳源，菌絲體不易吸收，因此生長緩慢，給次級代謝產(chǎn)物蟲草素的合成提供了足夠的時間。當?shù)礊辄S豆粉時，蟲草素含量較高。這一現(xiàn)象提示植物蛋白也可作為氮源，促進菌絲體生長，且效果更佳。料液比、接種量、小麥裝料量的結(jié)果揭示了菌絲的生長需要水分、一定的菌種量和基本營養(yǎng)物，但并不是越多越好。因為過多的水分和培養(yǎng)料會影響基質(zhì)整體的透氣性，從而影響菌絲體生長。接種后0～5 d，菌絲處于有絲分裂階段，此時蟲草素的積累較緩慢，處于較低水平；菌絲長滿基質(zhì)后，蟲草素的積累量迅速增加，持續(xù)一段時間后處于相對穩(wěn)定的水平。為縮短培養(yǎng)周期，在蟲草素積累達到峰值時即可停止發(fā)酵。腺苷是合成蟲草素的前體化合物，適量的增加腺苷有助于蟲草素的合成。但試驗中由于添加腺苷的質(zhì)量濃度跨越較大，檢測時發(fā)現(xiàn)存在大量腺苷質(zhì)量未轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，損耗較大。因此實際應用時需斟酌腺苷添加量。

將單因素篩選的結(jié)果用響應面法進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)料液比、接種量和腺苷質(zhì)量濃度三者對蟲草素含量的影響均顯著，然而交互作用影響均不顯著。這可能是由于腺苷質(zhì)量濃度梯度過大，導致其對蟲草素含量的影響與另外兩個因素不在一個水平上。因此在后續(xù)試驗中，可對該因素進行調(diào)整，確保增加蟲草素積累的同時減少腺苷的損耗。