楊珍福，劉紹雄，華 蓉，孫達(dá)鋒，尚陸娥，馬 明，馮云利，和 勇，李建英**

（1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221）

冬蟲夏草是世界聞名的名貴中藥材，藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值巨大，但野生冬蟲夏草生長(zhǎng)條件苛刻，自然寄生率低，加上人們的濫采，導(dǎo)致天然資源緊缺，價(jià)格昂貴[1]。因此，代用品的開(kāi)發(fā)成為必然趨勢(shì)。目前，蟲草的種類繁多，是子囊菌中多樣性較高的類群之一，全世界已報(bào)道的種有近千個(gè)[2]?，F(xiàn)代藥理藥化研究發(fā)現(xiàn)，不同蟲草種類所含成分千差萬(wàn)別，其功效也各有不同[3]。因此調(diào)查和研究中國(guó)蟲草資源以及如何合理利用眾多的蟲草資源不僅有重要的理論研究意義，而且也具有極其珍貴的應(yīng)用價(jià)值。蟲草素和N6-（2-羥乙基）腺嘌呤核苷（HEA）是冬蟲夏草中非常重要的生物活性物質(zhì)，而粉被蟲草是蟲草素和HEA的良好來(lái)源，可以作為冬蟲夏草的替代品[4]。

粉被蟲草（Cordyceps pruinosa Petch），又名繭草、繭蟲草，常寄生于多種鱗翅目昆蟲的蛹繭上，是著名真菌學(xué)家Petch在1924年發(fā)現(xiàn)及命名的，其無(wú)性型新種—粉被馬利亞霉（Mariannaea pruinosa）由我國(guó)學(xué)者梁宗琦確證、鑒定和命名[5-8]?，F(xiàn)有報(bào)道中粉被蟲草主要分布于我國(guó)貴州、浙江、江西、福建、湖北、廣東、吉林、遼寧、臺(tái)灣等省[7-10]。試驗(yàn)證實(shí)，粉被蟲草具鈣離子拮抗、抗紫外線輻射損害、抑制細(xì)菌、抗炎、抗腫瘤、抗巨噬細(xì)胞吞噬和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等生物活性[11-17]。由此可見(jiàn)，粉被蟲草是一種具有廣泛生物學(xué)活性、可作為冬蟲夏草替代品，且具有較高利用價(jià)值、較大開(kāi)發(fā)前景的蟲草資源。

云南是冬蟲夏草的主產(chǎn)區(qū)之一，近些年來(lái)由于過(guò)度采挖，野生冬蟲夏草資源緊缺，因此尋找和選育出可更好地替代冬蟲夏草的蟲草菌種，以保護(hù)蟲草資源多樣性和日益枯竭的冬蟲夏草資源就顯得尤為重要。本研究中，在云南采集到一株野生粉被蟲草，對(duì)其無(wú)性型進(jìn)行了分離培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)特性和馴化栽培進(jìn)行初步研究，以期為該菌的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

野生蟲草子實(shí)體采集自云南省昆明市西山（101°25′59″E，24°59′27″N），保存于中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂18 g，水1 000 mL。

PDA液體綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g，水1 000 mL，pH自然。

大米培養(yǎng)基：20 g大米加入40 mL營(yíng)養(yǎng)液。

小麥培養(yǎng)基：20 g小麥加入40 mL營(yíng)養(yǎng)液。

營(yíng)養(yǎng)液：葡萄糖 10 g·L-1、蛋白胨 10 g·L-1、酵母粉 10 g·L-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株子實(shí)體形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)野生蟲草進(jìn)行宏觀和顯微形態(tài)特征觀察，參照參考文獻(xiàn)[6，8，9]進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng)

對(duì)野生蟲草子實(shí)體進(jìn)行組織分離。選擇完整的蟲草，用清水清洗表面，再用75%酒精浸泡1 min左右，然后用無(wú)菌水沖洗并擦干。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)子座頂端部分，用鑷子夾取2 mm～4 mm組織塊，接于PDA培養(yǎng)基斜面，置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑取無(wú)污染的菌絲，反復(fù)純化，將純化后菌株接種到察氏培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)及菌絲顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)學(xué)鑒定

取待鑒定菌絲體，液氮研磨后用TaKaRa生物有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA基因組的提取，DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。采用上海生工生物工程技術(shù)公司合成的通用引物ITS1和ITS4，參照參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物檢測(cè)后送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA 6.0軟件采用鄰接法NJ（Neighbor-joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

以加20 g葡萄糖的PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，其他處理分別用等量的麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、果糖、可溶性淀粉替代葡萄糖作為碳源。用已滅菌的直徑5 mm打孔器均勻截取活化好的菌絲塊接種，常溫培養(yǎng)，每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

在PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2 g的蛋白胨、酵母粉、尿素、氯化銨、酒石酸銨、過(guò)硫酸銨、玉米粉作為氮源。其余操作同1.2.4。

1.2.6 粉被蟲草出菇培養(yǎng)

挑取一定量的菌絲接入PDA液體綜合培養(yǎng)基，在25℃震蕩培養(yǎng)7 d，得到液體菌種。然后取10 mL液體菌種分別接入大米和小麥培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)10個(gè)重復(fù)。25℃黑暗培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面后進(jìn)行光照培養(yǎng)。觀察記錄子實(shí)體出菇情況。

1.3 生長(zhǎng)速度測(cè)定

采用“十”字交叉法測(cè)定菌落直徑，記錄各菌株生長(zhǎng)情況，計(jì)算菌絲體每天平均生長(zhǎng)速度。

菌絲體生長(zhǎng)速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

V=S/D

式中：S為菌絲長(zhǎng)度（mm）；D為菌絲生長(zhǎng)天數(shù)（d）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生子實(shí)體和菌絲體的鑒定

子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 粉被蟲草有性型Fig.1 The teleomorph of Cordyceps pruinosa

如圖1所示，野生子實(shí)體（圖1A）子座出自昆蟲蛹繭殼上，多個(gè)，長(zhǎng)度為3 cm～5 cm；柄稍彎曲，基部有白色菌絲體；頭部棒狀，頂端尖，橘紅色；子囊殼（圖1B） 表生，長(zhǎng)卵圓形；子囊柱狀（圖1C），囊孢子比子囊稍短，線形，可斷裂形成分孢子。上述特征符合粉被蟲草的特征描述，初步確定其為粉被蟲草。

將反復(fù)純化培養(yǎng)獲得的菌株命名為ZJJZ494，保存于中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所。菌株形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

圖2 粉被蟲草無(wú)性型菌株形態(tài)Fig.2 The characteristics and microscopic features of Cordyceps pruinosa

如圖2所示，菌株ZJJZ494在察氏培養(yǎng)基上菌落平展呈絨毛狀有輪紋，培養(yǎng)初期（圖2A），菌落中心呈白色、略微突起，中間為橘黃色至黃色，最邊緣呈白色；培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后，菌落邊緣呈白色，中間部分全為橘黃色至黃色；形成指狀可分叉的孢梗束。分生孢子梗單生、對(duì)生或輪狀分枝。產(chǎn)孢細(xì)胞瘦長(zhǎng)錐形，分生孢子透明、光滑，卵圓形或柱狀（圖2B），典型的疊瓦狀排列。上述特征與粉被蟲草的無(wú)性型粉被瑪利亞霉的描述一致，因此可以鑒定該菌株為粉被瑪利亞霉。

2.2 菌絲體分子生物學(xué)分析結(jié)果

對(duì)測(cè)序后得到的菌株ZJJZ494菌絲體的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，菌株ZJJZ494的ITS序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為 MT012347、AY491995等多個(gè)粉被蟲草菌株的同源性都達(dá)99%以上。以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)下載的多條相似序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖3所示，菌株ZJJZ494與數(shù)據(jù)庫(kù)里的多個(gè)粉被蟲草菌株序列聚在同一大支，表明同屬于一個(gè)種。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)鑒定結(jié)果，將蟲草菌株ZJJZ494鑒定為粉被蟲草Cordyceps pruinosa。

2.3 不同碳氮源栽培試驗(yàn)結(jié)果

不同碳源培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)速度的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菌株ZJJZ494菌絲體在乳糖為碳源的培養(yǎng)基中日均生長(zhǎng)速度最快，為2.48 mm·d-1；其次是在葡萄糖的培養(yǎng)基中，菌絲體日均生長(zhǎng)速度為2.46 mm·d-1；之后依次是果糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖；生長(zhǎng)速度最慢的是麥芽糖培養(yǎng)基，為2.05 mm·d-1。菌株ZJJZ494菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的日均長(zhǎng)速存在差異，其菌落顏色也有差異，見(jiàn)圖5。

圖4 不同碳源對(duì)菌株ZJJZ494菌絲體生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Mycelial growth speed of strain ZJJZ494 on media with different carbon sources

圖5 不同碳源培養(yǎng)基上菌株ZJJZ494的菌落形態(tài)特征Fig.5 Colony characteristics of strain ZJJZ494 on media with different carbon sources

如圖5所示，菌株ZJJZ494菌落邊緣多呈白色，中間顏色由淺黃色到橙黃色不等。菌絲體在蔗糖培養(yǎng)基上的氣生菌絲最短，但顏色最深；菌絲在麥芽糖培養(yǎng)基上日均生長(zhǎng)速度最慢，但其菌絲體的濃密度和長(zhǎng)度要比果糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖上的菌絲好。說(shuō)明碳源是菌絲生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)成分，菌株ZJJZ494菌絲體對(duì)不同碳源的利用能力不同。綜合菌株ZJJZ494菌絲的生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，確定其菌絲培養(yǎng)最適的碳源為乳糖和葡萄糖。

不同氮源培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)速度的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可看出，菌株ZJJZ494菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)有差異。氮源為過(guò)硫酸銨培養(yǎng)基中菌絲的長(zhǎng)速最快，為2.81 mm·d-1，其次為尿素、玉米粉、氯化銨、酒石酸銨、酵母粉、蛋白胨。菌落形態(tài)特征見(jiàn)圖7。

圖6 不同氮源對(duì)菌株ZJJZ494菌絲體生長(zhǎng)速度的影響Fig.6 Mycelial growth speed of strain ZJJZ494 on media with different nitrogen sources

圖7 不同氮源培養(yǎng)基上菌珠ZJJZ494的菌落形態(tài)特征Fig.7 Colony characteristics of strain ZJJZ494 on media with different nitrogen sources

由圖7可以看出，菌株ZJJZ494菌絲在不同的氮源培養(yǎng)基上菌落顏色和形態(tài)也有差異，相同培養(yǎng)條件下菌株ZJJZ494菌絲體在酒石酸銨培養(yǎng)基上顏色最深，在蛋白胨培養(yǎng)基上顏色偏白色。菌絲體在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)上的日均生長(zhǎng)速度雖然較低，但在這2種培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)都很濃密。說(shuō)明菌株ZJJZ494菌絲對(duì)不同氮源的利用率也不同。綜合菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，確定菌株ZJJZ494菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為過(guò)硫酸銨。

2.4 粉被蟲草出菇培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

用小麥和大米培養(yǎng)基進(jìn)行粉被蟲草的出菇培養(yǎng)。在接種后45 d，2種培養(yǎng)基上均能獲得粉被蟲草子實(shí)體。其中小麥培養(yǎng)基上收獲的子實(shí)體平均單瓶?jī)糁貫?.44 g，生物學(xué)效率為8.88%；大米培養(yǎng)基上收獲的子實(shí)體平均單瓶?jī)糁貫?.45 g，生物學(xué)效率為8.89%，說(shuō)明粉被蟲草在2種培養(yǎng)基上的產(chǎn)量無(wú)明顯差異。但2種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的子實(shí)體形態(tài)和顏色有差異，見(jiàn)圖8。

圖8 菌株ZJJZ494在2種培養(yǎng)基上的出菇情況Fig.8 Fruiting situstion of strain ZJJZ494 on the two media

如圖8所示，小麥培養(yǎng)基上子實(shí)體整體顏色為深橙紅色，指狀孢梗束頂端分枝細(xì)而多（圖8W）；在大米培養(yǎng)基上子實(shí)體呈淡橙色，指狀孢梗束頂端分枝粗而少且為橙黃色（圖8R）。說(shuō)明在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基的成分能影響子實(shí)體的形態(tài)和顏色。

3 結(jié)論與討論

蟲草是極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值且待開(kāi)發(fā)的醫(yī)藥寶藏，自然界中蟲草種類繁多，作為世界上生物多樣性豐富的12個(gè)國(guó)家之一，我國(guó)更是具有豐富和獨(dú)特的蟲草資源[19]。冬蟲夏草是蟲草中的極品，具有巨大的市場(chǎng)需求，但其野生資源非常稀缺，已被列為中國(guó)二級(jí)保護(hù)物種，2020年國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）將冬蟲夏草的受威脅等級(jí)也定為易危[2，20]。因此，冬蟲夏草代用品的開(kāi)發(fā)成為必然趨勢(shì)。無(wú)論是科學(xué)研究，還是培養(yǎng)、生產(chǎn)蟲草用于醫(yī)藥、食品、真菌殺蟲劑及其他領(lǐng)域，都要依賴于蟲草的無(wú)性型菌株制作菌種；分離的菌株是否為形成蟲草的真菌，是研究和利用蟲草的核心問(wèn)題，具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值[3，21]。粉被蟲草作為民間藥用較廣的蟲草，因與冬蟲夏草具有多種相同成分逐漸受到人們的重視。云南是蟲草物種多樣性分布的重要地區(qū)之一，但關(guān)于蟲草種質(zhì)資源分離培養(yǎng)研究的報(bào)道極少，因此，急需立足本土資源優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)選育可人工栽培的優(yōu)質(zhì)蟲草種質(zhì)。

本研究通過(guò)利用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，以及其有性型與無(wú)性型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定在昆明西山采集的蟲草確為粉被蟲草Cordyceps pruinosa，且分離得到其無(wú)性型菌種粉被瑪利亞霉Mariannaea pruinosa。前人研究表明，粉被蟲草與雙節(jié)棍植生蟲草（Cordyceps ninchukispora）不僅在形態(tài)上極為相似，兩者還具有極近的親緣關(guān)系，不同之處在于粉被蟲草寄生于昆蟲上，而C.ninchukispora寄生于植物種子上[22]。本研究中，在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，供試菌株序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中C.ninchukispora的多條序列相識(shí)度也達(dá)到99%以上，因此在鑒定粉被蟲草時(shí)需要有性型、無(wú)性型形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)手段鑒定。

對(duì)無(wú)性型菌株ZJJZ494進(jìn)行碳源、氮源的培養(yǎng)試驗(yàn)表明：ZJJZ494菌絲體培養(yǎng)最適的碳源為乳糖和葡萄糖，最適氮源為過(guò)硫酸銨。用小麥和大米培養(yǎng)基進(jìn)行粉被蟲草的出菇培養(yǎng)，粉被蟲草在2種培養(yǎng)基上的產(chǎn)量無(wú)顯著差異：在小麥培養(yǎng)基栽培的生物學(xué)效率為8.88%，大米培養(yǎng)基栽培的生物學(xué)效率為8.89%，但2種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的子實(shí)體形態(tài)和顏色有差異。不同培養(yǎng)基上菌絲體和子實(shí)體顏色均有差異，可能是粉被蟲草色素的合成與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)也有關(guān)，還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

王小董[23]的研究表明粉被蟲草菌絲體甲醇粗提物中的天然色素物質(zhì)并非單一的化合物，而是多種黃色色素的混合物。野外采集的粉被蟲草和人工栽培的粉被蟲草均有鮮艷的顏色，后期可考慮對(duì)其色素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。天然色素化合物可從顏色鮮艷的蟲生真菌中篩選分離，不僅能解決天然色素來(lái)源問(wèn)題，還可以開(kāi)發(fā)一些具有特殊功效的食品色素添加劑。如果能從粉被蟲草中篩選出有較好開(kāi)發(fā)前景的色素高產(chǎn)菌株，并將其應(yīng)用于生產(chǎn)生活之中，將具有很大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

何亞瓊等[24]的研究表明，人工培養(yǎng)的粉被蟲草菌絲體和孢梗束代謝組差異顯著：粉被蟲草菌絲體代謝物中磷脂類、肽類、氨基酸、脂肪酸和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，菌絲可能具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；孢梗束代謝物中生物堿類、核苷類、萜類、酮類、酸酐等活性物質(zhì)含量較高，孢梗束具有較大的藥用價(jià)值。本研究?jī)H對(duì)粉被蟲草的菌絲體和馴化栽培進(jìn)行了初步研究，未進(jìn)行蟲草菌絲體和孢梗束成分的相關(guān)研究，后期值得對(duì)這兩部分的藥效考察和應(yīng)用研究做進(jìn)一步的研究。