楊珍福，劉紹雄，華 蓉，孫達(dá)鋒，尚陸娥，馬 明，馮云利，和 勇，李建英**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221）

冬蟲夏草是世界聞名的名貴中藥材，藥用價值和商業(yè)價值巨大，但野生冬蟲夏草生長條件苛刻，自然寄生率低，加上人們的濫采，導(dǎo)致天然資源緊缺，價格昂貴[1]。因此，代用品的開發(fā)成為必然趨勢。目前，蟲草的種類繁多，是子囊菌中多樣性較高的類群之一，全世界已報道的種有近千個[2]。現(xiàn)代藥理藥化研究發(fā)現(xiàn)，不同蟲草種類所含成分千差萬別，其功效也各有不同[3]。因此調(diào)查和研究中國蟲草資源以及如何合理利用眾多的蟲草資源不僅有重要的理論研究意義，而且也具有極其珍貴的應(yīng)用價值。蟲草素和N6-（2-羥乙基）腺嘌呤核苷（HEA）是冬蟲夏草中非常重要的生物活性物質(zhì)，而粉被蟲草是蟲草素和HEA的良好來源，可以作為冬蟲夏草的替代品[4]。

粉被蟲草（Cordyceps pruinosa Petch），又名繭草、繭蟲草，常寄生于多種鱗翅目昆蟲的蛹繭上，是著名真菌學(xué)家Petch在1924年發(fā)現(xiàn)及命名的，其無性型新種—粉被馬利亞霉（Mariannaea pruinosa）由我國學(xué)者梁宗琦確證、鑒定和命名[5-8]。現(xiàn)有報道中粉被蟲草主要分布于我國貴州、浙江、江西、福建、湖北、廣東、吉林、遼寧、臺灣等省[7-10]。試驗證實，粉被蟲草具鈣離子拮抗、抗紫外線輻射損害、抑制細(xì)菌、抗炎、抗腫瘤、抗巨噬細(xì)胞吞噬和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等生物活性[11-17]。由此可見，粉被蟲草是一種具有廣泛生物學(xué)活性、可作為冬蟲夏草替代品，且具有較高利用價值、較大開發(fā)前景的蟲草資源。

云南是冬蟲夏草的主產(chǎn)區(qū)之一，近些年來由于過度采挖，野生冬蟲夏草資源緊缺，因此尋找和選育出可更好地替代冬蟲夏草的蟲草菌種，以保護(hù)蟲草資源多樣性和日益枯竭的冬蟲夏草資源就顯得尤為重要。本研究中，在云南采集到一株野生粉被蟲草，對其無性型進(jìn)行了分離培養(yǎng)，同時對菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對其培養(yǎng)特性和馴化栽培進(jìn)行初步研究，以期為該菌的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

野生蟲草子實體采集自云南省昆明市西山（101°25′59″E，24°59′27″N），保存于中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂18 g，水1 000 mL。

PDA液體綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g，水1 000 mL，pH自然。

大米培養(yǎng)基：20 g大米加入40 mL營養(yǎng)液。

小麥培養(yǎng)基：20 g小麥加入40 mL營養(yǎng)液。

營養(yǎng)液：葡萄糖 10 g·L-1、蛋白胨 10 g·L-1、酵母粉 10 g·L-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株子實體形態(tài)學(xué)鑒定

對野生蟲草進(jìn)行宏觀和顯微形態(tài)特征觀察，參照參考文獻(xiàn)[6，8，9]進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng)

對野生蟲草子實體進(jìn)行組織分離。選擇完整的蟲草，用清水清洗表面，再用75%酒精浸泡1 min左右，然后用無菌水沖洗并擦干。在超凈工作臺內(nèi)，用無菌手術(shù)刀切開子座頂端部分，用鑷子夾取2 mm～4 mm組織塊，接于PDA培養(yǎng)基斜面，置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑取無污染的菌絲，反復(fù)純化，將純化后菌株接種到察氏培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)及菌絲顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)學(xué)鑒定

取待鑒定菌絲體，液氮研磨后用TaKaRa生物有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA基因組的提取，DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。采用上海生工生物工程技術(shù)公司合成的通用引物ITS1和ITS4，參照參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物檢測后送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序。所得ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA 6.0軟件采用鄰接法NJ（Neighbor-joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 碳源對菌株生長的影響試驗

以加20 g葡萄糖的PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，其他處理分別用等量的麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、果糖、可溶性淀粉替代葡萄糖作為碳源。用已滅菌的直徑5 mm打孔器均勻截取活化好的菌絲塊接種，常溫培養(yǎng)，每個處理均設(shè)3個重復(fù)。

1.2.5 氮源對菌株生長的影響試驗

在PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2 g的蛋白胨、酵母粉、尿素、氯化銨、酒石酸銨、過硫酸銨、玉米粉作為氮源。其余操作同1.2.4。

1.2.6 粉被蟲草出菇培養(yǎng)

挑取一定量的菌絲接入PDA液體綜合培養(yǎng)基，在25℃震蕩培養(yǎng)7 d，得到液體菌種。然后取10 mL液體菌種分別接入大米和小麥培養(yǎng)基，每個處理設(shè)10個重復(fù)。25℃黑暗培養(yǎng)，菌絲長滿培養(yǎng)基表面后進(jìn)行光照培養(yǎng)。觀察記錄子實體出菇情況。

1.3 生長速度測定

采用“十”字交叉法測定菌落直徑，記錄各菌株生長情況，計算菌絲體每天平均生長速度。

菌絲體生長速度（V，mm·d-1）的計算公式為：

V=S/D

式中：S為菌絲長度（mm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生子實體和菌絲體的鑒定

子實體形態(tài)特征見圖1。

圖1 粉被蟲草有性型Fig.1 The teleomorph of Cordyceps pruinosa

如圖1所示，野生子實體（圖1A）子座出自昆蟲蛹繭殼上，多個，長度為3 cm～5 cm；柄稍彎曲，基部有白色菌絲體；頭部棒狀，頂端尖，橘紅色；子囊殼（圖1B） 表生，長卵圓形；子囊柱狀（圖1C），囊孢子比子囊稍短，線形，可斷裂形成分孢子。上述特征符合粉被蟲草的特征描述，初步確定其為粉被蟲草。

將反復(fù)純化培養(yǎng)獲得的菌株命名為ZJJZ494，保存于中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所。菌株形態(tài)特征見圖2。

圖2 粉被蟲草無性型菌株形態(tài)Fig.2 The characteristics and microscopic features of Cordyceps pruinosa

如圖2所示，菌株ZJJZ494在察氏培養(yǎng)基上菌落平展呈絨毛狀有輪紋，培養(yǎng)初期（圖2A），菌落中心呈白色、略微突起，中間為橘黃色至黃色，最邊緣呈白色；培養(yǎng)較長時間后，菌落邊緣呈白色，中間部分全為橘黃色至黃色；形成指狀可分叉的孢梗束。分生孢子梗單生、對生或輪狀分枝。產(chǎn)孢細(xì)胞瘦長錐形，分生孢子透明、光滑，卵圓形或柱狀（圖2B），典型的疊瓦狀排列。上述特征與粉被蟲草的無性型粉被瑪利亞霉的描述一致，因此可以鑒定該菌株為粉被瑪利亞霉。

2.2 菌絲體分子生物學(xué)分析結(jié)果

對測序后得到的菌株ZJJZ494菌絲體的ITS序列進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果表明，菌株ZJJZ494的ITS序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為 MT012347、AY491995等多個粉被蟲草菌株的同源性都達(dá)99%以上。以GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)下載的多條相似序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖3所示，菌株ZJJZ494與數(shù)據(jù)庫里的多個粉被蟲草菌株序列聚在同一大支，表明同屬于一個種。結(jié)合子實體形態(tài)鑒定結(jié)果，將蟲草菌株ZJJZ494鑒定為粉被蟲草Cordyceps pruinosa。

2.3 不同碳氮源栽培試驗結(jié)果

不同碳源培養(yǎng)基對菌株ZJJZ494菌絲生長速度的影響見圖4。

由圖4可知，菌株ZJJZ494菌絲體在乳糖為碳源的培養(yǎng)基中日均生長速度最快，為2.48 mm·d-1；其次是在葡萄糖的培養(yǎng)基中，菌絲體日均生長速度為2.46 mm·d-1；之后依次是果糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖；生長速度最慢的是麥芽糖培養(yǎng)基，為2.05 mm·d-1。菌株ZJJZ494菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的日均長速存在差異，其菌落顏色也有差異，見圖5。

圖4 不同碳源對菌株ZJJZ494菌絲體生長速度的影響Fig.4 Mycelial growth speed of strain ZJJZ494 on media with different carbon sources

圖5 不同碳源培養(yǎng)基上菌株ZJJZ494的菌落形態(tài)特征Fig.5 Colony characteristics of strain ZJJZ494 on media with different carbon sources

如圖5所示，菌株ZJJZ494菌落邊緣多呈白色，中間顏色由淺黃色到橙黃色不等。菌絲體在蔗糖培養(yǎng)基上的氣生菌絲最短，但顏色最深；菌絲在麥芽糖培養(yǎng)基上日均生長速度最慢，但其菌絲體的濃密度和長度要比果糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖上的菌絲好。說明碳源是菌絲生長的重要營養(yǎng)成分，菌株ZJJZ494菌絲體對不同碳源的利用能力不同。綜合菌株ZJJZ494菌絲的生長速度和長勢，確定其菌絲培養(yǎng)最適的碳源為乳糖和葡萄糖。

不同氮源培養(yǎng)基對菌株ZJJZ494菌絲生長速度的影響見圖6。

由圖6可看出，菌株ZJJZ494菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上長勢有差異。氮源為過硫酸銨培養(yǎng)基中菌絲的長速最快，為2.81 mm·d-1，其次為尿素、玉米粉、氯化銨、酒石酸銨、酵母粉、蛋白胨。菌落形態(tài)特征見圖7。

圖6 不同氮源對菌株ZJJZ494菌絲體生長速度的影響Fig.6 Mycelial growth speed of strain ZJJZ494 on media with different nitrogen sources

圖7 不同氮源培養(yǎng)基上菌珠ZJJZ494的菌落形態(tài)特征Fig.7 Colony characteristics of strain ZJJZ494 on media with different nitrogen sources

由圖7可以看出，菌株ZJJZ494菌絲在不同的氮源培養(yǎng)基上菌落顏色和形態(tài)也有差異，相同培養(yǎng)條件下菌株ZJJZ494菌絲體在酒石酸銨培養(yǎng)基上顏色最深，在蛋白胨培養(yǎng)基上顏色偏白色。菌絲體在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)上的日均生長速度雖然較低，但在這2種培養(yǎng)基上菌絲長勢都很濃密。說明菌株ZJJZ494菌絲對不同氮源的利用率也不同。綜合菌株ZJJZ494菌絲生長速度和長勢，確定菌株ZJJZ494菌絲生長的最適氮源為過硫酸銨。

2.4 粉被蟲草出菇培養(yǎng)試驗結(jié)果

用小麥和大米培養(yǎng)基進(jìn)行粉被蟲草的出菇培養(yǎng)。在接種后45 d，2種培養(yǎng)基上均能獲得粉被蟲草子實體。其中小麥培養(yǎng)基上收獲的子實體平均單瓶凈重為4.44 g，生物學(xué)效率為8.88%；大米培養(yǎng)基上收獲的子實體平均單瓶凈重為4.45 g，生物學(xué)效率為8.89%，說明粉被蟲草在2種培養(yǎng)基上的產(chǎn)量無明顯差異。但2種培養(yǎng)基上長出的子實體形態(tài)和顏色有差異，見圖8。

圖8 菌株ZJJZ494在2種培養(yǎng)基上的出菇情況Fig.8 Fruiting situstion of strain ZJJZ494 on the two media

如圖8所示，小麥培養(yǎng)基上子實體整體顏色為深橙紅色，指狀孢梗束頂端分枝細(xì)而多（圖8W）；在大米培養(yǎng)基上子實體呈淡橙色，指狀孢梗束頂端分枝粗而少且為橙黃色（圖8R）。說明在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基的成分能影響子實體的形態(tài)和顏色。

3 結(jié)論與討論

蟲草是極具經(jīng)濟(jì)價值且待開發(fā)的醫(yī)藥寶藏，自然界中蟲草種類繁多，作為世界上生物多樣性豐富的12個國家之一，我國更是具有豐富和獨(dú)特的蟲草資源[19]。冬蟲夏草是蟲草中的極品，具有巨大的市場需求，但其野生資源非常稀缺，已被列為中國二級保護(hù)物種，2020年國際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）將冬蟲夏草的受威脅等級也定為易危[2，20]。因此，冬蟲夏草代用品的開發(fā)成為必然趨勢。無論是科學(xué)研究，還是培養(yǎng)、生產(chǎn)蟲草用于醫(yī)藥、食品、真菌殺蟲劑及其他領(lǐng)域，都要依賴于蟲草的無性型菌株制作菌種；分離的菌株是否為形成蟲草的真菌，是研究和利用蟲草的核心問題，具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價值[3，21]。粉被蟲草作為民間藥用較廣的蟲草，因與冬蟲夏草具有多種相同成分逐漸受到人們的重視。云南是蟲草物種多樣性分布的重要地區(qū)之一，但關(guān)于蟲草種質(zhì)資源分離培養(yǎng)研究的報道極少，因此，急需立足本土資源優(yōu)勢，開發(fā)選育可人工栽培的優(yōu)質(zhì)蟲草種質(zhì)。

本研究通過利用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，以及其有性型與無性型之間的對應(yīng)關(guān)系，確定在昆明西山采集的蟲草確為粉被蟲草Cordyceps pruinosa，且分離得到其無性型菌種粉被瑪利亞霉Mariannaea pruinosa。前人研究表明，粉被蟲草與雙節(jié)棍植生蟲草（Cordyceps ninchukispora）不僅在形態(tài)上極為相似，兩者還具有極近的親緣關(guān)系，不同之處在于粉被蟲草寄生于昆蟲上，而C.ninchukispora寄生于植物種子上[22]。本研究中，在NCBI進(jìn)行序列比對時，供試菌株序列與數(shù)據(jù)庫中C.ninchukispora的多條序列相識度也達(dá)到99%以上，因此在鑒定粉被蟲草時需要有性型、無性型形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)手段鑒定。

對無性型菌株ZJJZ494進(jìn)行碳源、氮源的培養(yǎng)試驗表明：ZJJZ494菌絲體培養(yǎng)最適的碳源為乳糖和葡萄糖，最適氮源為過硫酸銨。用小麥和大米培養(yǎng)基進(jìn)行粉被蟲草的出菇培養(yǎng)，粉被蟲草在2種培養(yǎng)基上的產(chǎn)量無顯著差異：在小麥培養(yǎng)基栽培的生物學(xué)效率為8.88%，大米培養(yǎng)基栽培的生物學(xué)效率為8.89%，但2種培養(yǎng)基上長出的子實體形態(tài)和顏色有差異。不同培養(yǎng)基上菌絲體和子實體顏色均有差異，可能是粉被蟲草色素的合成與培養(yǎng)基營養(yǎng)也有關(guān)，還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

王小董[23]的研究表明粉被蟲草菌絲體甲醇粗提物中的天然色素物質(zhì)并非單一的化合物，而是多種黃色色素的混合物。野外采集的粉被蟲草和人工栽培的粉被蟲草均有鮮艷的顏色，后期可考慮對其色素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。天然色素化合物可從顏色鮮艷的蟲生真菌中篩選分離，不僅能解決天然色素來源問題，還可以開發(fā)一些具有特殊功效的食品色素添加劑。如果能從粉被蟲草中篩選出有較好開發(fā)前景的色素高產(chǎn)菌株，并將其應(yīng)用于生產(chǎn)生活之中，將具有很大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

何亞瓊等[24]的研究表明，人工培養(yǎng)的粉被蟲草菌絲體和孢梗束代謝組差異顯著：粉被蟲草菌絲體代謝物中磷脂類、肽類、氨基酸、脂肪酸和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)較多，菌絲可能具有較高營養(yǎng)價值；孢梗束代謝物中生物堿類、核苷類、萜類、酮類、酸酐等活性物質(zhì)含量較高，孢梗束具有較大的藥用價值。本研究僅對粉被蟲草的菌絲體和馴化栽培進(jìn)行了初步研究，未進(jìn)行蟲草菌絲體和孢梗束成分的相關(guān)研究，后期值得對這兩部分的藥效考察和應(yīng)用研究做進(jìn)一步的研究。