郭麗芳 ，楊瑞，孫蔚旻*

1. 佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2. 廣東省科學院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所/華南土壤污染控制與修復國家地方聯(lián)合工程研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650

尾礦是采礦過程中產(chǎn)生的細粒沙，含有大量重金屬、硫酸鹽及其他鹽類和礦物質，被認為是大陸侵蝕的主要人為來源之一（Li et al.，2015；Sun et al.，2016）。在長期堆存時會產(chǎn)生有毒有害物質，嚴重污染鄰近環(huán)境，破壞農(nóng)作物的生長，使地面水體和地下水源受到污染，毒害水生生物，造成嚴重的環(huán)境問題（Jana et al.，2012；Sultana et al.，2012）。而尾礦中含有大量的砷、銻、鉻、鋅和銅等重金屬物質，不僅對周邊環(huán)境造成污染，導致土地退化和沙漠化，而且會對動植物體產(chǎn)生危害，甚至危害人體健康，故迫切需要對尾礦進行適當?shù)墓芾砗吞幚恚⊿un et al.，2016）。生物修復是尾礦修復的一種潛在方法。然而，惡劣的環(huán)境條件，如高濃度金屬離子和貧營養(yǎng)（缺氮），往往阻礙了生物修復的進行（Moynahan et al.，2002）。

氮是植物和微生物所必需的一種重要的營養(yǎng)素，參與葉綠素、核苷酸和蛋白質的合成，是影響作物產(chǎn)量的一個重要元素（Sun et al.，2018）。尾礦中的氮缺乏影響著微生物和植物的生長（Sun et al.，2020），是限制尾礦生物修復的主要因素（Lin et al.，2012）。雖然氮肥的施用可以有效緩解氮素缺乏，但也可能對周圍環(huán)境造成二次污染。相比之下，在這種缺氮生境中固氮微生物大量存在，可為尾礦污染地區(qū)的植物和微生物生長提供可利用氮（Titus et al.，2014）。然而與其他生態(tài)系統(tǒng)相比，人們對棲息在尾礦棲息地的固氮菌的活動情況尚不了解（Zhan et al.，2012）。目前，只有少數(shù)研究對尾礦的固氮菌群落組成進行了分析。例如，在一個銅礦尾礦中，發(fā)現(xiàn)變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Firmicutes）等主要的固氮生物（Huang et al.，2011），從尾礦中的植物根瘤中分離出了一些固氮菌（Navarro-Noya et al.，2012）。與土壤相比，尾礦是寡營養(yǎng)環(huán)境，有機碳和氮的可用性有限（Li et al.，2015）。通常會存在一些自養(yǎng)生物和固氮生物作為先驅者在生態(tài)系統(tǒng)中生存，提供營養(yǎng)物質，促進尾礦環(huán)境植物的生長（Mendez et al.，2008）。但尾礦環(huán)境條件惡劣，常用固氮生物很難在這樣的條件下生存并發(fā)揮作用，同時微生物功能存在種間差異，因此篩選高效土著固氮生物對尾礦修復具有重要作用。

本研究假設在寡營養(yǎng)和重金屬的尾礦環(huán)境中可能存在固氮生物。采集湖南懷化溆浦縣黃家尾礦樣品進行固氮菌的分離實驗，并結合盆栽試驗探究固氮菌的促生潛力。這項研究的目的是：（1）分離鑒定尾礦環(huán)境中的固氮菌株；（2）研究尾礦環(huán)境中的固氮生物對植物的促生作用。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

本實驗的尾礦樣品采自于湖南懷化溆浦縣黃家尾礦（28°00'N，110°50'E）。

1.2 主要儀器和試劑

氣相色譜儀-7890B（安捷倫公司）；實時熒光定量PCR儀（北京賽百奧科技有限公司）；紫外可見分光光度計和ICP OES，用于測定土壤各重金屬總質量分數(shù)；高純乙炔，佛山德力氣體公司配送；固氮菌固體培養(yǎng)基（Jensen’s Medium、Luria-Bertani）和液體培養(yǎng)基（Jensen’s Broth、Luria-Bertani）為HiMedia生產(chǎn)，其主要成分見表1。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Media composition g·L-1

1.3 分離與培養(yǎng)條件

尾礦樣品用 0.9%的鹽水逐步稀釋，于 10-3、10-4、10-5梯度濃度的鹽水中各取100 μL菌懸液，用一次性涂布棒涂布在無氮Jensen固體培養(yǎng)基上，每個濃度處理3個平行，將培養(yǎng)基置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃下培養(yǎng)24—48 h。

觀察培養(yǎng)24—48 h后平板上菌落的生長情況，挑取生長的單菌落采用末端稀釋劃線法接種到 LB固體培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中 30 ℃下培養(yǎng)24—48 h，直至菌純化，再將純化菌置于-20 ℃冰箱中冷藏保存。

1.4 固氮酶活性的測定

將菌株接種在 30 mL LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 200 r·min-1搖床上培養(yǎng)過夜。離心收集沉淀物，用滅菌水清洗 3次，重新懸浮于盛有 30 mL Jensen’s Broth液體培養(yǎng)基的血清瓶中（每菌株 5個重復）；通入3 mL乙炔氣體，結合安捷倫氣相色譜儀（7890B），監(jiān)測乙烯的產(chǎn)生，由此確定菌株的固氮活性。

采用下列公式計算固氮酶活性大?。ㄗT志遠等，2012）：

式中：

hx——樣品峰值；

hs——標準C2H4峰值；

c——標準 C2H4的物質的量濃度（nmol·mL-1）；

V——培養(yǎng)容器體積（mL）；

t——樣品的培養(yǎng)時間，即C2H4的反應時間（h）；

N——C2H4的生成速率（nmol·mL-1·h-1）。

1.5 固氮菌的形態(tài)特征

將菌株接種在LB固體培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃下培養(yǎng)24—48 h后，觀察菌落的顏色、大小、形狀、質地、生長速度等。

1.6 16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

取50 μL LB固體培養(yǎng)基于八連管中；用滅菌槍頭挑取單菌落于管中攪拌后取出；80 ℃熱變性 15 min，低速離心，取2 μL裂解后的上清液作為PCR反應的模板。使用細菌通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′）和 1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）進行 PCR擴增。PCR產(chǎn)物純化與基因序列分析委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。將獲得的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫所有已測定的原核生物序列進行比對，應用MEGA 3.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 最適pH的篩選

將菌株接種在 5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 200 r·min-1搖床上培養(yǎng)過夜；取 100 μL菌液于50 mL具有不同pH值梯度的LB液體培養(yǎng)基中，置于200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)，4 h后測定菌株的生長狀況（OD600nm，指600 nm波長處的細菌濃度）。

1.8 生理生化特征測定

1.8.1 IAA的定性分析

在 LB 培養(yǎng)基中加入待測菌菌懸液，每株菌株設置3個平行，搖床中30 ℃培養(yǎng)24—72 h后，加入吲哚試劑于培養(yǎng)物的液面上。若在液體交界處呈現(xiàn)紅色環(huán)則為陽性，否則為陰性。若顯色不明顯，加入幾滴乙醚搖勻，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)物的液面，再加入吲哚試劑，觀察液面結果。

1.8.2 固氮菌金屬抗性測定

在LB固體培養(yǎng)基中加入一定量的亞砷酸鈉標準液，使固體平板中As(III)物質的量濃度為40×10-3mol·L-1，并將單菌株接種到該濃度平板上，每個菌株培養(yǎng)2—3 d，觀察其生長情況。

1.8.3 鐵載體測定

將0.048 g刃天青溶于40 g超純水中，然后與8 mL 1 mmol·L-1氯化鐵混勻，將0.06 g十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）溶于32 mL超純水中，加入 10×MM9鹽溶液（磷酸氫鈉 30 g，磷酸二氫鉀1.5 g，氯化鈉2.5 g，氯化銨15 g，超純水500 mL）80 mL、哌嗪二乙醇磺酸24.16 g、瓊脂12.8 g，調節(jié) pH 至 6.8，加入 1 mmol·L-1氯化鈣 0.8 mL、1 mmol·L-1七水硫酸鎂 16 mL、20%葡萄糖 8 mL、10%酪水解酪素24 mL，搖勻，即得藍色定性檢測培養(yǎng)基，按每皿20 mL倒入培養(yǎng)皿中；用滅菌槍頭挑取單菌落劃線在平板上，置于 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落周圍變色圈。

1.9 盆栽試驗

為進一步探究尾礦固氮菌對鬼針草（Bidens pilosa）生長的促生潛力，進行了盆栽試驗。將菌株接種于150 mL LB培養(yǎng)基上，于37 ℃ 200 r·min-1搖床上培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，以 6000 r·min-1離心 5 min，收獲菌株，并用無菌水清洗3—4次。

鬼針草的種子用次氯酸鈉消毒10 min，并用消毒水清洗3次，采用黃家尾礦中的尾礦渣與蛭石1∶2混合后的土樣設置盆栽試驗。預設加菌液、不加菌液兩個處理。每個處理設10個重復。種植完成后，每隔4天向盆栽中接種菌液50 mL，共澆菌4次。兩個月收獲后，測定植株莖長、根長、鮮質量、干質量、總氮含量。

應用RStudio和Origin 2021進行統(tǒng)計分析、繪圖，不同處理的平均值采用最小顯著性差異法（LSD）進行比較（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 固氮菌分離鑒定

以湖南懷化溆浦縣黃家尾礦為樣品，在無氮固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h得到7株菌株：L45、G6、G18、L2+2、L31、G15、PC-3，并將菌株接種在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察其表觀形狀。結果表明（表2），部分菌落呈黃色且不透明，圓形，中間隆起、邊緣較整齊，表面光滑濕潤，易于挑?。涣硪徊糠志瓿尸F(xiàn)淡黃色、透明，邊緣整齊、光滑，不易挑取。

表2 不同菌株的菌落特征Table 2 Colony characteristics of the different strains

2.2 酶活性測定

尾礦中的氮貧乏經(jīng)常制約著微生物和植物的生長（Sun et al.，2020），生物固氮是尾礦微生物群落所需的基本生態(tài)系統(tǒng)功能，固氮微生物的存在為尾礦植物的生長提供可利用的氮（Titus et al.，2014）。本實驗中，使用無氮培養(yǎng)基從尾礦樣本中分離出7株菌株，并利用乙炔還原法測定菌株的酶活性，結果如圖1所示，可以看出7個菌落顯示出不同的固氮酶活性，其中 PC-3的固氮酶活性最高（7133.71 μmol·h-1·mL-1），L31、G15、G6 菌株亦具有較高的酶活性。

圖1 不同菌株的固氮酶活性Figure 1 Nitrogen fixing enzyme activity of different strains of bacteria

2.3 菌株生長的最適pH篩選

如圖2所示，G6、G18、PC-3、L45和L2+2菌株在pH 6—9條件下生長較好，G15、L31菌株在pH 7—9條件下生長較好。隨著pH值的升高，菌株的生長趨勢呈先強后弱，其中L45、G6、G18、L3的最適生長pH為7，但G6、L2+2菌株則在pH=9條件下生長最好。

圖2 不同pH值對菌落生長的影響Figure 2 Effect of different pH values on colony growth

2.4 生理生化特性

由表3可知，G6、L2+2、L31和PC-3具有產(chǎn)IAA特性。鐵載體實驗結果表明，G18、G6、G15和PC-3都具備鐵載體能力，這極有可能促進了微生物固氮過程。金屬抗性（As）實驗表明（表3），大部分的菌株可以在砷環(huán)境中生存（除G18），表明這些菌株具有一定的砷耐受能力。

表3 不同菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical properties of the different strains

2.5 菌株的測序結果及系統(tǒng)進化樹的構建

基于16S rRNA序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可知，7株新分離的菌株分別歸類為：短波單胞菌屬（Brevundimonas）2株：G15、G18，黃色桿菌屬（Xanthobacter）1株：L31，鞘脂菌屬（Sphingobium）1株：L2+2，假單胞菌屬（Pseudomonas）1株：PC-3，分枝桿菌屬（Mycobacterium）1株：G6，紅球菌屬（Rhodococcus）1 株：L45。

圖3 根據(jù)16S rRNA序列分析構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree constructed from 16S rDNA sequence analysis

2.6 盆栽試驗結果

本實驗進一步探究了尾礦固氮菌對鬼針草生長的促生潛力，在植物中接種菌株可以促進植物生長（圖4和圖5）。與空白對照相比，接種L2+2、L31、L45和PC-3菌株對鬼針草根長的影響不盡相同，接種了L31的根長增幅最大（圖4a），其次是L45和L2+2。接種了L31、G6、G18和L2+2菌株的處理植物莖長顯著增加，效果最顯著的是L31，增幅達到了93%（圖4b）。

圖4 接種不同菌株對植物根長和莖長的影響Figure 4 Effect of inoculation with different strains on plant root length and stem length

接種菌株對植物干質量提高也有顯著促進作用，與對照組相比，接種L2+2、L31菌株促進植物根干質量增長的效果更顯著（圖 5a），增幅分別達到了260%、233%。PC-3、L2+2菌株顯著提高了植物莖的干質量（圖5b）。

圖5 接種不同菌株對植物根和莖干質量的影響Figure 5 Effect of inoculation with different strains of bacteria on the dry mass of plant roots and stems

進一步研究了接種菌株對植物氮含量的影響。結果表明，與對照組相比，接種不同的菌株對植物莖和根的氮含量提高有不同程度的促進作用。其中，接種G15、G6、L31、L45菌株對植物根氮含量具有顯著的促進作用（圖6a），效果最顯著的是G6，增幅達到406%；接種L31、L2+2、G6對植物莖氮含量提高亦有顯著的促進作用（圖6b）。

圖6 接種不同菌株對植物根和莖氮含量的影響Figure 6 Effect of inoculation with different strains on the nitrogen concent of plant roots and stems

3 討論

礦區(qū)污染已成為一個全球關注的問題，它以驚人的速度正在不斷擴大（Hiller et al.，2012；Wang et al.，2018），在尾礦污染的地點可檢測到高濃度銅、鋅、砷、鎘、銻和鉛等金屬物質（Sun et al.，2021），不僅對周邊環(huán)境造成污染，還對動植物體產(chǎn)生危害，甚至危害人體健康。在尾礦的修復工作中，經(jīng)?？紤]的是先鋒植物和微生物，主要是因為它們具備成本效益和環(huán)保特征（Ojuederie et al.，2017；Xiao et al.，2021），但尾礦環(huán)境中缺乏氮，通常不適合植物和微生物生長，影響生物修復效率（Sun et al.，2020）。而生物固氮作為一種經(jīng)濟和生態(tài)方法，為植物和微生物提供的生物可利用氮（Titus et al.，2014）。研究表明，固氮菌可以改善土壤成分，為退化生境恢復提供物質基礎，對植物根系的生長活動與微生物群落的發(fā)展具有相互促進作用。目前關于棲息在尾礦中的固氮生物的研究較少，因此進一步了解尾礦的固氮過程、固氮生物的功能和代謝特征是至關重要的。

本實驗通過無氮培養(yǎng)基和稀釋涂布分離法培養(yǎng)分離出7株固氮菌株，這些固氮菌可為尾礦環(huán)境中的植物提供氮，促進植物的生長和尾礦環(huán)境的生態(tài)修復。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，這7株菌株分屬于不同的種屬，G15和 G18兩株菌株為Brevundimonas，同時這株菌株在贛州稀土礦區(qū)尾礦環(huán)境中被研究發(fā)現(xiàn)（龍婉婉等，2020），L31、L2+2、PC-3、L45、G6等5株菌株分別為Xanthobacter、Sphingobium、Pseudomonas、Rhodococcus、Mycobacterium。Mycobacterium、Pseudomonas、Rhodococcus等菌株分別在四川省攀西地區(qū)矸石山（程蓉等，2018）、河南省靈寶市平陽鎮(zhèn)文西渠金尾礦廢棄地（李自剛等，2009）、安徽銅陵楊山?jīng)_尾礦庫（趙興青等，2009）等尾礦環(huán)境中被報道。然而，Brevundimonas、Xanthobacter目前在尾礦環(huán)境中尚未被報道。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Mycobacterium（Marassi，2011），Pseudomonas（Pascuan et al.，2015），Rhodococcu（欒敏等，2009）等菌株均被報道具有固氮的功能。同時對菌株的最適pH進行探究，發(fā)現(xiàn)大部分的菌株可在中堿性條件下生長，可能與尾礦開采過程中重金屬物質和碳酸鹽類分解使得游離堿含量上升，導致尾礦浸出液pH值上升有關（朱建平等，2021）。

IAA是一種調節(jié)植物生長和發(fā)育的主要植物激素，不僅可以促進植物生長，而且能使色氨酸類似物質解毒，減輕其毒害作用，還可以抑制植物防衛(wèi)系統(tǒng)，使得有益細菌更易定殖于植物體內（周德明等，2012）。本實驗對7株菌株進行了IAA的定性實驗，可知G6、L2+2、L31和PC-3具有產(chǎn)IAA特性，這些菌株可能具有促進和調節(jié)植物生長的能力。而鐵離子以及鐵離子與蛋白質相結合參與微生物體內DNA的合成、過氧化物的降解、生物固氮等重要的生命活動過程，并且對生物膜的形成起著調節(jié)表面運動和穩(wěn)定多糖基質的作用，在缺鐵的生長條件下，微生物表面疏水性降低，導致生物膜的形成受到限制（董子陽等，2019）。本實驗中的G18、G6、G15和PC-3菌株都具有含鐵載體能力，有可能參與了微生物固氮過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)L45、G6、L2+2、L31和PC-3都具有金屬抗性（As）能力，可能與尾礦開采過程中產(chǎn)生的大量重金屬物質有關，而優(yōu)勢固氮菌的存在與它本身存在的金屬抗性有關。

經(jīng)研究表明，菌株Sphingobium、Mycobacterium分別具有促進水稻（Oryza sativa）和萬壽菊（Tagetes erecta）幼苗生長的作用（康貽軍等，2010），Brevundimonas具有促進馬鈴薯（Solanum tuberosum）生長的作用（Naqqash et al.，2020），Pseudomonas具有促進植物生長的能力（Liu et al.，2015）。根據(jù)IAA特性和固氮酶活性，選擇7株菌株接種于鬼針草盆栽中，分析其對植物的促生作用。結果表明，與對照組相比，接種菌株對植物的根莖生長、干質量和氮含量分別具有不同程度的增長效果，其中L31、L2+2、G6效果最佳。

4 結論

從湖南懷化溆浦縣黃家尾礦中分離出了7株具有固氮功能的菌株，這些菌株可為植物生長提供可利用性氮，同時具有產(chǎn)生植物激素IAA和含鐵載體的能力。通過盆栽試驗得知，接種這些菌株可以促進尾礦環(huán)境中植物的生長，其中L31、L2+2、G6效果最佳。因此，這3株菌株具有較大的植物促生潛力，在獲取營養(yǎng)物質和促進尾礦的生態(tài)演替方面發(fā)揮重要作用，可作為生物肥料的良好候選菌株，以促進尾礦生態(tài)環(huán)境的修復。