鐘文杰，陳昌南，陸紅紅

( 1.江門市新會(huì)區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 江門 529000； 2.江門市人民醫(yī)院)

肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)是最常見的肺癌亞型，其死亡率在惡性腫瘤中居于首位[1]。盡管靶向治療和免疫治療已經(jīng)用于LUAD晚期患者的臨床治療，但治療效果5年生存率僅約15%[2]。因此，識(shí)別與 LUAD 預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物將有助于探索肺腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制及改善患者的預(yù)后。

功能蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾。蛋白質(zhì)作為生物學(xué)的重要組成部分，是生物功能的實(shí)現(xiàn)者。細(xì)胞中 mRNA 的數(shù)量不能與其相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平準(zhǔn)確相關(guān)。更重要的是，無論是 DNA 微陣列還是 RNA-Seq，都不能反映相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，而這恰好是影響蛋白質(zhì)功能實(shí)現(xiàn)的重要因素[3]。與基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究不同，腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的研究更直接地揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，同時(shí)為腫瘤生物治療提供直接的靶點(diǎn)[4]。反相蛋白質(zhì)陣列(reverse phase protein array，RPPA)是一種結(jié)合平面高精度大規(guī)模樣品蛋白抗原微陣列打印和抗體檢測的高通量蛋白組學(xué)技術(shù)，可以用于蛋白質(zhì)精準(zhǔn)量化，因此可以準(zhǔn)確鑒別腫瘤中的蛋白質(zhì)種類及表達(dá)水平[5]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)分析已經(jīng)用于鑒定腫瘤預(yù)后相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)[6-7]。回顧以往關(guān)于LUAD生物信息學(xué)分析的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)LUAD預(yù)后研究大多是基于基因組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)所作的預(yù)測，鮮有基于蛋白組學(xué)預(yù)后研究。因此，本研究從蛋白表達(dá)水平對LUAD預(yù)后進(jìn)行分析，通過構(gòu)建蛋白預(yù)后模型，以期提高對LUAD預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性，為LUAD的臨床診斷、治療及預(yù)后提供重要的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)獲取 從TCPA數(shù)據(jù)庫(https://tcpaportal.org/tcpa/)及TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 分別下載232個(gè)原發(fā)性肺腺癌的RPPA第4 級蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)及患者臨床數(shù)據(jù)，包括性別、年齡、TNM分期等臨床信息，用于后期結(jié)合患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后綜合分析，對患者進(jìn)行篩選，剔除臨床信息不全的肺腺癌患者(包括TNM分期、年齡、性別不明的患者)；利用 R 軟件(4.0.0版本)中的 knn法對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)缺。

1.2預(yù)后蛋白質(zhì)確定及模型構(gòu)建 首先將蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)與患者生存時(shí)間進(jìn)行合并，通過R軟件“survival”包循環(huán)對每個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行單因素Cox回歸分析， 若P<0.05則判定該蛋白質(zhì)與肺腺癌的預(yù)后相關(guān)，若風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio, HR)>1，該蛋白視為高風(fēng)險(xiǎn)蛋白，若HR<1則該蛋白視為低風(fēng)險(xiǎn)蛋白，并利用R軟件的“ggplot2”包繪制火山圖對所有與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化；然后利用逐步回歸分析對所得的預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以剔除多重共線性變量。對逐步回歸分析篩選出的蛋白質(zhì)則進(jìn)行多因素Cox預(yù)后模型構(gòu)建，并以風(fēng)險(xiǎn)評分進(jìn)行展示：風(fēng)險(xiǎn)評分=(蛋白質(zhì)系數(shù)1×蛋白質(zhì)1表達(dá))+(蛋白質(zhì)系數(shù)2×蛋白質(zhì)2表達(dá))+(蛋白質(zhì)系數(shù)n×蛋白質(zhì)n表達(dá))。

1.3預(yù)后模型的生存分析 計(jì)算患者風(fēng)險(xiǎn)評分，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分的中位數(shù)可將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(風(fēng)險(xiǎn)評分大于中位風(fēng)險(xiǎn)評分)和低風(fēng)險(xiǎn)組(風(fēng)險(xiǎn)評分小于中位風(fēng)險(xiǎn)評分)，利用R軟件“pheatmap”包根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分對樣品進(jìn)行可視化，對風(fēng)險(xiǎn)評分與蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)繪制風(fēng)險(xiǎn)熱圖；利用R軟件的“survival”包分別對高低風(fēng)險(xiǎn)組患者進(jìn)行生存分析，若P<0.05,則視兩組患者具有生存差異。

1.4獨(dú)立預(yù)后及ROC分析評估模型有效性 將臨床變量及風(fēng)險(xiǎn)評分與生存時(shí)間進(jìn)行整合，利用R軟件 “survival”包對臨床變量及風(fēng)險(xiǎn)評分進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析以評估預(yù)測模型風(fēng)險(xiǎn)評分是否能成為獨(dú)立的預(yù)后因素，結(jié)果通過森林圖進(jìn)行可視化。利用R軟件“survivalROC”包對蛋白質(zhì)評分模型及肺腺癌患者的臨床變量進(jìn)行ROC分析并繪制ROC曲線。

1.5構(gòu)建預(yù)測列線圖 通過整合臨床變量及評分模型數(shù)據(jù)，包括患者風(fēng)險(xiǎn)評分、年齡、性別及腫瘤分期，利用R軟件的“rms”包構(gòu)建列線圖，以實(shí)現(xiàn)多變量綜合預(yù)測，此外，利用bootstrap方法(1 000次循環(huán))構(gòu)建校準(zhǔn)曲線，顯示預(yù)測值與實(shí)際發(fā)生概率之間的偏差，以評估列線圖對1、2、3年LUAD患者生存率的預(yù)測效果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用R軟件(4.0.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)的差異分析通過兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)完成；生存分析組間比較的方法采用Kaplan-Meier方法；模型的構(gòu)建、 獨(dú)立預(yù)后分析均通過多因素Cox分析完成；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1預(yù)后蛋白質(zhì)確定及模型構(gòu)建 研究共納入232例肺腺癌患者，見表1。單因素Cox分析得到21個(gè)蛋白質(zhì)與肺腺癌預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，見表2，并繪制火山圖對結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖1。隨后通過逐步向后回歸分析得到3個(gè)與生存顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)(PAI1、TFRC、LCN2A)，并通過多因素Cox分析獲得每個(gè)蛋白質(zhì)對應(yīng)的系數(shù)，風(fēng)險(xiǎn)評分=(0.215×PAI1表達(dá)量)+(0.241×TFRC表達(dá)量)+(0.207×LCN2A表達(dá)量)，見表3。

2.2預(yù)后模型的生存分析 風(fēng)險(xiǎn)熱圖顯示，蛋白質(zhì)PAI1、TFRC、LCN2A在高風(fēng)險(xiǎn)組為高表達(dá)，見圖2A；風(fēng)險(xiǎn)曲線顯示，隨著患者生存風(fēng)險(xiǎn)評分的遞增其對應(yīng)的模型風(fēng)險(xiǎn)評分相應(yīng)增加，見圖2B；生存狀態(tài)圖顯示，隨著患者生存風(fēng)險(xiǎn)評分的增加患者生存率下降，見圖2C。

表1 TCGA肺腺癌患者的臨床變量

表2 基于單因素Cox回歸分析的21個(gè)生存相關(guān)蛋白質(zhì)

圖1 21個(gè)生存相關(guān)蛋白質(zhì)火山圖

表3 用于預(yù)后模型構(gòu)建的蛋白質(zhì)及其風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)

圖2 預(yù)后模型風(fēng)險(xiǎn)熱圖(A)、風(fēng)險(xiǎn)曲線(B)及生存狀態(tài)(C)

通過對預(yù)測模型風(fēng)險(xiǎn)評分進(jìn)行生存分析，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組總體生存率較低(P<0.001)，見圖3。

圖3 預(yù)后模型蛋白質(zhì)及風(fēng)險(xiǎn)評分生存分析

2.3獨(dú)立預(yù)后及ROC分析評估模型有效性 單因素(圖4A)和多因素Cox(圖4B)回歸分析表明風(fēng)險(xiǎn)評分可作為肺腺癌獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)；通過ROC曲線可看出風(fēng)險(xiǎn)評分模型相較于傳統(tǒng)的臨床特征具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度，見圖4C。

圖4 預(yù)后模型獨(dú)立預(yù)后及ROC分析

2.4創(chuàng)建預(yù)測列線圖 通過整合臨床因素(年齡、性別、分期)和模型公式構(gòu)建了預(yù)測列線圖，見圖5；該預(yù)后模型C指數(shù)為0.710，1、2、3年的校準(zhǔn)曲線顯示列線圖預(yù)測效果較佳，見圖6。

圖5 肺腺癌患者1、2、3年總生存率的列線圖

圖6 預(yù)測總生存率的校準(zhǔn)曲線

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制提供了新的思路。與正常組織相比，腫瘤組織具有獨(dú)特的蛋白質(zhì)表達(dá)。目前研究表明，腫瘤獨(dú)特蛋白質(zhì)表達(dá)不僅可以作為預(yù)測腫瘤預(yù)后因子，還可以作為未來生物治療的有效靶點(diǎn)[8]。本研究通過生物信息學(xué)分析肺腺癌蛋白質(zhì)表達(dá)，構(gòu)建了一種包含3個(gè)蛋白質(zhì)(PAI1、TFRC、LCN2A)預(yù)后模型，該模型可以有效地對生存進(jìn)行分層，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組總體生存率明顯降低。ROC分析及獨(dú)立預(yù)后結(jié)果顯示：該模型對患者預(yù)后具有良好的預(yù)測價(jià)值，是患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。本研究進(jìn)一步結(jié)合患者的年齡、性別、腫瘤分期和風(fēng)險(xiǎn)評分構(gòu)建預(yù)測列線圖，通過在總積分軸和每個(gè)預(yù)后軸之間畫一條垂直線計(jì)算肺腺癌患者1、2 、 3 年的生存率，這種定量直觀預(yù)測肺腺癌預(yù)后的方法將更有助于提高早期判斷肺腺癌患者預(yù)后和制定合理的臨床治療決策。

本研究建立的預(yù)后預(yù)測模型中，蛋白質(zhì)PAI1、TFRC、LCN2A在高風(fēng)險(xiǎn)組呈高表達(dá)，而且隨著患者生存風(fēng)險(xiǎn)評分的增加患者生存率下降，提示與肺腺癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中PAI1的表達(dá)水平高于正常肺組織，與肺腺癌總生存率呈負(fù)相關(guān)[9]。PAI1 通過抑制 caspase-3保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療引起的細(xì)胞凋亡[10]。TFRC在肺癌[11]、乳腺癌[12]、卵巢癌[13]、結(jié)腸癌[14]、胰腺癌[15]中高度表達(dá)且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[13]證實(shí)TFRC的敲除能抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,并且通過正向調(diào)控 AXIN2的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，推斷TFRC很可能是一個(gè)促癌蛋白。LCN2A的過表達(dá)與乳腺癌[16]、胰腺癌[17]、肺癌[18]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[19]和膽管癌[20]的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其潛在機(jī)制可能是LCN2A的過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對鐵的吸收和對化療的抵抗。因此，PAI1 、TFRC和LCN2A作為預(yù)后模型評價(jià)指標(biāo)具有重要意義，這些蛋白質(zhì)均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本模型中TFRC和LCN2A促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對鐵攝取和吸收幫助腫瘤細(xì)胞生長，共同證明鐵代謝途徑在促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展方面具有獨(dú)特的意義，有望成為治療肺腺癌的獨(dú)特蛋白靶點(diǎn)。運(yùn)用鐵偶聯(lián)劑調(diào)節(jié)腫瘤的鐵負(fù)荷是目前抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[21]。

本研究集中于多個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)后模型分析，而不僅僅局限于單個(gè)蛋白質(zhì)分析，該分析結(jié)果具有重要的臨床指導(dǎo)意義；模型中PAI1、TFRC、LCN2A蛋白有望成為評估肺腺癌治療預(yù)后新的因子，并對肺腺癌的實(shí)驗(yàn)研究提供一個(gè)重要的研究方向，有望為肺腺癌的診治提供新的靶點(diǎn)。本研究局限性在于目前有關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的公共數(shù)據(jù)庫少，尚未建立蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，有待實(shí)驗(yàn)證據(jù)及真實(shí)世界人群進(jìn)一步驗(yàn)證。