董建斐，張 璐，王雅婷，徐 輝，趙靈燕，謝榮輝

(浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310018)

自2018年我國發(fā)生非洲豬瘟以來，生物安全措施迅速得到提升，消毒劑使用不斷增加，但各種消毒劑對(duì)非洲豬瘟病毒消毒效果還有待于進(jìn)一步評(píng)估研究。豬偽狂犬病病毒和非洲豬瘟病毒均為DNA病毒，兩者分子結(jié)構(gòu)和理化特性非常相似，其中豬偽狂犬病病毒能在多種細(xì)胞中增殖，是一個(gè)很好的模式病毒[1]，由于非洲豬瘟屬于高致病性動(dòng)物病原微生物，許多實(shí)驗(yàn)室因生物安全級(jí)別不夠不能開展病毒培養(yǎng)和消毒效果的研究，同時(shí)消毒劑對(duì)偽狂犬病病毒消毒效果的評(píng)價(jià)，也可在實(shí)際生產(chǎn)過程中為非洲豬瘟消毒劑的選擇和使用提供依據(jù)。

目前雖然豬偽狂犬病疫苗大規(guī)模使用于養(yǎng)殖場(chǎng)，并有效地遏制了偽狂犬病的暴發(fā)和區(qū)域化流行，但仍有疫苗免疫豬場(chǎng)發(fā)生豬偽狂犬病[2-6]，徹底根除和凈化豬偽狂犬病還需采取消毒等生物安全措施。當(dāng)前仍有許多養(yǎng)殖場(chǎng)使用消毒劑作為預(yù)防和控制偽狂犬病等病毒性疫病發(fā)生的主要手段之一。為了正確指導(dǎo)豬偽狂犬病病毒消毒工作，消毒劑的選擇至關(guān)重要。本試驗(yàn)旨在對(duì)常用獸用消毒劑滅活偽狂犬病病毒的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用提供常用獸用消毒劑稀釋濃度和消毒效果數(shù)據(jù)。以GFP標(biāo)記的gE/TK雙基因缺失的偽狂犬病病毒為模式病毒，評(píng)估了碘酸混合液、戊二醛癸甲溴銨溶液和二氯異氰尿酸鈉3種獸用消毒劑對(duì)偽狂犬病病毒的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用消毒劑碘酸混合液(20200404)、戊二醛癸甲溴銨溶液(20200204)和二氯異氰尿酸鈉(20190410)均為國內(nèi)市售產(chǎn)品。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、鏈霉素和青霉素雙抗溶液均為Gibco產(chǎn)品。GFP標(biāo)記的gE/TK雙基因缺失的偽狂犬病病毒(以下簡(jiǎn)稱重組偽狂犬病弱病毒)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1重組偽狂犬病弱病毒擴(kuò)增和病毒懸液制備 吸取0.1 mL病毒液至生長(zhǎng)有單層BHK21細(xì)胞的75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入30 mL含3%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變和細(xì)胞中的綠色熒光，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%-90%時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于-80 ℃凍融三次，1000 rpm離心10 min，吸取上清后加入胎牛血清使病毒液中的胎牛血清達(dá)到10%，病毒液分裝于2 mL保存管，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2重組偽狂犬病弱病毒滴度測(cè)定 將擴(kuò)增后的重組偽狂犬病病毒用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋，分別接種于生長(zhǎng)有單層BHK21細(xì)胞(96孔板)中，每個(gè)稀釋度接種8孔，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光，連續(xù)觀察5 d，按Reed-Muench法計(jì)算該病毒的半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)。

1.2.3病毒滅活試驗(yàn) 試驗(yàn)組用PBS將消毒劑稀釋成不同濃度，取重組偽狂犬病病毒液與等量不同濃度的消毒劑混合，分別在室溫(24 ℃)、37 ℃和4 ℃環(huán)境下作用一定時(shí)間(2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 40 min)后，立即用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋100倍，將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出并用PBS洗二次，將上述稀釋好的消毒劑與病毒混合液加入相應(yīng)孔(24孔板)中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附1-2 h，然后將液體吸出，PBS清洗二次后加入含3%胎牛血清的DMEM溶液，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在熒光顯微境下觀察細(xì)胞中的熒光。陽性對(duì)照組為200倍稀釋的重組偽狂犬病病毒液，消毒劑為最高濃度消毒液經(jīng)100倍稀釋后與等量100倍稀釋后的混合液。陰性對(duì)照組為經(jīng)200倍稀釋后的最高濃度的消毒劑。

1.2.4滅活率計(jì)算 病毒滅活率=[(對(duì)照組病毒含量-消毒劑組病毒含量)/對(duì)照組病毒含量]×100%。若消毒劑滅活病毒不徹底，則按1.2.2方法測(cè)定滅活前后病毒的TCID50的變化計(jì)算滅活率。

2 結(jié)果

2.1戊二醛癸甲溴銨溶液對(duì)偽狂犬病病毒的滅活效果 結(jié)果顯示，在常溫(20 ℃)下0.2%戊二醛癸甲溴銨溶液與偽狂犬病病毒作用5 min，就可將其完全滅活；而在低溫環(huán)境下，0.2%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用40 min仍未能徹底滅活病毒，表明該消毒劑受溫度的影響較大。

表1 戊二醛癸甲溴銨溶液對(duì)偽狂犬病病毒滅活效果

2.2碘酸混合溶液對(duì)偽狂犬病病毒的滅活效果 結(jié)果顯示，在常溫(20 ℃)下0.05%的碘酸混合溶液作用10 min方可完全滅活偽狂犬病病毒，但37 ℃環(huán)境下0.05%的碘酸混合溶液5 min即可完全滅活偽狂犬病病毒。由于0.1%和0.2%的碘酸混合液對(duì)細(xì)胞毒性較大，接種消毒劑和病毒混合液后細(xì)胞脫落和發(fā)生淍亡，無法判定病毒的感染狀況。

2.3二氯異氰尿酸鈉對(duì)偽狂犬病病毒的滅活效果 結(jié)果顯示，在常溫(20 ℃)下，有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液作用20 min可完全滅活偽狂犬病病毒，而在37 ℃環(huán)境下有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液作用10 min即可完全滅活偽狂犬病病毒，在4 ℃環(huán)境下有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液作用40 min仍未完全滅活偽狂犬病病毒，表明該消毒劑對(duì)病毒的滅活效果受溫度影響。

表2 碘酸混合溶液對(duì)偽狂犬病病毒滅活效果

表3 二氯異氰尿酸鈉溶液對(duì)偽狂犬病病毒滅活效果

3 討論

目前市場(chǎng)所售的獸用消毒劑可分為鹵素類消毒劑、氧化劑類消毒劑、醛類消毒劑、醇類、酚類消毒劑、酸堿類消毒劑和表面活性劑類消毒劑等多種類型的消毒劑[7]，其中以鹵素類、醛類和酸堿類消毒劑最為常用。本研究選用養(yǎng)殖場(chǎng)常用的3種三類獸用消毒劑，并分別評(píng)估了其對(duì)偽狂犬病病毒的滅活效果。

戊二醛癸甲溴銨溶液是一種新型復(fù)方消毒劑，癸甲溴銨為雙鏈季銨鹽消毒劑，其季銨陽離子與病原體胞漿膜磷脂中帶負(fù)電荷的磷酸基結(jié)合，使其通透性改變，此外其對(duì)親脂性病毒也有一定作用,可協(xié)同戊二醛更易進(jìn)入病毒內(nèi)部，破壞蛋白質(zhì)和酶活性，溴離子使分子的親水性和親脂性增強(qiáng)，達(dá)到快速高效的消毒作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在常溫和37 ℃下0.2%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用5 min可將偽狂犬病病毒完全滅活，這與說明書推薦的在疫情發(fā)生時(shí)所用消毒濃度(0.1%-0.2%)相符。而在低溫環(huán)境下，作用30 min仍未將病毒滅活，表明該消毒劑消毒效果受到環(huán)境影響較大，應(yīng)引起重視。研究顯示該消毒劑對(duì)不同種類病毒的滅活效果存在差異。有研究顯示常溫下濃度為0.01%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用20 min可在體外完全殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒[9]，0.1%戊二醛癸甲溴銨溶液作用30 min可將H7N9亞型流感病毒完全滅活[10]，而本研究顯示0.1%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用30 min卻不能完全滅活偽狂犬病病毒，表明針對(duì)不同病原體應(yīng)選擇合理的作用濃度，必要時(shí)需增加消毒劑的濃度。

二氯異氰尿酸鈉由于殺菌消毒能力強(qiáng)，毒性低和穩(wěn)定性高，目前已廣泛使用于養(yǎng)殖業(yè)。其主要作用原理為使病原體蛋白質(zhì)變性，改變膜通透性，干擾酶系統(tǒng)生理生化及影響DNA合成等過程，使病原體死亡。研究顯示該消毒劑對(duì)不同病毒的滅菌效果存在著差異，有效氯濃度為100 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min可完全滅活豬圓環(huán)病毒2型[11]，有效氯濃度為25 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min即可完全滅活豬粘病毒[12]，本研究顯示在常溫下有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用30 min方可完全滅活偽狂犬病病毒。研究顯示常溫下有效氯為200 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min對(duì)偽狂犬病病毒滅活率大于99.99%，與生產(chǎn)商疫源地消毒推薦濃度為200 mg/L相符。但在4 ℃環(huán)境下有效氯為200 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min對(duì)偽狂犬病病毒的滅活率只有99.98%。按照國內(nèi)消毒劑檢測(cè)規(guī)定，用殺滅率來表示消毒效果時(shí)，消毒劑對(duì)病毒殺滅率須大于99.99%才為消毒合格，應(yīng)引起重視。本試驗(yàn)中的病毒是完全浸泡在一定濃度下的消毒劑中，與實(shí)際應(yīng)用環(huán)境有所差別，為確保消毒效果在低溫狀況下應(yīng)適當(dāng)增加二氯異氰尿酸鈉的濃度。因此，在低溫環(huán)境下對(duì)存在偽狂犬病病毒等抵抗力較強(qiáng)的病原體的疫源地消毒時(shí)推薦使用有效氯為400 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液。

碘酸混合液主要通過碘化和氯化酶體蛋白活性基團(tuán)，并與蛋白的氨基結(jié)合而導(dǎo)致蛋白變性和抑制菌體的代謝酶系統(tǒng)。本研究顯示按說明書推薦濃度使用1：300倍稀釋使用時(shí)，在低溫和常溫下均可迅速滅活豬偽狂犬病病毒，具有良好滅活效果,但在1：100和1：200倍稀釋的狀況下對(duì)細(xì)胞的毒性較大，接種消毒劑與病毒混合液后，細(xì)胞易脫落和凋亡,難以觀察病毒感染細(xì)胞的狀況，從理論上濃度高的消毒劑更易滅活病原體，但在對(duì)活體皮膚等消毒時(shí)應(yīng)引起重視，避免應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。

本研究結(jié)果為實(shí)驗(yàn)條件下得出的結(jié)果，在養(yǎng)殖業(yè)實(shí)際使用過程中由于受糞便等有機(jī)物的干擾，其消毒效果可能有所降低。因此，在養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行消毒前應(yīng)先進(jìn)行清掃和沖洗，減少有機(jī)物的干擾以提高消毒劑對(duì)病原微生物的滅活作用，并且在冬季等低溫天氣應(yīng)適當(dāng)提高消毒劑濃度和作用時(shí)間。