朱 海 王 一 賀奕博 俞衛(wèi)鋒

（1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院麻醉科 上海 200438；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院麻醉科 上海 200127；3上海市普陀區(qū)婦嬰保健院病理科，4麻醉科 上海 200062）

子宮內(nèi)膜異位癥（以下簡稱內(nèi)異癥）是一種常見的、以疼痛為典型癥狀的婦科臨床疾病，通常伴有不孕癥。子宮內(nèi)膜異位病變組織和腹膜液中存在由一系列炎癥細胞、細胞因子和趨化因子的異常改變而形成的炎癥微環(huán)境［1-2］。內(nèi)異癥引起的疼痛可能與內(nèi)異癥病灶周期性出血引起的局部炎癥反應(yīng)、病灶異常生長導(dǎo)致的外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)敏感引起的疼痛敏化以及腹腔內(nèi)慢性炎癥相關(guān)［3］。多項研究顯示，來自炎癥性子宮內(nèi)膜病變的持續(xù)傷害導(dǎo)致了感覺傳入的持久中樞敏化［4-5］。目前，內(nèi)異癥引起疼痛的具體機制尚不清楚。瞬時受體電位香草酸1（transient receptor potential cation channel subfamilyⅤmember 1，TRPV1）在結(jié)構(gòu)上與有毒熱感和電壓門控鈣、鈉、鉀通道有關(guān)［6］。瞬時受體電位錨定蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）為TRPV1的受體，在結(jié)構(gòu)上與非選擇性陽離子通道相關(guān)，主要位于辣椒素敏感的肽感覺神經(jīng)元上［7］。TRPA1作為細胞損傷信號的傳感器，參與炎癥和免疫反應(yīng)，在刺激（癢）或疼痛的感覺中介導(dǎo)物理和化學(xué)刺激的轉(zhuǎn)換［8］。TRPV1與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）等導(dǎo)致的慢性疼痛疾病相關(guān)［9］，可增強和整合對疼痛誘導(dǎo)刺激的反應(yīng)，如酸中毒、氧化應(yīng)激或炎癥介質(zhì)［10］。TRPV1/TRPA1異構(gòu)體在感知環(huán)境危害以及增強炎癥疼痛感方面發(fā)揮重要作用，可以促進持續(xù)性疼痛［11］。Fattori等［12］研究顯示，內(nèi)異癥疼痛模型小鼠的病變組織中存在降鈣素基因相關(guān)肽、TRPA1和TRPV1表達的神經(jīng)纖維。內(nèi)異癥還可激活表達TRPA1和TRPV1的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（nuclear factor kappa B subunit 1，NF-κB）中的信號通路。

本研究擬通過植入的方法建立小鼠內(nèi)異癥模型，聯(lián)合TRPA1激動劑肉桂醛（cinnamaldehyde）和TRPA1拮 抗 劑HC-030031，探 討TRPA1/TRPV1異聚體在小鼠內(nèi)異癥子宮內(nèi)膜組織中的表達情況，分析TRPA1/TRPV1異聚體與內(nèi)異癥縮宮素介導(dǎo)疼痛的相關(guān)性，同時驗證TRPA1和TRPV1對炎癥因子的影響作用。

材料和方法

試劑及儀器戊酸雌二醇、縮宮素［阿拉丁試劑（上海）有限公司］，Cinnamaldehyde、HC030031（美國Sigma-Aldrich公司），TRPV1、TRPA1多克隆抗體（德國Novus公司），β-actin抗體（英國Abcam公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司），HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）和SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑（美國Thermo公 司），小 鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2 ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。實時熒光定量PCR儀（型號：QuantStudio 6，美國ABI公司），正置熒光顯微鏡（型號：Eclipse C1，日本Nikon公司），水平電泳儀（型號：JY300，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

內(nèi)異癥模型建立及動物分組28只BALB/c雌性小鼠（8周齡，18～21 g）購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2017-0005。所有動物實驗經(jīng)上海市普陀區(qū)婦嬰保健院倫理委員會批準，批準號：2016倫審第（1）號。實驗時間為2017年10月至2018年10月，動物均在SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，12 h/12 h光暗周期。將28只小鼠隨機選取8只作為供體組，造模前1周供體組皮下注射戊酸雌二醇（0.2 mg/只），1周后對小鼠實施安樂死后將其以仰臥位固定于手術(shù)臺，沿正中線剖開腹腔，分離雙側(cè)子宮系膜，除去漿膜和子宮肌層，生理鹽水反復(fù)漂洗，去除子宮表面的血跡，分離子宮系膜，在生理鹽水中切碎子宮內(nèi)膜（碎片≤1 mm3），全程保持無菌操作，將切碎的子宮內(nèi)膜經(jīng)18號針頭注射到實驗組小鼠腹腔內(nèi)。取臍下偏正中線處的左下腹為進針點（0.5 mL/只），1只供體小鼠對應(yīng)2只受體小鼠，構(gòu)建內(nèi)異癥小鼠模型，每個模型操作時間限制為5 min［13］。

將20只實驗組小鼠分為4組：假手術(shù)組（Sham）、模 型 組（Model）、肉 桂 醛+模 型 組（Model+Cinnamaldehyde）和TRPA1拮抗劑+模型組（Model+HC030031），每組5只。內(nèi)異癥小鼠模型建立1天后，模型組給予灌胃溶劑；肉桂醛+模型組給予灌胃肉桂醛（10 mg/kg），每3天1次；TRPA1拮抗劑+模型組給予灌胃HC-030031（2.5 μg/kg），每天1次。給藥2周，繼續(xù)飼養(yǎng)2周。稱重、處死并解剖小鼠，取異位子宮內(nèi)膜病灶，收集血清和腹腔灌洗液。

疼痛行為學(xué)建模（給藥）后7、14、21和28天腹腔注射縮宮素20 IU/kg，觀察30 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體反應(yīng)，記錄扭體次數(shù)。

實時熒光定量PCR檢測小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1的基因表達取100～200 mg組織塊，研缽里磨碎（加液氮輔助），磨碎的組織放入1.5 mL無RNA酶EP管 中，加 入1 mLTrizol浸 泡，混合均勻，用于抽提或-20℃凍存。按照Trizol提取試劑使用說明抽提組織中的總RNA，根據(jù)操作說明書RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)目的基因序列信息設(shè)計并合成qPCR檢測引物（表1）。

表1 RT-PCR檢測引物信息表Tab 1 Primer sequence for RT-PCR

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用目的基因特異性引物和內(nèi)參引物擴增待檢測的目的基因片段和看家基因，將樣品放入IQ5熒光定量PCR儀，SYBR Green法熒光定量PCR以分析各基因的表達，用ΔΔCt法定量各基因的相對表達。

免疫熒光檢測小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達和定位小鼠子宮內(nèi)膜組織經(jīng)多聚甲醛固定、脫水和石蠟包埋后切片（5 μm）。切片脫蠟后進行抗原修復(fù)，PBS洗滌3次，每次5 min。切片上滴加BSA，室溫孵育1 h。去除封閉液，切片上滴加PBS配備的一抗，分別孵育抗體TRPA1（1∶500）和TRPV1（1∶500）。切片平放于 濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。次日，置于PBS（pH=7.4）中脫色，PBS洗滌3次，每次5 min。切片干燥后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光標記二抗覆蓋組織，室溫孵育1 h。于PBS中脫色，洗滌3次，每次5 min。切片干燥后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察切片并采集圖像。

ELISA檢測小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的表達稱取標本，加入PBS，用液氮迅速冷凍，保存?zhèn)溆谩吮救诨蟊３?～8℃，加入PBS，勻漿充分，2 000～3 000×g離心20 min，收集上清。按ELISA試劑盒說明書進行樣品檢測，計算細胞因子濃度。

Western blot檢測小鼠子宮內(nèi)膜中TRPV1/TRPA1的蛋白表達用PBS清洗小鼠子宮內(nèi)膜組織，加適量液氮研磨，充分研磨后將組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管；加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑200 μL裂解蛋白，混勻冰浴40～60 min；4℃下11 000×g離心15 min，提取蛋白裂解液上清；采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測定蛋白質(zhì)濃度；根據(jù)濃度測定結(jié)果對蛋白濃度進行調(diào)整，保證不同組別間蛋白濃度一致；用樣品將6×上樣緩沖液稀釋成1×上樣緩沖液，煮沸5 min，于-80℃保存；蛋白用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）12%分離膠（5%濃縮膠）電泳分離，電泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，增強型化學(xué)發(fā)光劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，凝膠電泳儀成像，用Image J軟件進行條帶灰度分析。

統(tǒng)計學(xué)分析各組樣本qPCR檢測至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 8.0軟件分析；免疫熒光相對定量用Image-Pro Plus軟件分析。Western blot結(jié)果用Image J（USA）軟件分析。兩組間差異分析用非配對t檢驗；3組及以上的組間差異比較用單因素方差分析。結(jié)果用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

內(nèi)異癥小鼠疼痛行為學(xué)實驗建立小鼠內(nèi)異癥模型，探討TRPV1/TRPA1異構(gòu)體在內(nèi)異癥疼痛中的作用，并在小鼠體內(nèi)進行催產(chǎn)素誘導(dǎo)的扭體實驗（表2）。催產(chǎn)素誘導(dǎo)的內(nèi)異癥小鼠扭動頻率相比對照組顯著增加，肉桂醛進一步放大了這一現(xiàn)象，HC-030031則減弱了內(nèi)異癥小鼠的扭動頻率。

表2 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠扭體實驗數(shù)據(jù)Tab 2 Number of body-twisting frequency in mice with endometriosis （±s）

表2 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠扭體實驗數(shù)據(jù)Tab 2 Number of body-twisting frequency in mice with endometriosis （±s）

（1）vs.Sham group，P＜0.01；vs.Model group，（2）P＜0.05，（3）P＜0.01.

Group Sham Model Model+Cinnamaldehyde Model+HC-030031 28 d 4.8±2.2 26.0±2.1（1）35.2±6.2（1）（2）17.2±5.3（1）（2）0 d 5.6±1.1 22.8±4.9（1）23.0±1.2（1）20.8±3.7（1）7 d 4.8±1.3 23.6±3.5（1）30.0±3.5（1）（2）21.0±2.2（1）14 d 6.2±1.6 25.2±3.3（1）31.2±3.7（1）（2）16.4±2.7（1）（3）21 d 4.6±1.1 25.8±2.3（1）34.2±5.8（1）（2）17.0±4.2（1）（2）

qPCR檢測小鼠子宮內(nèi)膜TRPV1/TRPA1 mRNA表達qPCR檢測小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1 mRNA表達結(jié)果如圖1所示。與假手術(shù)組相比，模型組，肉桂醛+模型組以及TRPA1拮抗劑+模型組的TRPV1 mRNA表達顯著上調(diào)；肉桂醛和HC-030031對模型組TRPV1 mRNA表達的作用不顯著（圖1A）。與假手術(shù)組相比，模型組、肉桂醛+模型組的TRPA1 mRNA表達顯著上調(diào)；肉桂醛顯著上調(diào)模型組的TRPA1 mRNA表達，而HC-030031顯著抑制模型組的TRPA1 mRNA表達（圖1B）。

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1 mRNA表達Fig 1 Expression of TRPV1/TRPA1 mRNA in endometrial tissues of mice in each group

Western blot檢測小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達與假手術(shù)組相比，模型組、肉桂醛+模型組和TRPA1拮抗劑+模型組的TRPV1蛋白表達顯著上調(diào)；肉桂醛和HC-030031對模型組TRPV1蛋白表達的作用不顯著（圖2A、2B）。與假手術(shù)組相比，模型組、肉桂醛+模型組的TRPA1蛋白表達顯著上調(diào)，肉桂醛顯著上調(diào)模型組的TRPA1蛋白表達，而HC-030031顯著抑制模型組TRPR1蛋白表達（圖2A、2C）。

圖2 各組小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達Fig 2 Protein level of TRPV1/TRPA1 in endometrial tissues of mice in each group

ELISA檢測各組小鼠血清及腹腔沖洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量與假手術(shù)組相比，模型組小鼠血清（圖3A～3D）以及腹腔沖洗液（圖3E～3H）中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的 含量顯著升高；肉桂醛進一步促進上述作用，而HC-030031顯著抑制模型組小鼠血清以及腹腔沖洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量升高。

圖3 ELISA檢測各組小鼠外周血和腹腔灌洗液的炎性因子含量Fig 3 Concentrations of inflammatory cytokines in serum and peritoneal irrigation fluid of mice in each group

免疫熒光檢測各組小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達共定位如圖4所示，肉桂醛+模型組小鼠內(nèi)異癥組織中TRPV1伴TRPA1蛋白含量最高；與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的TRPV1/TRPA1共表達顯著上調(diào)；TRPA1拮抗劑+模型組及假手術(shù)組小鼠的TRPV1/TRPA1蛋白表達最低，這提示TRPV1/TRPA1異構(gòu)體可能與小鼠內(nèi)異癥疼痛呈正相關(guān)。

圖4 免疫熒光檢測各組小鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPV1/TRPA1蛋白表達共定位Fig 4 Co-localization of TRPV1/TRPA1 protein expression in endometrial tissues of mice in each group

討 論

內(nèi)異癥是一種雌激素依賴性炎癥性疾病，疼痛為內(nèi)異癥患者主要的臨床癥狀之一，即使經(jīng)過治療，疼痛仍然持續(xù)。內(nèi)異癥相關(guān)疼痛的多種機制包括痛覺敏化、炎癥和外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛處理的改變。免疫細胞分泌的細胞因子（如IL-1β、IL-6和TNFα等）分布在腹膜液中可能對內(nèi)異癥起到促痛劑的作用，直接引起TRPV1通道的興奮性改變，使得周圍神經(jīng)敏感，或引發(fā)復(fù)雜的反饋作用，放大微環(huán)境炎癥反應(yīng)和疼痛的產(chǎn)生［14］。TRPV1和TRPA1是在炎癥信號通路中起關(guān)鍵作用的陽離子通道，在內(nèi)異癥相關(guān)疼痛中的作用機制尚未可知。我們通過構(gòu)建內(nèi)異癥小鼠模型，結(jié)合TRPA1抑制劑和激動劑，分析TRPA1/TRPV1異聚體對內(nèi)異癥小鼠疼痛和炎性因子的影響，為內(nèi)異癥相關(guān)疼痛的治療提供科學(xué)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，TRPV1/TRPA1異構(gòu)體在內(nèi)異癥小鼠中表達上調(diào)；TRPA1激動劑肉桂醛對內(nèi)異癥引起的小鼠疼痛的減輕作用較?。籘RPA1抑制劑HC-030031對內(nèi)異癥引起的小鼠疼痛的減輕作用更為顯著，說明TRPV1/TRPA1異構(gòu)體的形成可能與內(nèi)異癥小鼠縮宮素誘導(dǎo)的疼痛有關(guān)。肉桂醛進一步促進內(nèi)異癥小鼠血清及腹腔灌洗液炎癥因子含量，而HC-030031則對其有顯著抑制作用，提示TRPV1/TRPA1異聚體可能有利于感知響應(yīng)炎癥微環(huán)境，進行信號傳導(dǎo)，增強疼痛感。

研究表明，抑制TRPV1和TRPA1通道可通過線粒體裂變/融合蛋白抑制Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB和NLR家 族Pyrin域 蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）/caspase-1通路起到抗肺部炎癥的作用［15］。另一項研究得出類似結(jié)果，即TRPV1和TRPA1通道抑制劑能夠減少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［16］。TRPA1以 及TRPV1在結(jié)構(gòu)上與非選擇性陽離子通道相關(guān)，主要位于辣椒素敏感肽能感覺神經(jīng)元［7］。TRPV1和TRPA1通道可以響應(yīng)炎癥因子、熱刺激物等，被激活后可將外周信號傳輸?shù)街袠械榷嗤ǖ?，從而誘導(dǎo)啟動慢性炎癥疾病的免疫系統(tǒng)反應(yīng)［17］。TRPV1和TRPA1在感知環(huán)境危害以及增強炎癥疼痛感方面發(fā)揮重要作用。研究證實TRPV1-TRPA1相互作用可能形成主要依賴于鈣離子的異質(zhì)通道［18］?？缒さ鞍?00與TRPA1和TRPV1共表達并形成復(fù)合物，選擇性增強TRPA1活性，并削弱TRPA1和TRPV1的關(guān)聯(lián)，而TRPA1和TRPV1是關(guān)鍵的疼痛 介 質(zhì)［11］。包 括TRPV1和TRPA1在 內(nèi)的 瞬 時 感受器電位通道已成為炎癥性疼痛的潛在傳感器和轉(zhuǎn)導(dǎo)器。TRPV1/TRPA異聚體調(diào)節(jié)內(nèi)異癥疼痛的潛在機制需進一步體內(nèi)外研究證明［19］。

研究顯示，內(nèi)異癥可分為免疫優(yōu)勢期和激素優(yōu)勢期兩個階段。內(nèi)異癥的早期起始階段（72 h以內(nèi)）在很大程度上受到先天免疫系統(tǒng)的調(diào)控。在內(nèi)異癥早期的動物模型中，炎癥因子和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA和蛋白水平均升高，但這種變化與雌二醇治療無關(guān)。同時炎癥細胞通過非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴的方式被招募到腹腔。子宮內(nèi)膜異位早期階段免疫系統(tǒng)信號主導(dǎo)雌二醇介導(dǎo)的信號，隨后可能出現(xiàn)激素占主導(dǎo)地位的發(fā)展階段［20］。Krisztina等［20］研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可能通過調(diào)節(jié)炎癥細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子而上調(diào)大鼠子宮內(nèi)膜組織中TRPA1和TRPV1的表達。本研究表明內(nèi)異癥小鼠外周血和腹腔灌洗液炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量增加，TRPA1抑制劑HC-030031顯著抑制炎性因子的表達，尚缺乏TRPA1和TRPV1在臨床內(nèi)異癥樣本中的表達數(shù)據(jù)以及細胞功能驗證。因此，需要進一步的體外研究證實TRPA1/TPPV1異聚體和炎性因子在內(nèi)異癥疼痛發(fā)展的相互作用關(guān)系。

綜上所述，本研究初步探討了小鼠內(nèi)異癥模型中TRPV1/TRPA1在內(nèi)異癥相關(guān)疼痛中的作用，TRPV1/TRPA1表達水平可以作為評估內(nèi)異癥相關(guān)疼痛程度的參考，靶向TRPV1/TRPA1異聚體可能成為治療內(nèi)異癥疼痛的選擇之一。

作者貢獻聲明朱海實驗操作，數(shù)據(jù)收集，論文撰寫。王一，賀奕博數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，論文修訂。俞衛(wèi)鋒研究設(shè)計和指導(dǎo)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。