陳玉梅 楊依霖 杜施霖 宋振舉 童朝陽

（復旦大學附屬中山醫(yī)院急診科 上海 200032）

膿毒癥是機體對感染反應失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙，胃腸道是嚴重膿毒癥累及最嚴重的器官之一［1］。膿毒癥患者并發(fā)胃腸功能障礙可促使病情迅速進展，延長住院時間，增加患者的病死率，是膿毒癥患者預后不良的獨立危險因素之一［2］，臨床上已將腸道功能障礙列為評價危重患者預后的關(guān)鍵指標之一。因而，胃腸功能障礙的防治成為膿毒癥治療的關(guān)鍵。

多肽組學是研究體液、器官、組織和細胞中的全部內(nèi)源性多肽［3］。多肽因具有其獨特的生物學活性，如抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等，在心血管、神經(jīng)、腫瘤等系統(tǒng)發(fā)揮重要作用［4-6］。目前多肽組學在膿毒癥疾病中也逐漸受到關(guān)注，Wakabayashi等［7］發(fā)現(xiàn)8種血液標志物肽，用于預測膿毒癥患者彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）并發(fā)癥。研究者們亦開始從多肽角度不斷探索治療膿毒癥的新手段，如抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）和宿主防御肽（host defense peptides，HDP）已經(jīng)開始用于新的抗菌藥物和宿主反應調(diào)節(jié)療法的開發(fā)［8］；多肽VSAK能夠維持組織葡萄糖攝取并減弱脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）引起的促炎反應［9］。而多肽在膿毒癥腸道功能障礙的發(fā)生發(fā)展報道鮮見。因此，本研究從多肽組學角度出發(fā)探索膿毒癥腸道功能障礙的發(fā)生發(fā)展，有望為膿毒癥腸道功能障礙患者的臨床治療提供新的研發(fā)線索。

材料和方法

膿毒癥小鼠模型構(gòu)建雄性SPF級C57BL/6小鼠，購自上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可號：SCXK（滬）2018-0003。動物實驗符合倫理要求，并獲得復旦大學附屬中山醫(yī)院動物倫理委員會的批準（倫理審查號：201804001Z）。采用盲腸結(jié)扎穿孔（cecum ligation and puncture，CLP）法建立膿毒癥小鼠模型［10］，分為假手術(shù)組（n=3）和膿毒癥組（n=3）。

腸組織多肽提取術(shù)后24 h以脊椎脫臼法處死實驗小鼠，取距離回盲部2 cm處回腸組織，生理鹽水沖洗去除腸內(nèi)容物，裝入凍存管于液氮中保存。將腸組織于液氮中研磨成粉末，移入預冷的EP管并加入萃取液，冰上均質(zhì)化1 min，超聲碎裂，離心（4℃，14 000×g，30 min），取上清并轉(zhuǎn)移到3K超濾管（美國Millipore公司）中，4℃，12 000×g離心，收集流穿液，C18除鹽柱除鹽，凍干備用。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測多肽色譜流動相由溶劑A（0.1%甲酸水溶液）和溶劑B（0.1%甲酸ACN溶液）組成。基于非標記定量技術(shù)，將除鹽凍干后的肽段溶于30 μL溶劑A（0.1%甲酸水溶液）后經(jīng)由配備在線納噴離子源的LCMS/MS進行分析。整套系統(tǒng)為串聯(lián)EASY-nano-LC 1200的Q Exactive?質(zhì) 譜 儀（美 國Thermo Fisher Scientific公 司）。共 上 樣3 μL（分 析 柱Acclaim PepMap C18，75 μm×15 cm），120 min梯度分離：5%～35%溶劑B（0.1%甲酸ACN溶液），溶劑B相梯度從0起始，在106 min以非線性梯度升高到60%，1 min內(nèi)升高到100%，維持13 min。柱流量控制在300 nL/min。每組3個樣本，每個樣本進樣3次。Q Exactive?質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。質(zhì)譜參數(shù)設置如下：質(zhì)譜的一級質(zhì)譜質(zhì)量范圍：m/z=300～1800；電噴霧電壓2 kV；動態(tài)排除持續(xù)時間20 s；MS分辨率為70 000，MS/MS分辨率為17 500；母離子的電荷量設置2～7。通過PEAKS Studio version X（加拿大Bioinformatics Solutions公司）分析串聯(lián)質(zhì)譜圖；PEAKS DB對數(shù)據(jù)庫uniprot_proteome_mus_musculus_201902（54185 entries）搜庫，設置非酶切。搜庫參數(shù)碎片離子質(zhì)量容許誤差：0.05 g/mol，母離子質(zhì)量容許誤差：10 ppm，可變修飾：氧化（M）15.99，脫酰胺化（NQ）0.98。肽段經(jīng)過1%錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）和1條唯一多肽匹配數(shù)質(zhì)控過濾，最終鑒定的多肽。我們將每組中在2個以上的樣品中定量到的肽段計為有效的鑒定結(jié)果，取均值；每組中在2個以上的樣品中沒有定量到的肽段計為無效的鑒定結(jié)果，計為0。

生物信息學分析采用在線計算工具（http://web.expasy.org/compute_pi/）獲得差異多肽的等電點（isoelectric point，PI）和分子量（molecular weight，MW）；Blast2GO version 5進行功能注釋；GOATOOLS進行差異蛋白功能富集，揭示多肽蛋白前體可能發(fā)揮的作用，以確定多肽潛在的生理功能。為了進一步探索差異表達多肽及其前體蛋白的生物學意義，本研究采用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）進行差異多肽的前體蛋白通路分析，KOG（EuKaryotic Orthologous Groups）數(shù)據(jù)庫對鑒定到的差異多肽的前體蛋白進行基于序列相似度的功能分類注釋及預測，使用STRING v10.5（www.string-db.org）分析蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡。

統(tǒng)計學分析EAKS DB搜庫數(shù)據(jù)結(jié)果使用R語言aov（）函數(shù)進行ANOVA分析，顯著性（Significance）＞13（P＜0.05）為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

膿毒癥小鼠腸組織差異表達多肽將萃取得到的小鼠腸組織內(nèi)源性多肽樣本進行質(zhì)譜分析，共鑒定到458條多肽序列，涉及129個前體蛋白（卡值標準：1.0% FDR，1條唯一多肽匹配數(shù)）。每組中在2個以上的樣品中定量到的肽段計為“有效的鑒定結(jié)果”，取平均值；每組中在2個以上的樣品中沒有定量到的肽段計為“無效的鑒定結(jié)果”，計為0，Significance＞13（P＜0.05）為差異有統(tǒng)計學意義。得出差異上調(diào)的多肽有101個，下調(diào)的多肽有9個（其中下調(diào)9條多肽肽段及對應前體蛋白分別為GPKGFGRGGAESHTFK-Crip1；GFGRGGAESHTFK-Crip1；SASNRIIAAKDHA-Rps21；SNRIIAAKDHA-Rps21；SEGTKAVTKYTSSK-H2bc14；NKTGKAVSYLGPK-Atox1； TPEELGLDKVCox5a；AGDKLVVVDFS-Txn；AAGDKLVVVDFTxn）（圖1）。

圖1 膿毒癥小鼠腸道組織多肽差異表達的內(nèi)源性多肽聚類分析Fig 1 Cluster analysis of differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis

差異表達多肽的理化特征全部差異表達的內(nèi)源性多肽MW的分布范圍在600～2 400 g/mol，其中在上調(diào)多肽中，MW主要集中在800～1 800 g/mol；而在下調(diào)多肽中，MW主要集中在1 000～1 400 g/mol（圖2A）；PI的分布范圍在3～12，大部分多肽PI集中在4～6（圖2B）。MW和PI的分布在一個比較寬的范圍，但大多數(shù)多肽的MW低于3 000 g/moL，證實了分離的多肽的純度。了解差異多肽PI，為后續(xù)多肽的分離純化奠定基礎。

圖2 膿毒癥小鼠腸道組織差異表達內(nèi)源性多肽的特點Fig 2 Characteristics of differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis

差異表達內(nèi)源性多肽前體蛋白的GO與Pathway分析我們對差異內(nèi)源性多肽的前體蛋白進行GO與Pathway分析，來預測差異內(nèi)源性多肽的潛在功能。GO分析結(jié)果主要包括：生物學過程、細胞組分及分子功能集簇。生物學過程涉及（圖3A）：蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)分解、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、凋亡過程的負調(diào)節(jié)、細胞因子分泌的正性調(diào)節(jié)、氧化還原過程、MAPK活性的激活等；細胞組分包括（圖3B）：細胞質(zhì)、細胞外間隙、髓鞘、核仁、核糖體等；分子功能集簇包含（圖3C）：相同的蛋白結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、蛋白激酶結(jié)合等。Pathway分析主要涉及代謝途徑、心肌收縮、抗原處理和呈遞、氧化磷酸化、MAPK信號通路、細胞凋亡等途徑（圖3D）。

圖3 膿毒癥小鼠腸道組織差異表達內(nèi)源性多肽對應前體蛋白的GO和Pathway分析Fig 3 GO and Pathway analyses of precursor proteins from differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis

差異表達內(nèi)源性多肽前體蛋白KOG及互作網(wǎng)絡分析使用KOG數(shù)據(jù)庫對鑒定到的差異內(nèi)源性多肽的前體蛋白進行基于序列相似度的功能分類注釋及預測，以柱形圖展示鑒定前體蛋白的KOG功能分類情況，主要包括翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；細胞骨架；能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化；信號轉(zhuǎn)導機制等（圖4A）。提交每組差異蛋白名至STRING官網(wǎng)，經(jīng)分析得出前體蛋白相互作用網(wǎng)絡圖（圖4B）。

圖4 膿毒癥小鼠腸道組織差異表達內(nèi)源性多肽對應前體蛋白的KOG和蛋白互作網(wǎng)絡分析Fig 4 KOG and protein interaction network analysis of precursor proteins from differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis

腸道功能障礙相關(guān)的差異表達內(nèi)源性多肽基于上述差異內(nèi)源性多肽及其前體蛋白的生物學功能和特征分析，我們?nèi)〔町悆?nèi)源性多肽差異的顯著性（Significance）＞13，最大比值（Max Ratio）＞14，且結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫分析多肽是否存在前體蛋白功能域，我們預測了15個可能與膿毒癥腸道功能障礙相關(guān)的內(nèi)源性多肽（圖5）；并在表1中列出了多肽的質(zhì)控評分、信號強度、差異的顯著性、最大比值、前體蛋白及位于前體蛋白的功能域位置，提示這些肽可能參與了膿毒癥腸道功能障礙的發(fā)生和發(fā)展。

表1 位于功能域的腸道功能障礙相關(guān)的差異表達內(nèi)源性多肽Tab 1 Intestinal dysfunction-related differentially expressed peptides in functional domains and/or containing functional sites

圖5 膿毒癥腸道功能障礙相關(guān)的差異表達內(nèi)源性多肽Fig 5 Differentially expressed endogenous peptides associated with sepsis-induced intestinal dysfunction

討 論

膿毒癥發(fā)生時，往往伴有腸道黏膜完整性破壞及腸道內(nèi)菌群失衡，導致腸上皮的多種紊亂，例如上皮細胞凋亡增加、屏障功能障礙和細胞因子產(chǎn)生，進而促進膿毒癥的進展［11-12］，因此，腸道功能障礙被認為是膿毒癥病情加重的重要驅(qū)動力。探索膿毒癥腸損傷的病理機制將會極大地促進對膿毒癥腸功能障礙機制的理解。

本研究中我們通過質(zhì)譜檢測膿毒癥腸道組織內(nèi)源性多肽，共鑒定到458條多肽序列，110條多肽存在差異表達，其中101條多肽上調(diào)，9條多肽下調(diào)。一般來說，多肽作為其前體蛋白的水解產(chǎn)物，常保留前體蛋白的部分空間結(jié)構(gòu)及作用位點，能夠通過激活或拮抗其前體蛋白的作用靶點發(fā)揮與前體蛋白相似或相反的生物功能［13］。因此，我們通過前體蛋白的生物信息學分析以預測差異多肽的功能。GO與Pathway分析顯示前體蛋白主要參與調(diào)控代謝途徑、抗原處理和呈遞、氧化磷酸化、MAPK信號通路、細胞凋亡等途徑；KOG及蛋白互作網(wǎng)絡分析顯示：前體蛋白相互作用，形成互作網(wǎng)絡，可能通過翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化；信號轉(zhuǎn)導機制等發(fā)揮分子功能。據(jù)此，我們推斷差異內(nèi)源性多肽可能通過上述分子功能及生物途徑參與膿毒癥腸道功能障礙的發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)內(nèi)源性多肽差異顯著性，以及是否位于前體蛋白的功能域，我們預測出膿毒癥腸道功能障礙相關(guān)的15條多肽。我們研究中發(fā)現(xiàn)前體蛋白細胞色素c氧化酶亞基5a（Cox5a）參與膿毒癥誘導心肌線粒體損傷［14］。推測腸道組織鑒定到的來源Cox5a的肽段TPEELGLDKV可能通過線粒體途徑參與膿毒癥腸道功能障礙的發(fā)生。多肽PMFIVNTNVPR來源巨噬細胞遷移抑制因子（Mif），研究發(fā)現(xiàn)Mif參與炎性反應及免疫應答［15］，MIF互變異構(gòu)酶抑制劑可使得MIF的活性減弱或消失，顯著降低炎癥因子的釋放，提高膿毒癥小鼠的存活率［16］。PMFIVNTNVPR處于Mif的質(zhì)子受體激活位點區(qū)域，且位于Mif的功能區(qū)域（2-115aa），我們推測該小肽分子可能參與調(diào)控炎癥反應。SLQEIQTPIIK來源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2），ACE2是膳食氨基酸穩(wěn)態(tài)、先天免疫、腸道微生物生態(tài)學和結(jié)腸炎傳染性易感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［17-18］。因此我們推測SLQEIQTPIIK在膿毒癥腸道功能障礙中亦可能扮演重要角色。SGAEASFLSSMIK來源胰島再生源蛋白3-gamma（Reg3g），Reg3g在腸道炎癥疾病中發(fā)揮重要作用［19］。SGAEASFLSSMIK定位于Reg3g的81-93aa，屬于Reg3g的功能域內(nèi)（47-171aa），SGAEASFLSSMIK在膿毒癥小鼠腸道高表達，推測可能通過調(diào)節(jié)腸道炎癥參與膿毒癥腸道功能障礙的發(fā)生。

綜上所述，本研究首先提供了膿毒癥腸道功能障礙相關(guān)多肽發(fā)生差異表達的概況，通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了15條顯著差異表達的內(nèi)源性多肽，并分析了其參與膿毒癥腸道功能障礙發(fā)生發(fā)展可能的作用機制，提示這些多肽可能是膿毒癥腸道損傷過程中的關(guān)鍵生物活性多肽，為膿毒癥腸道功能障礙機制的研究提供了新的方向和打下了重要基礎。然而，本研究仍具有一定局限性，需要擴大樣本量挖掘更多膿毒癥腸道功能障礙相關(guān)內(nèi)源性多肽，進一步實驗探索差異內(nèi)源性多肽在膿毒癥腸道功能障礙中的調(diào)控作用及機制。

作者貢獻聲明陳玉梅多肽提取，數(shù)據(jù)分析，論文撰寫。楊依霖構(gòu)建動物模型，生物信息學分析。杜施霖，宋振舉，童朝陽論文審核和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。