王小麗，韓 睿，張全成，趙鵬程，王俊剛

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003；2.新疆天禾嘉信農(nóng)業(yè)科技有限公司，烏魯木齊 830000）

0 引言

【研究意義】新疆是我國(guó)棉花重要產(chǎn)區(qū)，而棉蚜Aphis gossypii（Glover）是棉花的重要害蟲(chóng)之一。棉蚜為蚜科蚜屬，蚜蟲(chóng)防治藥劑的重復(fù)和不規(guī)范使用，會(huì)使蚜蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性[1-3]。而羧酸酯酶（CarE）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等酶活性增加是昆蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生的一類重要機(jī)制，與棉蚜抗藥性之間存在一定關(guān)系[4-10]，測(cè)量不同地理種群棉蚜的3種酶活及分析酶活力對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性產(chǎn)生的作用，對(duì)棉蚜的防治和相關(guān)研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲(chóng)的抗藥性存在一定關(guān)系，在大墊尖翅蝗對(duì)丁烯氟蟲(chóng)腈的抗性研究中，發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是抗性產(chǎn)生的因素之一[4]，李永強(qiáng)等[5]研究表明，棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的8個(gè)羧酸酯酶對(duì)2種擬除蟲(chóng)菊酯類和2種有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑有一定的解毒代謝活性，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶還參與了煙粉虱對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性形成[6]，而乙酰膽堿酯酶的敏感性下降與二化螟對(duì)三唑磷抗性產(chǎn)生有關(guān)[7]，胡珍娣[8]在繼代汰選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺有一定的解毒活性。3種酶與蚜蟲(chóng)的抗藥性存在關(guān)系，在室內(nèi)的麥二叉蚜抗性選育過(guò)程中，乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與麥二叉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉的敏感性存在一定關(guān)系[9]，郭天鳳等[10]研究表明，抗吡蟲(chóng)啉和抗啶蟲(chóng)脒棉蚜兩種抗性品系中，羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性均高于敏感品系，而羧酸酯酶在棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒抗性中起到了重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆棉花種植面積大，區(qū)域廣[11]，不同地區(qū)用藥量和打藥方式存在差異，導(dǎo)致不同地理種群棉蚜抗藥性不同[12]。需研究不同地理種群棉蚜和敏感種群棉蚜體內(nèi)3種酶活性，了解棉蚜的抗藥機(jī)制，探索不同地理種群棉蚜3種酶活性與吡蟲(chóng)啉抗性的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究新疆5個(gè)地區(qū)不同地理種群棉蚜體內(nèi)3種酶活性的，了解新疆不同地區(qū)棉蚜與敏感種群棉蚜的2種關(guān)鍵解毒酶和1種神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)鍵性酶比活力，以及對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗藥性，為相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試棉蚜：2017年7～8月，采自庫(kù)爾勒地區(qū)、五家渠101團(tuán)老九連、奎屯130團(tuán)團(tuán)部周邊、石河子147團(tuán)和哈密農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站試驗(yàn)田。相對(duì)敏感種群棉蚜采集于石河子大學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)室繼代培飼養(yǎng)20代以上（SS）。

試劑及儀器：1-氯-2，4-二硝基苯、還原型谷胱甘肽、固藍(lán)B 鹽、二硫代雙硝基苯甲酸、十二烷基硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、α-醋酸萘酯、考馬斯亮藍(lán)、毒扁豆堿、牛血清蛋白、磷酸緩沖液、吐溫-80、丙酮，均產(chǎn)自上海源葉生物科技有限公司。UV-1800日本島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；玻璃勻漿器，上海壘固儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，LQP-B-4型制冰機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 毒力測(cè)定

生物測(cè)定采用葉片浸漬法，加以改動(dòng)。將殺蟲(chóng)劑用少量的丙酮使其溶解，用0.05%吐溫-80溶液將溶解的殺蟲(chóng)劑稀釋成5個(gè)濃度。選擇新鮮棉葉，在配好的溶液中浸泡10 s，取出后自然晾干，放入含有瓊脂的培養(yǎng)皿內(nèi)。每個(gè)處理選擇個(gè)體大小均勻一致的20 頭無(wú)翅蚜進(jìn)行試驗(yàn)，以0.05%的吐溫-80溶液為對(duì)照，重復(fù)3次。試驗(yàn)條件為溫度（26±1）℃、光周期16 L：8 D、相對(duì)濕度55%～70%。24 h 后檢查棉蚜死亡情況，以毛筆輕輕觸動(dòng)足和觸角無(wú)反應(yīng)為死亡判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 生化測(cè)定

1.2.2.1 羧酸酯酶活力

（1）酶源制備

玻璃勻漿器中加入5 mL（0.04 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液，將150 頭無(wú)翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，8 000 r/min下離心20 min，取稀釋50倍后的上清液作為酶源，重復(fù)3次。

（2）活力測(cè)定

參照Van Aspern[13]的方法，加以改動(dòng)。試管中加入5 mL（3×10-4mol/L）α-醋酸萘酯，1 mL 酶源，30℃水浴下30 min 后加入1 mL 顯色劑，底物常溫下靜置20 min，在600 nm下測(cè)量OD值，每組重復(fù)3 次。將酶含量（mL）作為自變量，OD 值為因變量，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出1 mL 酶液所生成的α-萘酚的量，最后結(jié)合蛋白質(zhì)含量（mg/g）計(jì)算出羧酸酯酶的比活力。

1.2.2.2 乙酰膽堿酯酶活力

（1）酶源制備

玻璃勻漿器中加入3 mL（0.1 mol/L pH7.4）的磷酸緩沖液，將200 頭無(wú)翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，8 000 r/min下離心20 min，取上清液作為酶源，重復(fù)3次。

（2）活力測(cè)定

參照高希武等[14]的方法，加以改動(dòng)。在試管中加入2.2 mL（0.1 mol/L pH7.4）的磷酸緩沖液、0.4mL酶源、0.1mLAsch-DTNB（1：2）混合液，將試管中試劑混勻，在27℃水浴振蕩條件下反應(yīng)15 min，再加入0.5 mL（1×10-3mol/L）毒扁堿，將試劑在412 nm 下測(cè)定OD 值，每組重復(fù)3 次。以酶含量（mL）為自變量，OD值為因變量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰膽堿酯酶的比活力。

1.2.2.3 谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活力

（1）酶源配制

玻璃勻漿器中加入2 mL（66 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液，將150 頭無(wú)翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，9 000 r/min下離心15 min，取上清液作為酶源，重復(fù)3次。

（2）活力

參照Habig等[15]方法，加以改動(dòng)。試管中加入2.4 mL（66 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液、0.3 mL（50 mol/L）谷胱甘肽、0.1 mL（0.03 mol/L）CDNB，將試管中試劑混勻，在27℃水浴振蕩條件下反應(yīng)15 min，再加入0.2 mL 酶液，在室溫下340 nm 處比色，測(cè)定5 min內(nèi)OD變化值，每組重復(fù)3次。

1.2.3 酶原蛋白含量

（1）酶源制備

玻璃勻漿器中加入5 mL（0.04 mol/LpH7.0）的磷酸緩沖液，將120 頭無(wú)翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，8 000 r/min下離心15 min，取上清液稀釋50倍后作為酶源，重復(fù)3次。

（2）酶源蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參考Bradford[16]的方法，試管中加入0.1mL酶液，對(duì)照試管中加入0.1 mL（0.04 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液，再分別加入5 mL 考馬斯G-250 試劑，在25℃水浴下放置2 min，在595 nm 處測(cè)OD值。每組重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，并用Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理種群棉蚜羧酸酯酶比活力

研究表明，棉蚜SS種群羧酸酯酶比活力為0.236（U/mgpro-min），除哈密地區(qū)棉蚜種群羧酸酯酶比活力為0.284（U/mgpro-min）外，其余地區(qū)棉蚜種群羧酸酯酶比活力均遠(yuǎn)高于SS種群，差異顯著（P＜0.05）。庫(kù)爾勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地區(qū)棉蚜種群對(duì)SS種群羧酸酯酶比活力比值為6.5、4.2、3.4、2.7和1.2倍，不同地理種群之間棉蚜羧酸酯酶比活力差異顯著（P＜0.05）。表1

表1 不同地理種群棉蚜的羧酸酯酶比活力Table 1 CarE activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.2 不同地理種群棉蚜乙酰膽堿酯酶的比活力

研究表明，棉蚜SS種群乙酰膽堿酯酶比活力為2.997（U/mgpro-min），各地區(qū)棉蚜種群乙酰膽堿酯酶比活力均遠(yuǎn)高于SS種群，且差異顯著（P＜0.05），其庫(kù)爾勒地區(qū)棉蚜種群和SS 棉蚜種群乙酰膽堿酯酶比活力存在極顯著差異（P＜0.01）。庫(kù)爾勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地區(qū)棉蚜種群對(duì)SS種群乙酰膽堿酯酶比活力比值為4.2、2.7、2.3、2.5和2.1倍，且不同地理種群之間棉蚜乙酰膽堿酯酶比活力也存在顯著差異（P＜0.05）。表2

表2 不同地理種群棉蚜的乙酰膽堿酯酶比活力Table 2 AchE activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.3 不同地理種群棉蚜谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力

研究表明，SS 棉蚜種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力為3.986（U/mgpro-min），各地區(qū)棉蚜種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力均遠(yuǎn)高于SS種群，且差異顯著（P＜0.05）。不同地理種群之間棉蚜谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力也存在顯著差異（P＜0.05）。庫(kù)爾勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地區(qū)棉蚜種群對(duì)SS棉蚜種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力比值為2.3、1.5、1.3、2.5和2.1倍。

表3 不同地理種群棉蚜的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力Table 3 GST activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.4 不同地理種群棉蚜3種酶活性與吡蟲(chóng)啉抗藥性的相關(guān)性

研究表明，通過(guò)對(duì)各個(gè)地區(qū)棉蚜種群吡蟲(chóng)啉抗性及3種酶活性之間的聯(lián)系分析，棉蚜體內(nèi)的2種關(guān)鍵解毒酶和1種神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)鍵性酶和吡蟲(chóng)啉抗性之間存在一定相關(guān)性。各棉蚜種群羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性隨著吡蟲(chóng)啉抗性增減而增減，羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶極有可能參與了棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性形成過(guò)程。圖1

圖1 不同地理種群棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性與3種酶活性的相關(guān)性Fig.1 Relationship between imidaclopridresistance to Aphis gossypii and three enzyme activities in different geographical populations

3 討論

研究表明，棉蚜對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生中等高抗水平時(shí)，往往是靶標(biāo)基因變異導(dǎo)致靶標(biāo)敏感性下降；棉蚜對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生低水平抗性時(shí)一般是棉蚜體內(nèi)解毒酶活性的上升導(dǎo)致的[17]。試驗(yàn)以趙鵬程[18]研究為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)新疆不同地理種群棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性還處于抵抗水平，試驗(yàn)選用了吡蟲(chóng)啉的抗性水平，分析吡蟲(chóng)啉的抗性形成機(jī)制是否與解毒酶活性有關(guān)，羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性變化與吡蟲(chóng)啉抗性變化呈正相關(guān)。

羧酸酯酶可以水解酯類化合物的酯鍵或與親酯類化合物結(jié)合[19]。而研究中羧酸酯酶對(duì)吡蟲(chóng)啉殺蟲(chóng)劑也起到了非常好的作用。各地區(qū)羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶均低于敏感品系，但羧酸酯酶活性的變化比乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶顯著，羧酸酯酶在棉蚜對(duì)新煙堿類殺蟲(chóng)劑敏感性下降有關(guān)。羧酸酯酶同樣能介導(dǎo)昆蟲(chóng)對(duì)新煙堿類殺蟲(chóng)劑的抗性[20-23]。楊柳等[20]測(cè)定了湖南寧鄉(xiāng)地理種群煙蚜和敏感種群煙蚜的解毒酶活性，結(jié)果表明寧鄉(xiāng)煙蚜種群乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶分別是敏感種群1.68 倍、2.58 倍、2.39 倍，均顯著高于敏感種群，且羧酸酯酶在煙蚜對(duì)滅多威及辛硫磷敏感性降低起到重要作用。史曉斌等[21]測(cè)定吡蟲(chóng)啉抗性品系和敏感品系羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶，發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶活性變化較快，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶增加較慢，羧酸酯酶在棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉產(chǎn)生抗性中起到重要作用。王曉冰[22]對(duì)綠盲蝽進(jìn)行了抗呋蟲(chóng)胺品系的汰選，在汰選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶活性有明顯的提升，認(rèn)為羧酸酯酶參與了綠盲蝽代謝呋蟲(chóng)胺過(guò)程。楊煥清等[23]研究發(fā)現(xiàn)棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性的形成與羧酸酯酶活力增加有關(guān)。

不同地區(qū)棉蚜種群之間抗性水平不一致，其解毒酶活性也存在差異[24-30]。研究表明，庫(kù)爾勒棉蚜種群羧酸酯酶比活力和乙酰膽堿酯酶比活力是敏感棉蚜的6.5 倍和4.2 倍，均高于其他地區(qū)棉蚜種群；其中哈密地區(qū)棉蚜種群解毒代謝酶活力低于其他地區(qū)，可能與采集測(cè)定的時(shí)間，棉蚜發(fā)生早晚，蚜蟲(chóng)還沒(méi)有大面積接觸殺蟲(chóng)劑等有關(guān)。

4 結(jié)論

各地理種群棉蚜3種酶活性均顯著高于敏感種群（P＜0.05），且彼此之間存在差異性，羧酸酯酶在棉蚜感受到吡蟲(chóng)啉殺蟲(chóng)劑脅迫時(shí)極有可能起到重要作用。棉蚜體內(nèi)羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶抗性之間存在一定相關(guān)性，棉蚜抗性強(qiáng)的地區(qū)其解毒代謝作用強(qiáng)烈，3種酶也隨之表現(xiàn)出較高的活性，其中各地區(qū)棉蚜種群羧酸酯酶活性變化最大。