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        吖啶橙-金納米熒光法測金屬硫蛋白

        2022-12-21 08:16:26陳思涵周鵬陳云生王永生王漢青
        應(yīng)用化工 2022年11期
        關(guān)鍵詞:體系實驗

        陳思涵,周鵬,陳云生,王永生,王漢青

        (1.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,湖南 衡陽 421001;3.建筑環(huán)境氣載污染物治理與放射性防護國家地方聯(lián)合工程研究中心,湖南 衡陽 421001)

        金屬硫蛋白廣泛存在于動物肝臟、腎臟、胰腺和小腸等臟器中,具有消除體內(nèi)自由基、延緩機體衰老、參與微量元素儲存、轉(zhuǎn)運和代謝以及對重金屬解毒的作用[1]。金屬硫蛋白作為內(nèi)源性細胞保護劑,具有穩(wěn)定細胞膜、抗脂質(zhì)過氧化、修復(fù)細胞和防止癌癥發(fā)生有著重要作用[2]。近年來,金屬硫蛋白作為主要生物標(biāo)志物已成為研究熱點[3-4]。因此,研究建立一種方便、高效、易普及的金屬硫蛋白檢測新方法十分必要。本文基于吖啶橙熒光染料與金納米及金屬硫蛋白相互作用[5-6],熒光強度變化在一定條件、范圍內(nèi)呈線性相關(guān)的原理,建立了吖啶橙金納米熒光法測定金屬硫蛋白的新方法。

        1 實驗部分

        1.1 試劑與儀器

        實驗用水為雙蒸水(電阻18.25 Ω);金屬硫蛋白、金納米、檸檬酸鈉、鹽酸、吖啶橙、氯金酸、檸檬酸三鈉均為分析純。

        F-4500型熒光分光光度計;UV-2550紫外-可見分光光度計;PB-20(PB-S)型精密酸度計;78-1型磁力加熱攪拌器;PrimoR高速低溫離心機;SHHW21-60型電熱恒溫水浴箱;AB204-S電子分析天平;0.22 μm 針頭式過濾器。

        1.2 溶液配制

        1.2.1 金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲存液配制 稱取3.0 mg金屬硫蛋白,用雙蒸水溶解后,移至50 mL容量瓶,定容至刻度,得1.00×10-5mol/L金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲存液。用時稀釋至1.00×10-6mol/L。

        1.2.2 CANa3-HCl緩沖液配制 準(zhǔn)確稱取2.941 0 g檸檬酸鈉,加入雙蒸水,在燒杯中充分溶解后,移至1 000 mL容量瓶,定容至刻度,得0.1 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液標(biāo)準(zhǔn)液,再用同濃度鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0,備用。

        1.2.3 吖啶橙標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制 稱取0.302 g吖啶橙于燒杯中,加入雙蒸水,充分溶解后,移至 100 mL 容量瓶,定容至刻度,得1.00×10-4mol/L熒光染料-吖啶橙標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用時稀釋至所需濃度1.00×10-5mol/L。

        1.2.4 CANa3溶液配制 稱取1.001 3 g檸檬酸三鈉,用雙蒸水溶解后,移至100 mL容量瓶,定容至刻度,得到38.8 ×10-3mol/L的檸檬酸三鈉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

        1.3 金納米的處理

        取一個100 mL磨口錐形瓶,用王水浸泡洗凈。依次加入3.3 mL 1%氯金酸和76.7 mL滅菌水,充分混勻,密封后,放置磁力加熱攪拌器中,加熱至沸騰,加入38.8 ×10-3mol/L檸檬酸三鈉12.8 mL,持續(xù)加熱至溶液呈酒紅色,15 min后停止加熱,攪拌冷卻至室溫,用0.22 μm針頭式過濾器過濾后備用[7-8]。

        1.4 實驗方法

        1.4.1 空白實驗 于2 mL EP管中,加入20 μL檸檬酸鈉緩沖液,30 μL吖啶橙標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,40 μL金納米,加滅菌水定容至400 μL,振蕩混勻,常溫反應(yīng)15 min后,進行熒光分光光度計掃描,在最大發(fā)射波長526 nm處,得熒光強度值為F0,記為空白管。

        1.4.2 樣品分析 按空白實驗方法,在加雙蒸水定容前,分別加入不同量1.00×10-6mol/L金屬硫蛋白應(yīng)用液,再加雙蒸水定容至400 μL,振蕩混勻,放置反應(yīng)15 min。測量試驗管的熒光強度(F)??傻忙=F-F0。儀器調(diào)試相關(guān)參數(shù),激發(fā)狹峰寬度 5 nm,發(fā)射狹峰寬度10 nm,光電倍增管負電壓是700 V。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 實驗機制探討

        熒光傳感體系光譜見圖1。

        圖1 傳感系統(tǒng)的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of the sensing system

        由圖1可知,當(dāng)體系只加入熒光染料-吖啶橙和緩沖液時(曲線a),體系有較大熒光值,表明熒光染料-吖啶橙在緩沖液中能發(fā)出較強熒光。當(dāng)體系分別加入CANa3-HCl緩沖液、吖啶橙和金納米時(曲線c),體系有較弱的熒光值,說明吖啶橙通過靜電作用結(jié)合與帶負電的金納米表面結(jié)合,兩種物質(zhì)距離拉近,發(fā)生了表面熒光能量轉(zhuǎn)移,致體系熒光猝滅。當(dāng)體系分別加入CANa3-HCl緩沖溶液、吖啶橙、金納米和金屬硫蛋白時(曲線b),體系有較強的熒光值,表明金屬硫蛋白與金納米有更強的共價作用,破壞了原有體系,金屬硫蛋白可與吖啶橙染料競爭結(jié)合在金納米表面,使得吖啶橙遠離金納米粒子,使體系恢復(fù)熒光。

        2.2 實驗條件選擇

        2.2.1 緩沖體系的優(yōu)化 在CANa3-HCl緩沖液、Tris-HCl緩沖液及BR緩沖液三類常用緩沖液進行選擇,實驗結(jié)果見圖2。

        圖2 緩沖液的選擇Fig.2 The choice of buffer system

        由圖2可知,CANa3-HCl緩沖液體系中ΔF值最大,故選擇CANa3-HCl作為緩沖液。

        2.2.2 緩沖液pH的影響 緩沖液pH對實驗體系影響見圖3。

        圖3 pH的影響Fig.3 Effect of pH on the system

        由圖3可知,pH在2.5~4.0時,ΔF值逐漸增大,當(dāng)pH=4.0時,ΔF值最大。pH在4.0~8.0時,ΔF值則持續(xù)遞減。故選擇pH=4的CANa3-HCl緩沖液作為實驗條件。

        2.2.3 緩沖溶液加入量的優(yōu)化 CANa3-HCl緩沖液加入量對體系的影響見圖4。

        圖4 緩沖液加入量的影響Fig.4 Effect of buffer volume on the ΔF of the system

        由圖4可知,當(dāng)緩沖液用量不足45 μL時,ΔF值逐步增加,緩沖液用量為45 μL時,體系ΔF值有最大值。當(dāng)緩沖液用量超過45 μL時,ΔF值則持續(xù)降低。故緩沖液的最佳加入量為45 μL。

        2.2.4 金納米用量的優(yōu)化 金納米用量對體系的影響見圖5。

        圖5 金納米用量的影響Fig.5 Effect of AuNPs volume on the system

        由圖5可知,當(dāng)金納米加入量不足時,熒光染料猝滅效果不好,導(dǎo)致反應(yīng)體系本底值高,加入金屬硫蛋白后,雖然能使熒光恢復(fù),但ΔF值偏低。當(dāng)金納米用量為50 μL時,ΔF值最大。故本實驗選擇 50 μL 的金納米為最佳用量。

        2.2.5 吖啶橙用量的優(yōu)化 吖啶橙用量對體系的影響見圖6。

        圖6 吖啶橙用量對實驗體系的影響Fig.6 Effect of AO volume on the system

        由圖6可知,隨著吖啶橙用量的增加,熒光強度隨之加強,ΔF值增大,當(dāng)用量為40 μL時,ΔF值最大,隨后繼續(xù)增加用量,ΔF值持續(xù)降低。故吖啶橙實驗用量為40 μL。

        2.2.6 反應(yīng)時間對實驗的影響 反應(yīng)時間對實驗體系影響見圖7。

        圖7 反應(yīng)時間的影響Fig.7 Effect of reaction time on the system

        由圖7可知,隨著反應(yīng)時間增長,ΔF值逐漸增大,反應(yīng)15 min時,有最大ΔF值,繼續(xù)延長反應(yīng)時間,ΔF值持續(xù)下降,故實驗選擇15 min為反應(yīng)時間。

        2.2.7 反應(yīng)溫度對實驗的影響 反應(yīng)溫度對實驗體系影響見圖8。

        圖8 反應(yīng)溫度的影響Fig.8 Effect of temperature on the system

        由圖8可知,在不到60 ℃時,ΔF值隨著溫度的升高而增大,60 ℃時ΔF值達到最大,超過60 ℃,則ΔF值逐步下降。故選擇60 ℃為實驗反應(yīng)溫度。

        2.3 干擾物的影響

        為驗證本方法特異性,取金屬硫蛋白濃度為 1.0×10-7mol/L,其他試劑用量均在優(yōu)化后條件下,檢驗多種共存干擾物質(zhì)對測定結(jié)果的影響,控制相對誤差在±5%以內(nèi),結(jié)果見表1。

        表1 干擾物的影響Table 1 Effect of interferents substance

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度

        2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)優(yōu)化實驗數(shù)據(jù),在最佳條件下,分別于不同EP管中加入不同體積的金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液測定熒光值(F),以未加金屬硫蛋白的為空白管測定其熒光值(F0),用ΔF=F-F0定量測定金屬硫蛋白。結(jié)果見圖9。

        圖9 金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Calibration curve for determination of MTs

        由圖9可知,金屬硫蛋白濃度在9.3×10-9~1.5×10-7mol/L時,體系ΔF值與金屬硫蛋白濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,r=0.996 5,回歸方程為ΔF=3.798+337.3C(×10-7mol/L)。

        2.4.2 精密度實驗 分別對0.1倍和0.9倍兩種金屬硫蛋白濃度為1.5×10-7mol/L標(biāo)準(zhǔn)液進行6次平行測定,測得本實驗方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.39% 和1.29%,說明本實驗精密度良好。

        2.4.3 檢出限測定 根據(jù)公式CL=3Sb/k(Sb表示空白液的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率),平行測定11管空白管熒光值,得到本實驗檢測金屬硫蛋白的檢出限為2.79×10-9mol/L。

        2.5 樣品分析及加標(biāo)回收率

        用清洗干凈的聚乙烯瓶收集一次性尿樣,樣品1、樣品2均來自于南華大學(xué)的學(xué)生。依據(jù)金屬硫蛋白理化特性和參考有關(guān)文獻進行尿樣處理[7]:①取一定體積尿樣,加入相同體積濃度為 0.01 mol/L pH=8.5 的Tris-HCl緩沖液中,混勻,低溫離心(4 ℃,4 000 r/min,20 min,條件下同);②取上清液,80 ℃水浴加熱10 min,冷卻至4 ℃,再離心;③取上清液,加入到3倍體積的預(yù)先制冷至-20 ℃無水乙醇中,置-20 ℃保存,12 h后再離心;④取沉淀,溶于一定體積的pH=8.5的 Tris-HCl緩沖液中,離心;⑤重復(fù)步驟③,不等待,立即離心;⑥取沉淀,于通風(fēng)處去除乙醇,溶于一定體積的雙蒸水,離心,取上清液100 μL,按1.4.2節(jié)進行測定。再取已測定過其濃度的尿樣1和尿樣2,各加20 μL的1.0×10-6mol/L 金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.4.2節(jié)進行加標(biāo)回收實驗,平行測定6次,結(jié)果見表2。

        表2 人體尿樣中金屬硫蛋白的檢測及回收率實驗(n=6)Table 2 Determination for MTs of human urine samples and recovery rate test(n=6)

        由表2可知,加標(biāo)回收率在97.09%~99.63%之間,說明實驗準(zhǔn)確度高。

        3 結(jié)論

        在酸性條件下,金屬硫蛋白能與金納米有更強結(jié)合能力吸附在一起,使原來吸附在金納米表面被猝滅的熒光染料-吖啶橙熒光恢復(fù)。建立了熒光傳感器測定金屬硫蛋白的新方法,優(yōu)化的實驗條件:pH=4的CANa3-HCl緩沖液45 μL,金納米加入量50 μL,吖啶橙加入量40 μL,在60 ℃下反應(yīng) 15 min。方法檢測范圍較寬,在9.3×10-9~1.5×10-7mol/L線性關(guān)系好,r=0.996 5;檢測限低,達2.79×10-9mol/L;精密度良好,準(zhǔn)確度高,抗干擾較好,已用于實際樣品的檢測,為環(huán)境樣品中金屬硫蛋白的測定提供了一種新的實踐。

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