熊曉莉，熊嶼吾，林輝，李寧

(1.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；2.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源化學(xué)技術(shù)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400067)

發(fā)酵飼料具有改善魚蝦腸道功能[1-2]及免疫力[3-4]、調(diào)理水質(zhì)[5]、提升誘食效果[6]等作用。乳酸菌常用于飼料發(fā)酵，其發(fā)酵工藝條件簡(jiǎn)單，并被世界公認(rèn)為最為安全的發(fā)酵方式[7-9]。本文將含黃粉蟲糞的飼料原料中添加貝殼粉，用乳酸混合菌發(fā)酵，將貝殼粉中不溶性無(wú)機(jī)鈣轉(zhuǎn)化為有利于生物吸收的可溶性鈣。采用兩段式發(fā)酵工藝，以飼料中可溶性鈣含量為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵體系的配方進(jìn)行優(yōu)化，為制備具有高可溶性鈣含量的蝦飼料提供方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

混合乳酸桿菌(100億cfu/g)，由菌長(zhǎng)生物提供；黃粉蟲蟲糞(由餐廚垃圾、麥麩、青菜等經(jīng)黃粉蟲過(guò)腹轉(zhuǎn)化制得，45目)；豆粕、貝殼粉(100目)、全麥粉均為飼料級(jí)；紅糖，食品級(jí)；黃粉蟲蟲粉，實(shí)驗(yàn)室自制；去離子水。

ICAP-7200 ICP-OES等離子體光譜儀；JY2002型電子分析天平；WKF130萬(wàn)能粉碎機(jī)；PHS-3C精密酸度計(jì)；TG16-WS高速離心機(jī)；SHZ-82恒溫水浴搖床。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼料原料的準(zhǔn)備 取黃粉蟲糞50份，豆粉20份，黃粉蟲幼蟲粉10份，全麥粉20份，充分混合均勻，得到飼料原料I。

1.2.2 一段式發(fā)酵 將貝殼粉、紅糖顆粒、發(fā)酵菌劑(糞腸球菌、植物乳酸桿菌按質(zhì)量比1∶1比例混合，下同)、100份的飼料原料I、去離子水適量，依次加入發(fā)酵瓶中，充分拌勻后，密封，將發(fā)酵瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中，溫度控制在35 ℃，每3 h搖晃1次發(fā)酵瓶，持續(xù)96 h。將發(fā)酵好的物料烘干，測(cè)其水溶性鈣含量。

1.2.3 兩段式發(fā)酵[10]

1.2.3.1 第一階段：液態(tài)發(fā)酵 與一段式發(fā)酵相同量的貝殼粉、紅糖顆粒、發(fā)酵菌劑、去離子水，依次加入發(fā)酵瓶中，密封后，充分搖勻后，將發(fā)酵瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中，溫度控制在35 ℃，每3 h搖晃1次發(fā)酵瓶，持續(xù)48 h。

1.2.3.2 第二階段：固態(tài)發(fā)酵 將液態(tài)發(fā)酵得到的發(fā)酵液與100份的飼料原料I混合均勻，并密封，在35 ℃，厭氧發(fā)酵48 h。將發(fā)酵好的物料烘干，得發(fā)酵飼料，測(cè)其水溶性鈣含量。若需制成顆粒，也可在發(fā)酵過(guò)程中加入黏合劑。

1.3 分析方法

1.3.1 水溶性鈣含量的測(cè)定 取1 g烘干的樣品放入50 mL離心管內(nèi)，加入40 mL去離子水，將離心管固定在水浴搖床上。設(shè)置溫度70 ℃，振蕩速度250 r/min，振蕩60 min。離心，取上清液，用 ICP-OES等離子體光譜儀測(cè)定[11]。

1.3.2 總鈣測(cè)定 取1 g烘干的樣品放入坩堝中，將坩堝放在110 ℃加熱板上，使得飼料炭化至無(wú)煙。將坩堝放入馬弗爐中，在550 ℃加熱3 h。燒制后的粉末用10 mL硝酸溶解，并定容至100 mL，過(guò)濾，用ICP-OES等離子體光譜儀測(cè)定[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 一段式與兩段式發(fā)酵效果對(duì)比

一段式與兩段式發(fā)酵效果對(duì)比見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著發(fā)酵體系中水的添加量增加，水溶性鈣含量不同程度地增加。在兩段式的發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)水用量小于100 g時(shí)，水溶性鈣含量增加趨勢(shì)明顯；當(dāng)水用量高于100 g時(shí)，水溶性鈣含量增加趨勢(shì)平緩。而在一段式發(fā)酵中，隨著物料含水率的增加，水溶性鈣含量持續(xù)增加，從曲線趨勢(shì)可預(yù)測(cè)，若物料的含水率足夠高，水溶性鈣含量會(huì)與兩段式接近，但物料含水率過(guò)高，不利于后期物料的烘干和造粒。因此，在相同情況下，兩段式發(fā)酵的效果要優(yōu)于一段式發(fā)酵。故本文僅以兩段式發(fā)酵進(jìn)行研究。

圖1 一段式發(fā)酵和兩段式發(fā)酵效果Fig.1 Comparison between one-stage fermentationand two-stage fermentation

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 貝殼粉添加量對(duì)水可溶性鈣的影響 去離子水80 g，紅糖6 g，發(fā)酵菌劑6 g，發(fā)酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃ 液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵各48 h，考察貝殼粉添加量對(duì)飼料中可溶性鈣含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 貝殼粉添加量對(duì)可溶性鈣產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of shell powder addition onsoluble calcium yield

由圖2可知，當(dāng)貝殼粉的添加量≤5 g時(shí)，飼料中水溶性鈣的產(chǎn)量迅速增加，這是因?yàn)樨悮し壑械奶妓徕}與體系中過(guò)量的乳酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，故增加貝殼粉的量，可以提高水溶性乳酸鈣的生成量。但當(dāng)貝殼粉的量增加到一定程度后，大量消耗體系中的乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵體系中乳酸含量過(guò)低，不利于碳酸鈣轉(zhuǎn)化為乳酸鈣。因此，貝殼粉的添加量宜為5 g。

2.2.2 水添加量對(duì)水可溶性鈣的影響 貝殼粉 3 g，紅糖6 g，發(fā)酵菌劑6 g，發(fā)酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃ 液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵各48 h，考察水的添加量對(duì)飼料中水溶性鈣含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 水用量對(duì)可溶性鈣產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of water content on soluble calcium yield

由圖3可知，當(dāng)水的添加量≤100 g時(shí)，飼料中水溶性鈣的產(chǎn)量迅速增加。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)暮坑欣诎l(fā)酵體系充分混合，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸與貝殼粉充分接觸，使得反應(yīng)速度增快。當(dāng)水的添加量 >100 g 時(shí)，含水量對(duì)生成水溶性鈣的影響不明顯。

2.2.3 紅糖添加量對(duì)水可溶性鈣的影響 水80 g，貝殼粉3 g，發(fā)酵菌劑6 g，發(fā)酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵各48 h，考察紅糖添加量對(duì)飼料中水溶性鈣含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 紅糖添加量對(duì)水溶性鈣產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of brown sugar addition onsoluble calcium yield

由圖4可知，當(dāng)紅糖的添加量≤4 g時(shí)，隨著紅糖添加量的增加，乳酸鈣的產(chǎn)量隨之增加。這是因?yàn)樘欠譃榫纳L(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，乳酸菌通過(guò)代謝將糖分轉(zhuǎn)化為乳酸。但當(dāng)糖分的添加量>4 g時(shí)，乳酸鈣的產(chǎn)量隨之降低?？赡苁且?yàn)楫?dāng)發(fā)酵體系中糖分濃度超過(guò)了乳酸菌生長(zhǎng)所需要的最佳濃度時(shí)，過(guò)高濃度的糖分對(duì)乳酸菌具有抑制作用，從而降低了乳酸鈣的產(chǎn)量，乳酸發(fā)酵其他物料的過(guò)程中，也觀察到近似的現(xiàn)象[13]。因此，紅糖的添加量選擇為4 g。

2.2.4 發(fā)酵菌劑添加量對(duì)水可溶性鈣的影響 水80 g，貝殼粉3 g，紅糖6 g，發(fā)酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵各48 h，考察發(fā)酵菌劑添加量對(duì)飼料中可溶性鈣含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵菌劑的添加量≤6 g時(shí)，隨著發(fā)酵菌劑添加量的增加，乳酸鈣的產(chǎn)量隨之增加，成品飼料水溶性鈣含量也隨之增加。這是因?yàn)楫?dāng)發(fā)酵菌劑添加量過(guò)低時(shí)，乳酸菌難以形成優(yōu)勢(shì)菌種，乳酸菌與其他雜菌相互競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致反應(yīng)體系中乳酸菌的數(shù)量無(wú)法快速增加，降低了乳酸的產(chǎn)量。隨著發(fā)酵菌劑的增加，使得乳酸菌形成了優(yōu)勢(shì)菌種，乳酸菌在短時(shí)間內(nèi)快速大量地繁殖，產(chǎn)生了大量乳酸，大量乳酸的存在使得反應(yīng)體系的pH值快速降低，過(guò)低的pH值會(huì)抑制乳酸菌生長(zhǎng)[14]，同時(shí)也對(duì)其他雜菌的生長(zhǎng)繁殖起抑制作用[15]。當(dāng)發(fā)酵菌劑的添加量>6 g時(shí)，乳酸鈣的產(chǎn)量基本上不隨發(fā)酵菌劑的添加量而變化，這是因?yàn)榘l(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量是固定的，只能維持一定數(shù)量的乳菌正常生長(zhǎng)，當(dāng)體系中乳酸菌含量達(dá)到上限時(shí)，乳酸鈣的產(chǎn)量也隨之達(dá)到了上限。

圖5 發(fā)酵菌劑添加量對(duì)水溶性鈣產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation bacteria addition onsoluble calcium yield

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

采用正交實(shí)驗(yàn)法確定兩段式發(fā)酵的最佳效果，以水溶性鈣為指標(biāo)。液態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度 35 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。采用L16(44)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)液態(tài)發(fā)酵階段的貝殼粉添加量、去離子水添加量、紅糖添加量和發(fā)酵菌劑添加量進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。液態(tài)發(fā)酵階段結(jié)束后，將發(fā)酵液與發(fā)酵原料Ⅰ 100 g充分混合，進(jìn)入固態(tài)發(fā)酵階段，發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h。將發(fā)酵完成的物料烘干，得發(fā)酵飼料，測(cè)發(fā)酵飼料中的水溶性鈣含量。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 L16(44)正交因素水平表Table 1 L16(44) Orthogonal factor and level table

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，兩段式發(fā)酵過(guò)程，影響飼料中水溶性鈣的主次因素是D>A>C>B，液態(tài)發(fā)酵階段的最佳配方為：發(fā)酵菌劑6 g(D3)、貝殼粉5 g(A4)、紅糖5 g(C3)、去離子水140 g(B4)。但因B因素為本實(shí)驗(yàn)的最不敏感因素，且B4和B2的k值差別很小，為了飼料成品干燥水分時(shí)能量消耗低，故最終選擇B2作為該實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。在D3A4C3B2的配方組合下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到發(fā)酵產(chǎn)物中水可溶性鈣的平均含量為16.08 mg/g(干基)。

2.4 發(fā)酵前后飼料中鈣含量的對(duì)比

對(duì)飼料原料Ⅰ、飼料原料Ⅱ、發(fā)酵飼料Ⅰ、發(fā)酵飼料Ⅱ、商品飼料中水溶性鈣和總鈣的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 飼料中鈣含量的對(duì)比Table 3 Comparison of calcium content in feed

由表3可知，單純地向飼料原料中添加貝殼粉而不進(jìn)行發(fā)酵處理，只能增加飼料中總鈣的含量，不會(huì)提升飼料中水溶性鈣的含量，并不利于蝦對(duì)鈣的吸收，補(bǔ)鈣效果不佳。而某商品中總鈣含量雖高，但鈣的存在形式也主要以不利于蝦吸收的無(wú)機(jī)鈣為主。發(fā)酵飼料Ⅱ中的水溶性鈣含量為16.08 mg/g，達(dá)總鈣含量的55.28%，可知通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵過(guò)程，大大提升了飼料中水可溶性鈣的含量，更有利于蝦對(duì)鈣的吸收利用。

3 結(jié)論

采用兩段式發(fā)酵工藝，對(duì)添加有貝殼粉的飼料進(jìn)行發(fā)酵。研究表明，菌接種量、糖、水和貝殼粉的添加量，對(duì)發(fā)酵后的飼料中的水溶性鈣含量均有影響。正交實(shí)驗(yàn)得到了液態(tài)發(fā)酵階段的最優(yōu)配方：菌接種量6 g，貝殼粉5 g，紅糖5 g和水100 g，在溫度35 ℃下發(fā)酵48 h后，然后將發(fā)酵液與100 g飼料原料混合，再次在35 ℃下發(fā)酵48 h，可得到水可溶性鈣含量為16.08 mg/g(干基)的飼料，大大提升了飼料中有利于魚蝦生長(zhǎng)的水溶性鈣的含量，為生產(chǎn)魚蝦水溶性高鈣飼料開辟新途徑。