孫國(guó)強(qiáng)，董金穎，董建生，郜晉陽(yáng)

(山西瑞芝生物科技有限公司，山西 運(yùn)城 044000)

靈芝(Ganodermalucidum)也叫瑞草、仙草等，為名貴的藥用真菌[1]。現(xiàn)代研究表明，其具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗衰老、保肝、提高機(jī)體耐缺氧能力等活性[2-6]。靈芝子實(shí)體和菌絲體中均含蛋白質(zhì)、核苷類(lèi)、糖類(lèi)、三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、生物堿、揮發(fā)油等多種化學(xué)活性成分。其中，三萜類(lèi)化合物是其主要有效成分之一，靈芝是傳統(tǒng)的藥食同源品種之一[2，4，7]。《中國(guó)藥典》采用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)靈芝中三萜及甾醇含量進(jìn)行測(cè)定[8]。

由于通過(guò)液體或固體發(fā)酵技術(shù)獲取靈芝三萜類(lèi)化合物具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)影響、可大批量生產(chǎn)、含量相對(duì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為生產(chǎn)靈芝三萜類(lèi)化合物的最有效方法[9-10]。當(dāng)前，市場(chǎng)上有眾多靈芝菌絲類(lèi)產(chǎn)品，其宣傳的保健功能與靈芝類(lèi)似，但三萜及甾醇等主要活性成分的檢測(cè)方法尚未有統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝子實(shí)體、菌絲體和孢子中三萜的研究較多，但菌絲體中三萜及甾醇含量的相關(guān)報(bào)道較少[9]。本研究較系統(tǒng)地建立了靈芝菌絲體中三萜及甾醇的含量檢測(cè)方法，以期為靈芝菌絲類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及產(chǎn)品深度開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 靈芝菌絲粉 靈芝菌絲粉由山西瑞芝生物科技有限公司培養(yǎng)的靈芝菌絲體，經(jīng)再干燥粉碎后制備。

1.1.2 齊墩果酸對(duì)照品 齊墩果酸對(duì)照品,批號(hào)：110709-201808，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.3 主要試劑 香草醛(批號(hào)：20150701，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、冰醋酸(批號(hào)：181128，四川西隴科學(xué)有限公司)、95%乙醇(批號(hào)：180619，四川西隴科學(xué)有限公司)、乙酸乙酯(20170308，四川西隴科學(xué)有限公司)、甲醇(批號(hào)：20180307，廣東光華科技股份有限公司)、高氯酸(批號(hào)：2017034，天津市鑫源化工有限公司)，均為分析純；水為雙蒸水。

1.2 主要儀器

UV-1100紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；AL204電子天平(瑞士梅特勒公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市國(guó)旺儀器制造有限公司)；DK-615HTD超聲波清洗器(深圳市得康洗凈電器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

紫外-可見(jiàn)分光光度法[8，12-16]常用于靈芝類(lèi)產(chǎn)品中三萜及甾醇含量測(cè)定，本研究選用此法，對(duì)其在靈芝菌絲粉中三萜及甾醇含量測(cè)定的適用性進(jìn)行系統(tǒng)研究。

2.1 5%香草醛-冰醋酸制備

精密稱(chēng)取0.501 02 g香草醛，加冰醋酸溶解并定容至10 mL，混勻，臨用新配。

2.2 齊墩果酸對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品0.011 60 g，加甲醇溶解且定容至50 mL，即得0.211 4 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末約1 g(m1)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形中，加乙醇30 mL，超聲處理45 min，濾過(guò)，濾液置50 mL(V1)量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 空白制劑溶液制備

精密稱(chēng)取約1 g混合均勻的空白制劑，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，同法制備，即得。

2.5 樣品測(cè)定

精密量取供試品溶液0.2 mL(V2)，置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見(jiàn)分光光度法，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品測(cè)定液中三萜及甾醇質(zhì)量m(mg)，計(jì)算，即得。

三萜及甾醇含量計(jì)算公式：

式中：X：樣品中三萜及甾醇含量[g/100 g]；m1：樣品取樣量(g)；V1：樣品定容體積(mL)；V2：量取供試品溶液體積(mL)；m：樣品測(cè)定液中三萜及甾醇的質(zhì)量(mg)。

2.6 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

精密量取“2.2”項(xiàng)下齊墩果酸對(duì)照品溶液0.2 mL，按“2.5”項(xiàng)下方法處理即得標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定液，將標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定液與“2.4”項(xiàng)下空白制劑溶液于紫外分光光度計(jì)500～700 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描，記錄紫外掃描圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品、空白溶液紫外掃描圖

從圖1可以看出，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在547 nm處有最大特征吸收峰，而空白制劑溶液在(546±2) nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收。這表明本品選擇546 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)具有專(zhuān)屬性，空白制劑溶液對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系 精密量取濃度為0.211 4 mg·mL-1的齊墩果酸對(duì)照品溶液0 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL(相當(dāng)于葡萄糖0.000 00 mg、0.021 14 mg、0.042 28 mg、0.063 42 mg、0.084 56 mg、0.105 70 mg、0.126 84 mg、0.147 98 mg、0.169 12 mg)分別置入15 mL具塞試管中，按照“2.5樣品測(cè)定”項(xiàng)方法處理且測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系檢測(cè)結(jié)果

以齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 齊墩果酸線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖2可以得到，線性方程為y=10.496x-0.022 4，R2=0.999 3。這表明三萜及甾醇質(zhì)量在0～0.169 12 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 按“2.7方法學(xué)考察”平行稱(chēng)取6份供試品，測(cè)定并計(jì)算三萜及甾醇含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，6份供試品的三萜及甾醇平均含量為2.402 2%，RSD為0.73%<2%，這表明此方法精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性考察 精密稱(chēng)取本品1.065 41 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，后按“2.5樣品

測(cè)定”項(xiàng)方法處理，處于室溫下放置，1 h 內(nèi)每隔10 min測(cè)定1次吸光度值，后續(xù)于2、4、6、8、12 h各測(cè)定1次吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

以測(cè)定時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制穩(wěn)定性考察曲線圖，見(jiàn)圖3。

圖3 供試品溶液穩(wěn)定性考察曲線

結(jié)合表3、圖3看出，供試品溶液吸光度值在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.23%<2%，1 h后吸光度值顯著升高，穩(wěn)定性明顯下降，因此配置好的供試品溶液應(yīng)在1 h內(nèi)完成吸光度測(cè)定。

2.7.4 準(zhǔn)確度考察 分別平行精密稱(chēng)取已知三萜及甾醇含量約為2.4%的樣品3組，每組約0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。每組分3管，共9管，各取0.2 mL供試品溶液。第一組按供試品溶液所含三萜及甾醇質(zhì)量的約50%添加“2.2”項(xiàng)下齊墩果酸對(duì)照品、第二組按供試品溶液所含三萜及甾醇質(zhì)量的約100%添加“2.2”項(xiàng)下齊墩果酸對(duì)照品、第三組按供試品溶液所含三萜及甾醇質(zhì)量的約150%添加“2.2”項(xiàng)下齊墩果酸對(duì)照品(即分別添加濃度為0.211 4 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液0.12 mL、0.23 mL和0.35 mL)，與供試品溶液混合后按“2.5”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

加標(biāo)回收計(jì)算公式：

表4 加標(biāo)回收率結(jié)果

從表4可以看出，三萜及甾醇的平均加標(biāo)回收率為101.99%，RSD為1.44%<2%，加標(biāo)回收率符合規(guī)定，表明此方法準(zhǔn)確度良好。

3 樣品含量測(cè)定

取三批產(chǎn)品試樣，每批產(chǎn)品平行取兩份樣品。精密稱(chēng)取樣品約1 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.5樣品測(cè)定”方法測(cè)定吸光度值并按照“2.5樣品測(cè)定”中公式計(jì)算三萜及甾醇的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品中三萜及甾醇含量檢測(cè)結(jié)果

從表5可以看出，三批次產(chǎn)品試樣每一批次產(chǎn)品的三萜及甾醇含量均在2.4 g/100 g左右，且批次內(nèi)的RSD值均<2%，表明此方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。

4 結(jié)果與意義

本研究結(jié)果表明，紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定靈芝菌絲中三萜及甾醇含量，在0～0.169 12 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度RSD為0.73%。樣品溶液在配制后1 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好，平均加標(biāo)回收率為101.99%，RSD為1.44%。此方法適用于測(cè)定靈芝菌絲體中三萜及甾醇含量。

靈芝菌絲體含有與靈芝相同的三萜及甾醇，具有廣泛的生理活性和良好的應(yīng)用前景，且通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)量大，周期短，常年可行，這使其很可能成為靈芝類(lèi)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的又一重點(diǎn)[9-10，17]。盡管目前色譜法和紫外-可見(jiàn)分光光度法均廣泛用于靈芝三萜及甾醇含量測(cè)定，但色譜法未收載于《中國(guó)藥典》和國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8，12-16，18]。因此，在制定靈芝菌絲類(lèi)產(chǎn)品統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)優(yōu)先采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其三萜及甾醇含量。