管翠翠 邱 礽,3 李潔瓊 蔣長(zhǎng)軍 姚倫廣,3

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院, 南陽(yáng) 473061; 2.河南省畜禽保健品工程技術(shù)研究中心, 南陽(yáng) 473061; 3.河南省伏牛山昆蟲(chóng)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和河南省昆蟲(chóng)生物反應(yīng)器工程實(shí)驗(yàn)室, 南陽(yáng) 473061)

抗菌肽(AMPs)是所有生物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1], 在免疫應(yīng)答中通過(guò)直接殺傷或刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞, 從而發(fā)揮抗細(xì)菌、抗真菌、抗寄生蟲(chóng)和抗癌等多種防御特性[2]。目前發(fā)現(xiàn)了魚(yú)類(lèi)特有的抗菌肽: piscidin家族及防御素、cathelicidin、hepcidin家族[3]。防御素通常含有18—45個(gè)氨基酸和3—4個(gè)二硫鍵[4]。在哺乳動(dòng)物中, 根據(jù)防御素的結(jié)構(gòu)可以分為3個(gè)不同的亞家族(α-、β-和θ-防御素)[5]。魚(yú)類(lèi)的防御素只有β-防御素樣蛋白[6], 含有6個(gè)保守的半胱氨酸, 可以形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6三對(duì)二硫鍵[7]。魚(yú)類(lèi)防御素被證明具有多種功能, 包括抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性等[8]。很多研究也表明, 重組或合成防御素能夠直接抑制革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌及一些病毒的生長(zhǎng)[9,10]。

大口黑鱸(Micropterus salmoides)屬于鱸形目、太陽(yáng)魚(yú)科, 黑鱸屬, 原產(chǎn)于美國(guó)加利福尼亞州,于1983年引入中國(guó), 因其易養(yǎng)殖、生長(zhǎng)迅速、肉質(zhì)肥美、抗病能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛養(yǎng)殖。但近些年來(lái)人們發(fā)現(xiàn), 在養(yǎng)殖大口黑鱸時(shí), 其可能患上氣泡病、水霉病、爛鰓病、脂肪肝病及腸炎病等十幾種病, 急需采取措施改善這一現(xiàn)狀。由于防御素對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用而不易在細(xì)菌中高效表達(dá),且其在原核系統(tǒng)中的表達(dá)具有不能正確折疊, 缺少翻譯后的修飾等缺點(diǎn), 所以具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)真核基因表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成為一個(gè)較為理想的防御素基因表達(dá)系統(tǒng), 并且由于p10和polh啟動(dòng)子是晚期基因表達(dá)的強(qiáng)活性啟動(dòng)子, 所以可以高效表達(dá)防御素基因。在本研究中, 我們通過(guò)分析大口黑鱸β-防御素基因(MSBdefe), 并通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng), 進(jìn)行了MSBdefe重組蛋白表達(dá)及其抑菌功能的鑒定。本研究將為開(kāi)發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種與表達(dá)載體大腸桿菌E.coliTOP10菌株; 質(zhì)粒pYBDM-IM是由本實(shí)驗(yàn)室改造pFBDM所得, 缺失掉SpeⅠ酶切位點(diǎn), 在SphⅠ位點(diǎn)和KpnⅠ位點(diǎn)之間插入核糖體結(jié)合位點(diǎn)的IRES 基因(簡(jiǎn)寫(xiě)為Ⅰ)和起報(bào)告基因作用的紅色熒光蛋白基因Mecherry(簡(jiǎn)寫(xiě)為M), 而其中的IRES有助于其紅色熒光蛋白的表達(dá)顯示; 菌株Ac MμLtiBac/rSW106/asd–/inv+,Sf9細(xì)胞、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)由本實(shí)驗(yàn)室保存, 大口黑鱸購(gòu)買(mǎi)自附近養(yǎng)殖場(chǎng)。

主要試劑KOD-Plus-Neo高保真酶購(gòu)自TOYOBO公司, 限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司;提質(zhì)粒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司; ExTaq酶購(gòu)自寶生物; 鎳親和層析介質(zhì)、增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒、抗生素購(gòu)自Solarbio公司; pEASY-Blunt Zero Cloning Kit, Trans2K Plus DNA Marker, TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金; Biospin Virus DNA/RNA Extraction Kit 試劑盒購(gòu)自BioFlux公司; T4 DNA Ligase、蛋白預(yù)染Marker、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900 ⅢSFM購(gòu)自賽默飛; 6×His, His-Tag Mouse Monoclonal antibody、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)購(gòu)自Proteintech Group公司。

1.2 方法

MSBdefe的序列分析通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大口黑鱸基因組文庫(kù), 發(fā)現(xiàn)一個(gè)核酸序列同之前報(bào)道的大口黑鱸β-防御素基因(GenBank: XP0385 64716)完全一致。通過(guò)DNAMAN對(duì)大口黑鱸β-防御素(MSBdefe)與GenBank中的部分硬骨魚(yú)類(lèi): 歐洲鱸(QZN83614)、條石鯛(AJA33388)、鱖(ACO88907)、大西洋白姑魚(yú)(ASW20415)、長(zhǎng)棘銀鱸(QNV47918)、馬拉巴若鲹(QJW82620)、點(diǎn)帶石斑魚(yú)(AFA41485)、鯔(QOS14209)、卵形鯧鲹(AWY04221)、泰國(guó)鱧(QJW82621)、小鼠(AAT67592)及人類(lèi)(NP001035792)的β-防御素進(jìn)行同源性比對(duì)。

MSBdefe的克隆與載體構(gòu)建根據(jù)昆蟲(chóng)密碼子偏愛(ài)性, 對(duì)MSBdefe基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后, 由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成, 序列克隆5′端引入SmaI酶切位點(diǎn)(CCCGGG)和Flag標(biāo)簽(DYKDDDDK), 3′端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn), 酶切位點(diǎn)前添加8個(gè)His標(biāo)簽和終止密碼子(TAA), 以保證目的基因的檢測(cè)和純化。添加標(biāo)簽后, 表達(dá)基因序列長(zhǎng)度達(dá)到345 bp。目的基因插入pUC57載體中, 得到pUC-MSBdefe質(zhì)粒。MSBdefe區(qū)域檢測(cè)引物用Primer Premier5.0軟件分析設(shè)計(jì), 只針對(duì)目的片段其中305 bp進(jìn)行擴(kuò)增, 設(shè)計(jì)的引物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成, 上游引物MSBdefeJCF:ATGGATTACAAGGATGACGAC, 下游引物MSBdefeJCR: CAGCAGAATGCCCAGAGTC。

構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體用SmaⅠ/XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切pUC-MSBdefe上的目的基因, 將其與經(jīng)SmaⅠ/XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切的供體載體pYBDM-IM按1﹕7(摩爾比)混合, 在T4 DNA連接酶作用下4℃孵育過(guò)夜后, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌落PCR和SmaⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為MSBdefe-pYBDM-IM。

重組Bacmid菌株的獲得將5 μL重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒MSBdefe-pYBDM-IM加到100 μL大腸桿菌感受態(tài)Ac MultiBac/rSW106/asd–/inv+中, 冰浴30min,待冰浴時(shí)間到后迅速在42℃水浴鍋中熱激90s, 待熱激結(jié)束, 將感受態(tài)轉(zhuǎn)移至冰上, 孵育3min后加入1 mL含有DAP的LB培養(yǎng)基, 32℃, 200 r/min, 振蕩培養(yǎng)5—6h。離心后將適量菌液涂布于含有DAP/Kan/Tet/Spe/IPTG/X-Gal/Gm的LB篩選平板, 32℃培養(yǎng)48h,直至出現(xiàn)藍(lán)白斑, 挑取白斑菌落用特異性引物MSBdefeJCF, MSBdefeJCR進(jìn)行菌落PCR鑒定, 將鑒定正確的陽(yáng)性Bacmid菌落命名為MSBdefe-pYBDMIM-Am。

重組桿狀病毒的構(gòu)建將構(gòu)建好的Bacmid菌液感染Sf9細(xì)胞, 具體過(guò)程為: 取1 mLMSBdefepYBDM-IM-Am菌液于1.5 mL滅菌管中, 5000 r/min離心3min收集菌體并棄上清。用1 mL無(wú)菌水重懸菌體, 5000 r/min離心3min收集菌體并棄上清, 重復(fù)洗4—5次。加入1 mL Sf-900 Ⅲ SFM培養(yǎng)基重懸, 此時(shí)菌液濃度記為100。按1﹕10倍梯度稀釋, 將菌液濃度稀釋成10–1、10–2和10–3。將稀釋后的菌液依次加入培養(yǎng)有Sf9細(xì)胞的24孔板中, 每孔500 μL。28℃孵育4h后棄去上清, 用培養(yǎng)基清洗3次后每孔加入500 μL培養(yǎng)基, 28℃孵育3—5d, 在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察是否有紅色熒光出現(xiàn), 判斷桿狀病毒是否重組成功。收集200 μL感染重組病毒的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)基上清, 使用BioFlux公司Biospin Virus DNA/RNA Extraction Kit試劑盒提取重組桿狀病毒DNA。以重組桿狀病毒DNA為模板, 用MSBdefe基因的檢測(cè)引物MSBdefeJCF, MSBdefeJCR進(jìn)行PCR鑒定, 重組病毒命名為AV-MSBdefe。

重組蛋白表達(dá)及鑒定收集200 mLAV-MSBdefe感染的Sf9細(xì)胞, 3000 r/min離心去掉細(xì)胞培養(yǎng)基后用PBS清洗1—2次, 加適量PBS重懸, 在冰上進(jìn)行超聲破碎直至溶液透亮。3000 r/min離心10min獲得上清, 將上清經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后, 用帶有His標(biāo)簽的Ni柱進(jìn)行純化, 純化蛋白凍于–80℃保存,以備檢測(cè)。蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后, 轉(zhuǎn)移到PVDF膜上, 脫脂奶粉封閉1h后, 分別用抗His的鼠單克隆抗體為一抗, HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗各孵育1h, 用最新配置的DAB顯色試劑進(jìn)行顯色。

重組蛋白體外抑菌活性檢測(cè)采用平板涂布法檢測(cè)MSBdefe重組蛋白抑菌活性。具體過(guò)程為: 將嗜水氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基中,28℃、200 r/min培養(yǎng)12h, 至A600為1.0, 菌液梯度稀釋至1×104CFU/mL。分別添加終濃度為30、15 和7.5 μg/mL的MSBdefe重組蛋白, 每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù), 28℃培養(yǎng)2h后, 取100 μL涂于無(wú)抗固體LB平板上, 陰性對(duì)照為PBS處理組, 同樣做3個(gè)重復(fù), 28℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù), 并使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行分析。

式中,A1為實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù),A2為陰性對(duì)照組的菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 同源序列分析

MSBdefe基因編碼63個(gè)氨基酸殘疾, BLAST分析表明,MSBdefe與一些硬骨魚(yú)的β-防御素的序列同源性可以達(dá)到92.06%—98.41%。和歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、鱖(Siniperca chuatsi)、大西洋白姑魚(yú)(Argyrosomus regius)、長(zhǎng)棘銀鱸(Gerres filamentosus)、馬拉巴若鲹(Carangoides malabaricus)、點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)、鯔(Mugil cephalus)、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)和泰國(guó)鱧(Channa striata)的同源性分別達(dá)到98.41%、96.83%、96.83%、95.31%、95.24%、93.65%、93.65%、92.54%、92.06%和92.06%。同人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分別達(dá)到30.67%和26.03%。序列比對(duì)同時(shí)顯示MSBdefe的6個(gè)半胱氨酸同其他高等和低等脊椎動(dòng)物中都是保守的。

2.2 克隆載體MSBdefe-bluntzero的合成

針對(duì)MSBdefe基因進(jìn)行昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá), 采用同義置換進(jìn)行昆蟲(chóng)氨基酸密碼子優(yōu)化, 對(duì)MSBdefe進(jìn)行基因合成, 并在該氨基酸的N端加Flag標(biāo)簽序列DYKDDDDK, C端加8個(gè)His標(biāo)簽, 合成的質(zhì)粒pUC-MSBdefe包含345個(gè)核苷酸, 理論分子量為12.2 kD。序列如下: CCCGGGATGGATT ACAAGGATGACGACGATAAGAGGACCCTCGC CATCCTTGCTGCCATTCTCCTGGTGGCCCT GCAGGCCCAGGCTGAGCCACTCCAGGCAA GAGCTGATGAGGTTGCTGCAGCCCCGGAG CAGATTGCAGCGGACATCCCAGAAGTGGT TGTTTCCCTTGCATGGGACGAAAGCTTGGC TCCAAAGCATCCAGGCTCAAGGAAAAACAT GGCCTGCTATTGCAGAATACCAGCGTGCAT TGCAGGAGAACGTCGCTATGGAACCTGCATC TACCAGGGAAGACTCTGGGCATTCTGCTGC CACCACCACCACCACCACCACCACTAACTC GAG。

2.3 轉(zhuǎn)移載體及重組菌株的構(gòu)建

對(duì)合成的質(zhì)粒pUC-MSBdefe進(jìn)行SmaⅠ/XhoⅠ酶切, 同轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pYBDM-IM進(jìn)行連接, 獲得重組質(zhì)粒MSBdefe-pYBDM-IM, 進(jìn)行SmaⅠ/XhoⅠ酶切鑒定, 切出345 bp的目的條帶, 和預(yù)計(jì)分子量一致,這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)移質(zhì)粒MSBdefe-pYBDM-IM構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒MSBdefe-pYBDM-IM轉(zhuǎn)化Ac MultiBac/rSW106/asd–/inv+感受態(tài)細(xì)胞后, 進(jìn)行菌落PCR鑒定, 電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到305 bp左右的片段, 得到重組菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am。

2.4 桿狀病毒的重組及檢測(cè)結(jié)果

將重組菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am直接感染Sf9細(xì)胞, 3d后倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察到有明顯紅色熒光的細(xì)胞, 細(xì)胞低速離心后, 收集上清, 獲得病毒, 進(jìn)行多代感染, 3d后細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光, 表明獲得了重組桿狀病毒(圖1)。提取重組桿狀病毒基因組, 以MSBdefeJCF和MSBdefeJCR為引物, 進(jìn)行PCR鑒定, 可擴(kuò)增出305 bp左右的目的條帶, 與理論值一致, 說(shuō)明獲得了含有MSBdefe基因的重組桿狀病毒AV-MSBdefe。

圖1 熒光顯微鏡觀(guān)察重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞Fig.1 Microscopy observation of infected Sf9 cells by recombinant virus

2.5 重組蛋白純化及Western鑒定結(jié)果

收集感染AV-MSBdefe的Sf9細(xì)胞, 在超聲波破碎后, 進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 考馬斯亮藍(lán)染色, 可觀(guān)察到約在相對(duì)分子質(zhì)量12.2 kD處有明顯可見(jiàn)的條帶, 用帶有His標(biāo)簽的Ni柱進(jìn)行親和層析, 獲得12.2 kD的純化蛋白, 進(jìn)一步通過(guò)Western Blot驗(yàn)證, 表達(dá)蛋白可以同抗His的小鼠抗體進(jìn)行結(jié)合(圖2), 說(shuō)明重組蛋白得到了特異性表達(dá)。

圖2 MSBdefe蛋白Western Blot鑒定結(jié)果Fig.2 Western Blot of MSBdefe protein

2.6 MSBdefe重組蛋白抑菌活性檢測(cè)

如圖3所示, 與陰性對(duì)照PBS相比, 嗜水氣單胞菌與重組蛋白作用后, 平板上的菌落數(shù)明顯減少(圖3a)。通過(guò)GraphPad Prism 9軟件分析顯示終濃度為30 μg/mL的MSBdefe重組蛋白對(duì)嗜水氣單胞菌具有顯著的抑菌作用, 細(xì)菌存活率為17.00%, 抑菌效率為83.00%。并隨著梯度稀釋2倍和4倍后, 即終濃度為15 和7.5 μg/mL時(shí), 抑菌效果逐漸減弱, 抑菌效率分別為54.33%和33.67%(圖3b)。這證明MSBdefe重組蛋白具有較好的抑菌活性。

圖3 不同濃度重組蛋白體外抑菌分析結(jié)果Fig.3 In vitro antibacterial analysis results of MSBdefe protein at different concentrations

3 討論

近年來(lái), 隨著病原體耐藥性的增加, 人們對(duì)后抗生素時(shí)代的擔(dān)憂(yōu)迫使人們需要找到現(xiàn)有抗生素的替代品。β-防御素是一類(lèi)富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽, 具有廣譜活性、反應(yīng)時(shí)間快、耐藥水平低和對(duì)宿主毒性最小等優(yōu)點(diǎn), 通過(guò)對(duì)入侵病原體的抗菌活性在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用, 具有廣闊的應(yīng)用前景。如何通過(guò)基因工程手段進(jìn)行防御素的大批量生產(chǎn)至關(guān)重要。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白質(zhì)表達(dá)有其局限性, 例如對(duì)新生肽鏈無(wú)翻譯后加工能力、以致表達(dá)產(chǎn)物缺乏應(yīng)有的生物學(xué)活性, 故不適合作為真核基因表達(dá)的宿主[11]。真核酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)多年發(fā)展已經(jīng)具備了成熟的發(fā)酵工藝, 來(lái)提高產(chǎn)量, 但酵母表達(dá)系統(tǒng)依然存在短板, 大多數(shù)重組蛋白表達(dá)量低, 而且可能會(huì)出現(xiàn)切割目的蛋白的情況出現(xiàn), 并且存在過(guò)度糖基化的問(wèn)題。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的宿主主要是以昆蟲(chóng)細(xì)胞為主, 因?yàn)槔ハx(chóng)細(xì)胞具有類(lèi)似哺乳動(dòng)物的翻譯后加工修飾的能力, 能夠正確折疊并表達(dá)蛋白,具有糖基化、磷酸化和酰胺化等翻譯后修飾功能,并能夠?qū)π盘?hào)肽進(jìn)行識(shí)別, 使其形成正確的高級(jí)結(jié)構(gòu), 保留其生物活性, 與哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的差別很小。這些修飾對(duì)于所表達(dá)產(chǎn)物在生物活性、抗原性和免疫都接近于天然產(chǎn)物。并且由于多角體強(qiáng)啟動(dòng)子polh和p10的存在, 能夠獲得高水平的重組蛋白表達(dá), 目標(biāo)蛋白表達(dá)量可達(dá)到總蛋白的50%[12,13]。

在魚(yú)類(lèi)中, β-防御素首先在紅鰭東方鲀 (Takifugu rubripes)、斑點(diǎn)綠色河鲀(Tetraodon nigroviridis)和斑馬魚(yú)(Danio rerio)中發(fā)現(xiàn)[14]。作為AMPs的典型成員, β-防御素具有直接的抗菌活性。在本研究中, 我們對(duì)MSBdede進(jìn)行了序列分析比對(duì)工作,發(fā)現(xiàn)MSBdede和其他物種的β-防御素有著相似的結(jié)構(gòu), 都含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基, 這些半胱氨酸殘基參與了成熟肽區(qū)域內(nèi)的三個(gè)分子二硫鍵, 這是防御素的主要特征。這些二硫鍵在維持防御素結(jié)果和抗菌功能方面起著重要作用[15]。本研究將MSBdefe克隆到轉(zhuǎn)移載體pYBDM-IM上, 通過(guò)Tn7位點(diǎn)轉(zhuǎn)座到Bacmid基因組中, 由多角體啟動(dòng)子p10啟動(dòng),從而在Sf9細(xì)胞中大量表達(dá)MSBdefe重組蛋白。Tn7位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座為零背景轉(zhuǎn)座, 大大提高了轉(zhuǎn)化效率, 該系統(tǒng)利用缺失asd型的rSw106inv菌株可以通過(guò)直接感染Sf9細(xì)胞的方式進(jìn)行重組病毒的構(gòu)建,省去了大質(zhì)粒提取和用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的麻煩,具有更高效率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。最終利用獲得的重組Bacmid菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am, 通過(guò)多輪感染, 在培養(yǎng)基中獲得高滴度的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒AV-MSBdefe。Western Blot結(jié)果顯示感染了AVMSBdefe重組病毒的Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了帶有His標(biāo)簽的MSBdede蛋白。這說(shuō)明利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了MSBdede蛋白。

之前在魚(yú)類(lèi)中已經(jīng)有一些β-防御素抗菌功能研究成果, 且不同魚(yú)類(lèi)β-防御素的抑菌譜存在差異。例如: 利用真核哺乳細(xì)胞表達(dá)的金頭鯛β-防御素重組蛋白對(duì)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性, 而對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)和哈維氏弧菌(Vibrio harvey)等其他魚(yú)類(lèi)病原體表現(xiàn)出較弱的抑菌活性[16]; 化學(xué)方法合成的香魚(yú)β-防御素蛋白對(duì)嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的直接抑菌活性, 而對(duì)鰻弧菌等其他6種細(xì)菌的抑菌活性較弱[17]。對(duì)鱖β-防御素進(jìn)行多拷貝基因的酵母重組表達(dá), 重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌的副溶血性弧菌抑菌作用顯著[18]。構(gòu)建斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素的重組表達(dá)酵母菌株, 其重組菌株具有明顯抑制革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌及革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌的活性[19]。在之前的研究中, 還發(fā)現(xiàn)不同魚(yú)類(lèi)β-防御素抑菌濃度存在差異。例如: 從文昌魚(yú)(Branchiostoma japonicum)中克隆大防御素基因(Bjbd), 并利用原核表達(dá)對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究, 研究表明在62.5 μg/mL濃度下, 對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)生長(zhǎng)均有顯著抑制作用[20]; 通過(guò)同源克隆技術(shù)從草魚(yú)的腦、肝及部分黏液組織中克隆β-防御素基因, 在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白并研究其抑菌活性。抑菌結(jié)果表明重組蛋白在1 μg/μL濃度下對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑菌效率在90%以上[21];原核重組斑馬貽貝(Dreissena polymorpha)的防御素蛋白對(duì)部分革蘭氏陰性菌如摩根菌(Morganellasp.)、類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)、遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)、大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活性較強(qiáng), 其MIC分別為0.35、0.43、1.16、6.46和30.39 μmol/L, 但對(duì)其他一些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌作用較弱[22]。原核重組石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)的β-defensin蛋白對(duì)8株細(xì)菌進(jìn)行了抗菌分析, 其中包括5株革蘭氏陰性菌: 大腸桿菌(Escherichia coli)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和3株革蘭氏陽(yáng)性菌株: 蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus)。結(jié)果顯示, 重組石斑魚(yú)β-defensin蛋白濃度達(dá)512 μg/mL時(shí), 8株菌的存活率均低于10%[9]。 我們選擇淡水魚(yú)類(lèi)最常見(jiàn)的病原菌嗜水氣單胞菌為指示菌, 研究了大口黑鱸β-defensin真核重組蛋白的抑菌活性, 結(jié)果表明, 當(dāng)MSBdefe重組蛋白的終濃度為30 μg/mL時(shí), 抑菌效率達(dá)到83.00%, 證明大口黑鱸β-defensin真核重組蛋白有明顯的抑菌活性。這說(shuō)明不同來(lái)源的魚(yú)類(lèi)抗菌肽有著不同的抑菌功能, 且抑菌活力也有較大差異。

總之, 在本研究中, 構(gòu)建了基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的MSBdede表達(dá)菌株, 并通過(guò)零背景轉(zhuǎn)座, 高效獲得含有MSBdede的重組桿狀病毒, 感染Sf9細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)了MSBdede重組蛋白, 體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出MSBdefe重組蛋白對(duì)嗜水氣單胞菌活性有較強(qiáng)的抑制作用。為利用昆蟲(chóng)生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)魚(yú)類(lèi)β-防御素奠定了基礎(chǔ)。