謝敏敏 王亞坤 魏成清 陳 辰 劉曉莉 李 偉 洪孝友 朱新平

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380)

微衛(wèi)星DNA也稱為簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列 (Simple Sequence Repeats, 簡(jiǎn)稱SSRs), 是由1—6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位而多次串聯(lián)的 DNA 序列, 它在水產(chǎn)動(dòng)物的研究領(lǐng)域利用最為普遍、并且十分有效, 可以將它應(yīng)用于各類經(jīng)濟(jì)物種、瀕危物種的遺傳多樣性檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及種群的親緣鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)等方面的研究[1—9]。

黿(Pelochelys cantorii)屬于龜鱉目(Testudines)、鱉科(Trionychidae)、黿屬(Pelochelys), 是我國(guó)地區(qū)體型最大的水生龜鱉動(dòng)物之一, 也是整個(gè)珠江流域,乃至我國(guó)南部地區(qū)水系生態(tài)系統(tǒng)健康的重要指示物種[10]。并且, 由于黿的種族延續(xù)歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)[11],因此它在對(duì)歷史環(huán)境變化的研究以及生物進(jìn)化方面的研究都具有十分重要的科學(xué)價(jià)值。但是, 由于不正當(dāng)?shù)馁Q(mào)易、人類的濫捕濫殺及水利工程等, 黿的生存環(huán)境不斷惡化, 其群數(shù)量大幅減少。如今,黿已成為極端瀕危物種, 2020年9月, 據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示, 我國(guó)目前僅人工保圈養(yǎng)條件下保有13只性成熟的黿[12,13]。國(guó)外黿種群數(shù)量也在20世紀(jì)迅速減少[14—16], 黿在全球范圍內(nèi)的物種延續(xù)都面臨著嚴(yán)酷的挑戰(zhàn)。因此, 為了加強(qiáng)對(duì)黿的保護(hù), 我國(guó)在早在1989年就將黿定為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)水生野生保護(hù)動(dòng)物[17,18]。2014年7月至2021年6月, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所人工馴養(yǎng)保護(hù)的4只親黿(2雌2雄)已產(chǎn)下孵育了800多只不同規(guī)格的子一代黿[19,20], 但其遺傳信息還未知。為了保證圈養(yǎng)群體的遺傳多樣性處于適于中高度的水平、避免近交危害黿人工保種群體的健康, 并在未來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)自然群體的增殖, 本論文擬探究人工馴養(yǎng)條件下子一代黿的遺傳信息并建立親子鑒定技術(shù), 意在為瀕危動(dòng)物黿人工保種工作提供科學(xué)理論基礎(chǔ)和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)用子一代黿包含2021年生產(chǎn)的56個(gè)個(gè)體。56只子一代黿均來(lái)自高明黿繁育保護(hù)基地人工馴養(yǎng)的4只親本(2♀, 2♂)。收集同年但不同窩次的受精卵在人工控溫控濕條件下孵化, 待稚黿孵出后收集其脫落的臍帶, 浸泡于無(wú)水乙醇中并做好標(biāo)記, ?20℃保存。其每窩包含的個(gè)體數(shù)量如表1, 按所屬窩次編號(hào), 若為第1窩則編號(hào)為“1-x”, 屬第2窩則編號(hào)為“2-x”。

表1 孵出子代黿臍帶采樣數(shù)量Tab.1 Number of hatching progenitor turtles umbilical cord samples

1.2 基因組DNA提取

剪臍帶約10 μL, 按照說(shuō)明書的方法, 使用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒(OMEGA)提取基因組DNA, 使用NanoQTM微型分光光度計(jì)(博奧)檢測(cè)所提取DNA的OD值及濃度, 并使用1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試其完整性, 隨后轉(zhuǎn)入–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)與篩選

利用本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的黿的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公布), 采用MISA軟件挖掘黿轉(zhuǎn)錄組序列中的微衛(wèi)星標(biāo)記(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/), 再通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0進(jìn)行三、四核苷酸重復(fù)及核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列的篩選。進(jìn)行PCR擴(kuò)增前, 將所有引物稀釋至10 μmol/L, 再將每對(duì)引物按照上下游1﹕40的比例進(jìn)行混合, 3種熒光接頭均稀釋至20 μmol/L。建立10 μL多重PCR反應(yīng)體系:AB Multiplex PCR Master Mix 5 μL, 混合引物(含上下游)2 μL, 熒光接頭0.2 μL, 去離子水1.8 μL。30—150 ng/L的DNA 1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 60℃退火45s, 72℃延伸70s(24個(gè)循環(huán)); 94℃變性30s, 53℃退火40s, 72℃延30s(8個(gè)循環(huán)); 72℃再延伸10min。在 ABI3730 自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行熒光信號(hào)的收集, 利用毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行基因型檢測(cè)(測(cè)序過(guò)程由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司完成)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Popgene軟件[21]計(jì)算各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)。用CERVUS3.0軟件[22]計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)。

本實(shí)驗(yàn)以孟德?tīng)栠z傳定律為判定親子關(guān)系的理論依據(jù)。由于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的所有子代個(gè)體均知曉其屬于當(dāng)年產(chǎn)出的第幾窩, 因此母本均為確定母本,父本為疑似父本, 可以采用排除法進(jìn)行父權(quán)鑒定。根據(jù)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物建立0、1數(shù)據(jù)矩陣, 即記錄每個(gè)個(gè)體在相同的遷移位置上的條帶狀況, 有條帶的記為1, 反之則記為0。再利用 NTSYS軟件[23], 基于Nei’s 遺傳相似系數(shù)對(duì)遺傳數(shù)據(jù)的 UPGMA(非加權(quán)類平均)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA的提取與質(zhì)檢

本實(shí)驗(yàn)用1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA的完整性, 根據(jù)結(jié)果可知DNA完整性較好、條帶明亮;接著使用NanoQTM微型分光光度計(jì)(博奧)測(cè)定A260/A280, 結(jié)果顯示每個(gè)個(gè)體的DNA值分布于1.82—1.92, 表明其純度較高。即DNA質(zhì)量可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性篩選

搜索轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR, 并進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 成功設(shè)計(jì)出3萬(wàn)余對(duì)三核苷酸及四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星引物序列, 其中三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星引物序列67.73%, 其中(AAT)n數(shù)目最多, 占6.00%; 四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星引物序列32.27%, 其中(AAAG)n數(shù)目最多, 占6.67%。隨機(jī)挑選其中230對(duì)引物, 經(jīng)第一次篩選出153對(duì)能擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶的引物, 再挑選子代個(gè)體DNA進(jìn)行二次篩選, 發(fā)現(xiàn)僅有10對(duì)引物具多態(tài)性,占比為6.53%。10對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物相關(guān)信息見(jiàn)表2,引物在個(gè)體中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜效果如圖1及圖2所示。在使用ABI3130多功能基因遺傳分析儀進(jìn)行遺傳分型時(shí), 為降低基因型測(cè)序的成本,將帶有不同熒光基團(tuán)的PCR產(chǎn)物分組, 進(jìn)行混合測(cè)序。本試驗(yàn)將10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分為2組(表3)。

表3 衛(wèi)星標(biāo)記分組情況Tab.3 The grouping of microsatellite markers

圖1 引物Xm86在隨機(jī)個(gè)體中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.1 Capillary electrophoresis of PCR amplification products of primer Xm86 in random individuals

圖2 引物Xm86在隨機(jī)個(gè)體中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.2 Capillary electrophoresis of PCR amplification products of primer Xm86 in random individuals

表2 黿微衛(wèi)星引物序列及擴(kuò)增信息Tab.2 Primers and amplification information of Pelochelys cantorii microsatellite

2.3 群體遺傳多樣性分析

2個(gè)PCR組合所包含的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均能夠在黿的56個(gè)個(gè)體中擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的DNA條帶,每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2—4; PIC為0.306—0.684; 群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)為–0.6970—0.1418。有效等位基因數(shù)(Ne)為1.2800—3.0521, 觀測(cè)雜合度(Ho)為0.250—0.929, 平均為0.6305; 期望雜合度(He)為0.221—0.678, 平均為0.4767; 香農(nóng)多樣性指數(shù)(I)為0.3768—1.0290, 平均為0.7182。每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)雙親基因型均未知時(shí)單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的非排除概率(NE-1P), 已知單親基因型時(shí)單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的非排除概率(NE-2P), 兩個(gè)親本基因型已知時(shí)的非排除概率(NE-PP)如表4所示。并且, 排除概率會(huì)隨著微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)的增多而增大。10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的累積排除概率分別為73.14%(NE-1P)、90.98%(NE-2P)和98%(NE-3P)。

表4 子一代黿在10對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多樣性指數(shù)Tab.4 Diversity index of subgeneration Soft-shelled turtles at 10 pairs of microsatellite loci

2.4 聚類分析比較

NTSYS聚類結(jié)果如圖3所示, 根據(jù)每個(gè)個(gè)體實(shí)際所屬的窩次推斷軟件分析所得親本的親本是否正確。經(jīng)過(guò)計(jì)算, 若只考慮母本, 推演正確率為89.29%; 若同時(shí)考慮父母本, 則正確率為80.36%。

圖3 NTSYS 軟件聚類分析Fig.3 Cluster analysis of NTSYS software

2.5 親本后代數(shù)的比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)群體中每個(gè)雌黿與雄黿都育有后代, 但每個(gè)親本的后代數(shù)都不同。結(jié)合當(dāng)年繁殖季節(jié)的觀察記錄, 可知兩只母本分別誕下共2窩(第1與第5窩)與4窩(第2、3、4及第6窩)子代(表5),母本的后代數(shù)在群體總后代中貢獻(xiàn)率分別為33.93%和66.07%。

表5 每個(gè)子代個(gè)體的親緣關(guān)系Tab.5 Genetic relationship of each progeny

3 討論

3.1 子一代黿的遺傳信息

本研究使用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行遺傳參數(shù)分析, 位點(diǎn)多態(tài)信息含量為0.306—0.6840, 其均值為0.3829。Schultz等[24]認(rèn)為PIC>0.5為高多態(tài)性信息含量, 0.5>PIC>0.25的信息含量為中等適度, 而PIC<0.25為低信息含量, 本實(shí)驗(yàn)所選用的標(biāo)記位點(diǎn),包含高度多態(tài)標(biāo)記2個(gè)(PIC≥0.5), 中度多態(tài)標(biāo)記8個(gè), 無(wú)低信息含量位點(diǎn)。由10個(gè)位點(diǎn)分析可得, 黿2021年子一代群體的觀測(cè)雜合度(Ho)為0.250—0.929, 平均為0.6305; 期望雜合度(He)為0.221—0.678, 平均為0.4767。金鈴等[25]同樣利用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)兩個(gè)紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)群體進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析, 其平均Ho為0.464, 平均He為0.557。相比之下, 可見(jiàn)2021年的黿子一代群體的遺傳多樣性處于中度水平。同時(shí)與瀕危龜鱉類比較, 荊勝利等[26]用18對(duì)引物對(duì)黃緣盒龜(Cuora flavomarginata)的4個(gè)群體進(jìn)行觀測(cè)雜合度測(cè)定, 其He為0.032—0.936, 平均值為0.329; 人工圈養(yǎng)條件下黃喉擬水龜(Mauremys mutica)的觀測(cè)雜合度(Ho)介于0.364—0.921, 平均值為 0.687[27]。相比之下, 可見(jiàn)黿子一代群體遺傳多樣性處于較豐富的水平。

3.2 親子鑒定

通過(guò)上述微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行親子鑒定, 得出累積排除概率分別為73.14% (NE-1P)、90.98%(NE-2P)和98%(NE-3P)。與同樣以少數(shù)親本進(jìn)行圈養(yǎng)繁殖的揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)[28]比較: 當(dāng)雙親的基因型均在未知的情況下, 揚(yáng)子鱷13個(gè)位點(diǎn)累積排除概率為 0.7763; 已知單親基因型時(shí)的累積排除概率為0.9414。這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中所選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)可滿足黿親子鑒定的要求。

本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)NTSYS軟件對(duì)整個(gè)子代群體進(jìn)行聚類, 結(jié)果基本均顯示其可分為2個(gè)亞群, 符合實(shí)際圈養(yǎng)觀察為兩個(gè)母本參與生產(chǎn)的真實(shí)情況。并且, 結(jié)果表明其可進(jìn)一步分為4個(gè)亞群, 也與實(shí)際養(yǎng)殖中4只親黿均參與生殖活動(dòng)的理論子代群體構(gòu)成相映照(♀1×♂1、♀1×♂2、♀2×♂1和♀2×♂2)。由此可見(jiàn), 基于微衛(wèi)星所建立的親子分析技術(shù)的結(jié)果較為可靠。

3.3 親本繁殖力分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì), 母本的后代數(shù)在群體總后代中貢獻(xiàn)率分別為33.93%和66.07%。后代數(shù)在親本中表現(xiàn)差異的現(xiàn)象十分常見(jiàn), 如文萍等[26]利用 89 只雌龜進(jìn)行子代統(tǒng)計(jì), 經(jīng)親子鑒定可明確分配 258 只子代到60 個(gè)母本中, 有29個(gè)母本沒(méi)有被分配子代, 這表明不同母本具有不同的繁殖力?？稍谖磥?lái)子代繁育中, 以個(gè)體繁殖力作為選擇母本的重要參考條件。

經(jīng)過(guò)遺傳聚類分析, 還可發(fā)現(xiàn)每對(duì)親本組合對(duì)子代的貢獻(xiàn)率存在顯著差異。對(duì)于雌性爬行動(dòng)物來(lái)說(shuō), 一妻多夫制可減小近交衰退和遺傳不相容性[29],還可以為同一種群中的所有成熟雄性提供交配的機(jī)會(huì), 以此增加種群的遺傳多樣性[30,31]。例如, 多父性在胎生巖魚(Sebastesspp.)[32]的多重父權(quán)的繁殖策略, 可以作為一種基因上的緩沖方式來(lái)擴(kuò)大該種的適應(yīng)幅度, 以應(yīng)對(duì)自然選擇的壓力, 更利于種群的延續(xù)和散布。

而黿子一代的4個(gè)子代亞群所擁有子代個(gè)體數(shù)不同, 其原因可能是雄性在交配活動(dòng)中競(jìng)爭(zhēng)力的優(yōu)劣, 諸如雌性選擇偏好, 即能夠提供更多更好物質(zhì)利益的雄性會(huì)被雌性優(yōu)先選擇, 以便將這些優(yōu)勢(shì)直接轉(zhuǎn)化為產(chǎn)卵的適宜效應(yīng); 精子濃度與活力差異對(duì)受精結(jié)果的影響; 雌性個(gè)體與雄性個(gè)體之間的固定搭配; 時(shí)間上最后進(jìn)行交配的個(gè)體由于在雌性生殖器中貢獻(xiàn)的精子損失量少、能夠去除前任雄性的精子占比、精子在雌性生殖器中的存放位置等使其更占優(yōu)勢(shì)。諸如此類因素, 都可能造成父權(quán)分配不均的結(jié)果。

然而, 優(yōu)勢(shì)個(gè)體的出現(xiàn)可能會(huì)造成子代群體內(nèi)遺傳多樣性的偏移和減少。在將來(lái)F2的育種中, 可利用分子遺傳手段挑選種黿, 保護(hù)稀有等位基因,通過(guò)兩兩個(gè)體之間的親緣分析, 隔離或遷出親緣關(guān)系對(duì)較多的繁殖雌雄個(gè)體, 進(jìn)而提高黿種群遺傳多樣性的維持能力, 進(jìn)一步改進(jìn)瀕危物種的人工飼養(yǎng)繁殖管理和保護(hù)策略。