劉 琴 賈 釗 陳康勇 朱曉真 王梓璇 陳 靜 王俊亞李耀國 肖調(diào)義 鄒 鈞

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院, 上海 201306; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心, 長沙 410128)

白細胞介素(Interleukin, IL)10是IL-10家族成員之一, 最初被稱為細胞因子合成抑制因子(Cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)[1], 主要由2型先天淋巴細胞(Type 2 innate lymphoid cell, ILC2)和輔助性2型T細胞(T helper 2 cell, Th2)分泌, 具有廣泛的免疫調(diào)控作用[2], 能夠抑制1型輔助性T細胞(T helper 1 cell, Th1)分泌干擾素γ(Interferon gamma,IFN-γ)。此外, IL-10也可由B細胞、嗜酸性粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、上皮細胞和腫瘤細胞等多種細胞產(chǎn)生[3,4], IL-10的細胞來源很大程度取決于刺激物引發(fā)的免疫反應(yīng)強度和作用的部位[5]。

2003年, Zou等[6]首次在紅鰭東方鲀(Fugu rubripes)基因組中發(fā)現(xiàn)il-10基因。此后,il-10在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、斑馬魚(Danio rerio)、大西洋鮭(Salmo salar)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、海鱸(Dicentrarchus labrax)、鯉(Cyprinus carpio)和金魚(Carassius auratus)等多種硬骨魚類中被克隆[7—16], 魚類il-10基因結(jié)構(gòu)與哺乳動物相似,具有5個外顯子, 4個內(nèi)含子, 魚類跟哺乳類IL-10氨基酸序列同源性可高達80%—90%, 均含有由4個保守半胱氨酸形成的兩對二硫鍵, 另外, 魚類IL-10還額外存在兩個保守的半胱氨酸。生物信息學分析顯示, 魚類IL-10可能以非共價鍵連接形成同源二聚體與受體結(jié)合, 激活JAK/STAT信號通路, 調(diào)控靶基因表達[6,8,11—15]。與哺乳類相比, 魚類IL-10功能的研究較為有限。Pinto等[11]發(fā)現(xiàn)海鱸在腹腔注射紫外滅活的發(fā)光細菌(Photobacterium damselaessp.piscicida)后頭腎及脾臟il-10表達量顯著升高。Grayfer等[16]對IL-10的功能進行了較深入的分析, 發(fā)現(xiàn)金魚IL-10能夠抑制嗜水氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)誘導的tnf-α、il-1β、il-10等細胞因子表達, 此外, 金魚IL-10還能抑制IFN-γ誘導的超氧陰離子產(chǎn)生, 這與哺乳動物中IL-10抑制炎癥的功能類似, 表明魚類IL-10功能具有保守性。

迄今, 魚類IL-10的細胞來源尚不清楚。魚類具有tcr、cd3、cd4等T細胞標志基因[17—19]。與哺乳類不同, 魚類cd4基因有兩個拷貝, 即cd4-1和cd4-2。與CD4-2相比, CD4-1與哺乳動物CD4的親緣關(guān)系更近, CD4-1胞外區(qū)有4個Ig結(jié)構(gòu)域, 而CD4-2具有2個或3個Ig結(jié)構(gòu)域[20,21]。Toda等[19]證明硬骨魚類存在CD4+和CD8α+T細胞亞群, 其形態(tài)特征和組織分布與哺乳動物CD4+和CD8+T淋巴細胞相似,他們發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+雙陽性T細胞僅存在于胸腺中。Xing等[22,23]用牙鲆彈狀病毒(Hirme novirhabdovirus, HIRRV)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)外膜蛋白K對牙鲆(Paralichthys olivaceus)進行腹腔注射, 發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4-1+、CD4-2+、CD8β+T淋巴細胞和IgM+B淋巴細胞數(shù)量在注射組中均顯著升高。Piazzon等[24]發(fā)現(xiàn)鯉IL-10能夠促進T細胞增殖,可激活CD8+記憶T細胞, 抑制Th1和Th2免疫反應(yīng)。此外, IL-10還能促進IgM+B細胞的增殖、分化及抗體分泌, 抑制吞噬細胞的炎癥反應(yīng)。

目前, 雖然人們對魚類Th細胞有了初步了解,但是依然缺乏對魚類Th細胞亞群的深刻認知, 其主要原因是缺乏能夠用于檢測魚類Th細胞亞群細胞因子的單克隆抗體。草魚是我國大宗淡水魚類中產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖品種, 其產(chǎn)量超過全國淡水養(yǎng)殖總量的五分之一, 是優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖品種。本研究以草魚為研究對象, 成功制備了高純度的草魚IL-10重組蛋白, 并獲得了高特異性的單克隆抗體, 為草魚ILC2和Th2細胞的增殖、分化和功能研究奠定了基礎(chǔ),并為發(fā)展魚類疾病防控新措施提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取草魚IL-10序列(登錄號:JQ768312.1), 用于質(zhì)粒構(gòu)建?？寺≠|(zhì)粒pUC57-CiIL-10和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.4-CiIL-10由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建; pUC57-CiIL-10含草魚il-10成熟肽編碼區(qū)段(Lys23-His179); pcDNA3.4-CiIL-10包含編碼區(qū)全長, 且其C端附加5個組氨基酸編碼序列; 表達載體pET-21d、pcDNA3.4購于蘇州金唯智生物科技有限公司。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好表設(shè)計表達載體的正向引物(CiIL-10-F):CATGCCATGGCTAAGAAGGTTGATTGCAAG AGC, 反向引物(CiIL-10-F): CGGGATCCTTAGTG TTTTTCGCGTTTGCTCGCCAGATACTGCTCGA TGTACTTGAACAGCATGTCCAGCTCGCCCATT GC。正向引物下劃線為NcoI酶切位點, 反向引物下劃線為BamHΙ酶切位點。

以pUC57-CiIL-10為模板, 用高保真酶(Prime STAR Max, TaKaRa)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體積為50 μL: 1 μL pUC57-CiIL-10, 1 μLCiIL-10-F, 1 μLCiIL-10-R, 25 μL Prime STAR Max, 22 μL ddH2O。PCR擴增程序為: 98℃ 3min; 98℃ 10s、62℃ 15s、72℃10s, 38個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。利用Gel Extraction Kit(Omega)試劑盒純化回收擴增片段, 下同。用NcoI和BamH Ι限制性內(nèi)切酶將擴增片段及pET-21d載體在37℃下分別酶切過夜, 瓊脂糖凝膠電泳后進行回收; 將回收產(chǎn)物和載體在16℃連接4h后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞, 于37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2h, 取100 μL菌液均勻涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上, 37℃培養(yǎng)過夜后挑單克隆菌落作PCR篩選,將陽性克隆菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序驗證。

1.2 CiIL-10原核蛋白表達與純化

將pET-21d-CiIL-10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細胞, 取陽性單克隆菌落, 轉(zhuǎn)移至含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)2h, 取100 μL接種于含氨芐青霉素的6 mL LB液體培養(yǎng)基中; 當菌液OD600達到0.4—0.6時, 加入6 μL 1 mmol/L IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷, VWR),37℃、170 r/min培養(yǎng)8h。取1 mL菌液12000 r/min離心2min, 棄上清, 用40 μL PBS重懸菌體, 再加入10 μL蛋白上樣緩沖液(5×), 100℃加熱10min, 隨后12000 r/min離心2min, 取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

將單克隆菌落接種至50 mL LB培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)8h, 然后將菌液轉(zhuǎn)移至1 L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng), 在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600達到0.4—0.6,用1 mmol/L IPTG誘導8h, 收集細菌并提取包涵體。用6 mol/L鹽酸胍(VWR)對包涵體進行變性, 采用稀釋復性法復性蛋白, 用Superdex 200層析柱(GE Healthcare)純化蛋白, 具體方法參照Xue等[25]。SDSPAGE分析蛋白純度, 用Pierce?BCA Protein Assay Kit(Thermo)試劑盒測定蛋白濃度, 蛋白分裝后于–80℃冰箱保存。

1.3 單克隆抗體制備

用CiIL-10重組蛋白免疫4只BALB/c雌性小鼠(SPF級), 每只注射60 μg, 經(jīng)4次加強免疫(30 μg/只)后測定血清抗體效價。選用抗體效價高的小鼠, 用PEG法將其脾細胞與SP2/0細胞進行融合。通過ELISA法篩選雜交瘤陽性細胞株, 并鑒定其產(chǎn)生的抗體亞型, 單克隆抗體制備由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司完成。

1.4 單克隆抗體的Western Blot驗證分析

在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中, 用25 cm2細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)HEK293細胞, 當細胞匯合度達90%以上時, 用胰酶消化細胞, 加入12 mL DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素), 將細胞轉(zhuǎn)移至六孔細胞培養(yǎng)板(2 mL/孔), 培養(yǎng)12h。用jetOPTIMUS?DNA Transfection Reagent試劑轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒, 具體操作如下: 在EP管中加入 200 μL jetOPTIMUS?buffer、2 μg pcDNA3.4-CiIL-10或pcDNA3.4、2 μL jetOPTIMUS?Transfection Reagent, 混合均勻后室溫靜置10min, 加入至六孔板中, 輕輕混勻。轉(zhuǎn)染36h后, 加入5 μg蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(碧云天), 12h后加入200 μL RIPA裂解液(碧云天)(含1 mmol/mL PMSF, 蛋白酶抑制劑), 冰上裂解細胞10min, 然后進行Western Blotting分析, 步驟如下: SDS-PAGE電泳后, 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上, 用5%脫脂奶粉封閉1h, 用一抗在4℃下孵育4h, 棄一抗, 用含0.1% 吐溫20的TBS洗滌3×5min, 加入二抗, 4℃孵育1h。一抗為雜交瘤細胞上清(V﹕V=1﹕4, 抗體稀釋液為含5%脫脂奶粉的TBS, 下同), 二抗為IRDye 800CW?羊抗鼠IgG抗體(V﹕V=1﹕10000, LI-COR)。Western Blot具體方法參照Qin等[26]。

1.5 草魚IL-10單克隆抗體純化及標記

利用HiTrap rProtein A FF柱對草魚IL-10單克隆抗體進行親和層析提純, SDS-PAGE檢測抗體純度, 然后用E L I S A 測定抗體親和力(親和常數(shù)=150000 × A/抗體濃度, A代表最大OD值的1/2所對應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù), 在450和630 nm雙波長下測定OD值), 并用FITC(異硫氰酸熒光素)標記單克隆抗體, 抗體純化與標記均由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司完成。

1.6 激光共聚焦分析

將經(jīng)無菌處理的蓋玻片置于六孔板中, 加入2 mL HEK293細胞(1 × 107細胞/mL), 參照章節(jié)1.4進行轉(zhuǎn)染實驗; 48h后, 棄培養(yǎng)基, 用1 mL無菌PBS洗滌細胞3次, 加入700 μL 4%多聚甲醛固定細胞15min,PBS洗滌3次; 加入700 μL含5% BSA和0.5% Triton X-100的PBS(封閉液)封閉30min, 棄封閉液; 加入700 μL稀釋的FITC標記的單克隆抗體(V抗體﹕V封閉液=1﹕200), 4℃孵育2h, 棄一抗稀釋液; DAPI染色30min后用含0.25% Triton X-100的PBS洗滌3次, 經(jīng)抗熒光淬滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)下觀察、拍照。

1.7 流式細胞術(shù)分析

細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗參照1.4, 棄培養(yǎng)基, 用胰酶消化細胞, 加入1 mL DMEM培養(yǎng)基重懸細胞, 將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管, 250 ×g離心10min(下同),PBS洗滌細胞2次, 取2 × 106個細胞, 用Cytofix/Cytoperm Soln Kit試劑盒對細胞進行固定、破膜等處理, 步驟如下: 用Stain Buffer重懸細胞, 經(jīng)Fixation/Permeabilization Solution 4℃固定通透20min后, 離心,BD Perm/Wash Buffer重懸細胞2次, 加入經(jīng)500 μL BD Perm/Wash Buffer稀釋的FITC標記CiIL-10單克隆抗體(V﹕V=1﹕200), 對照為FITC標記的羊抗鼠IgG2b(V﹕V=1﹕200), 4℃避光孵育2h; 用BD Perm/Wash Buffer重懸細胞兩次, 離心, 加入200 μL Stain Buffer重懸細胞, 最后用BD AccuriTMC6 Plus流式細胞儀進行分析。

1.8 激光共聚焦分析LPS和IL-1β刺激草魚性腺細胞(GCO)

將GCO細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中, 置于28℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng), 當細胞匯合度達90%以上時, 用胰酶消化, 加入4 mL培養(yǎng)基將細胞吹打混勻, 取1 mL細胞懸液加入12 mL培養(yǎng)基, 稀釋混勻,將無菌蓋玻片置于6孔細胞培養(yǎng)板中, 每孔加入2 mL稀釋的細胞懸液, 置于28℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h。細胞貼壁后加入LPS(終濃度為75 μg/mL)或IL-1β(終濃度為250 ng/mL)[27], 對照組加入同體積的PBS, 32h后分別加入10 μg蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑, 繼續(xù)培養(yǎng)4h, 然后對細胞進行激光共聚焦分析, 細胞固定、破膜和染色等處理參照1.6進行。

2 結(jié)果

2.1 pET-21d-CiIL-10質(zhì)粒構(gòu)建、重組蛋白表達與純化

該研究以克隆載體為模板, 通過PCR擴增獲得了il-10成熟肽片段(474 bp, Lys23-His179), 將擴增il-10片段連接到pET-21d載體上, 獲得了草魚IL-10原核蛋白表達質(zhì)粒pET-21d-CiIL-10, 轉(zhuǎn)化pET-21d-CiIL-10質(zhì)粒的E.coliRosetta(DE3)菌經(jīng)IPTG誘導后高量表達IL-10蛋白, 隨后進行大規(guī)模細菌培養(yǎng)誘導表達CiIL-10蛋白, 細菌經(jīng)高壓破碎和離心后獲得上清和沉淀, SDS-PAGE分析表明, 重組蛋白以包涵體形式表達, 且表達量較高。包涵體經(jīng)變性、復性和凝膠過濾層析純化后獲得蛋白, SDS-PAGE顯示單一條帶, 表明蛋白純度高(圖1), 蛋白條帶位于15—25 kD, 大小與理論值(18.8 kD)一致。

圖1 CiIL-10重組蛋白的純化Fig.1 Purification of recombinant CiIL-10 protein

2.2 單克隆抗體制備和效價測定

采用ELISA方法測定小鼠血清的抗體效價(效價為大于最大OD值/2中的最小OD值所對應(yīng)的抗體稀釋度), 如圖2所示, 3號小鼠血清中的抗體在稀釋倍數(shù)6400時, 呈現(xiàn)較好的親和力, 且效價最高; 1號小鼠血清中的抗體效價稀釋倍數(shù)為3200, 效價最低,故選用3號小鼠進行細胞融合實驗。經(jīng)融合、篩選后, 得到4株分泌CiIL-10抗體的陽性雜交瘤細胞株,并將其進行Ig亞類鑒定, 結(jié)果顯示, GC4-IL10、GC10-IL10單抗為IgG1亞型, GC5-IL10、GC6-IL10單抗為IgG2b亞型(表1)。

表1 單克隆抗體亞型鑒定Tab.1 Characterization of subtypes of monoclonal antibodies

圖2 免疫小鼠血清中抗體效價的測定Fig.2 Determination of serum antibody titers in immunized mice

2.3 Western Blot分析

將pcDNA3.4-CiIL-10轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中,收取細胞裂解液, 進行Western Blot分析, 陽性對照為純化的原核重組蛋白。如圖3所示, 四株抗體均可與原核蛋白特異性結(jié)合。GC4-IL10和GC6-IL10單抗能夠特異性結(jié)合兩條真核表達的蛋白條帶, 其中位于20 kD位置的條帶與IL-10真核蛋白理論分子量(19.3 kD)吻合, 大小約為40 kD條帶與CiIL-10二聚體分子量大小一致, 表明CiIL-10能形成同源二聚體; GC5-IL10和GC10-IL10單抗則檢測不到HEK293中表達的IL-10蛋白; 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的蛋白樣品均未出現(xiàn)目的條帶, 表明GC4-IL10和GC6-IL10單抗能夠特異性識別HEK293細胞中表達的CiIL-10重組蛋白。

圖3 單克隆抗體的Western Blot驗證Fig.3 Western Blot validation of monoclonal antibodies

2.4 CiIL-10單克隆抗體純化

根據(jù)Western Blot結(jié)果選擇GC6-IL10單抗進行純化, SDS-PAGE結(jié)果顯示, 抗體純度高于90%, 重鏈(55 kD)和輕鏈(25 kD)清晰可見(圖4A), 其大小符合小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的理論值。ELISA法測定抗體的濃度和親和常數(shù), 分析結(jié)果顯示, 抗體濃度為3 mg/mL, GC6-IL10單抗與抗原結(jié)合的親和常數(shù)為6.40 × 108, 表明GC6-IL10單抗親和力較強(圖4B)。

圖4 抗體SDS-PAGE分析及抗體親和常數(shù)測定Fig.4 SDS-PAGE analysis of monoclonal antibody and determination of antibody affinity

2.5 激光共聚焦分析

將pcDNA3.4-CiIL-10真核表達質(zhì)粒及pcDNA3.4載體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中, 用FITC標記的GC6-IL10單抗檢測IL-10的蛋白表達; 如圖5所示, GC6-IL10單抗能檢測到轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-CiIL-10質(zhì)粒的HEK293細胞質(zhì)中的IL-10蛋白, 而對照組細胞中未觀察到熒光信號, 表明制備的GC6-IL10單抗可以特異性結(jié)合CiIL-10蛋白, 可用于激光共聚焦檢測CiIL-10產(chǎn)生細胞。

圖5 激光共聚焦分析Fig.5 Confocal analysis

2.6 流式細胞術(shù)分析

用FITC標記的GC6-IL10單抗及羊抗鼠IgG2b抗體(同型抗體陰性對照)孵育轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-CiIL-10和pcDNA3.4載體的HEK293細胞, 通過流式細胞術(shù)分析陽性細胞數(shù)量。如圖6所示, 通過同型抗體陰性對照進行屏蔽非特異性信號, GC6-IL10單抗能夠特異性識別表達IL-10的HEK293陽性細胞, 并具有良好的分群效果, 陽性率為20.6%。

圖6 GC6-IL10抗體的流式細胞術(shù)分析Fig.6 Flow cytometry analysis of GC6-IL10

2.7 激光共聚焦分析LPS和IL-1β刺激草魚GCO細胞的IL-10表達情況

LPS(75 μg/mL)和IL-1β(250 ng/mL)刺激GCO細胞36h后, 用FITC標記的單克隆抗體進行激光共聚焦分析。結(jié)果顯示, GC6-IL10單抗能夠特異性識別產(chǎn)生IL-10的草魚GCO細胞(圖7); 在PBS組、LPS及IL-1β刺激組中均發(fā)現(xiàn)IL-10陽性細胞,但IL-10陽性細胞的數(shù)量在對照組和處理組中無顯著差異。

圖7 LPS和IL-1β對GCO細胞產(chǎn)生IL-10的影響Fig.7 Effects of LPS and IL-1β on the production of IL-10 in GCO cells

3 討論

單克隆抗體制備對抗原純度要求高, 大腸桿菌原核表達系統(tǒng)因其表達量高、操作簡單、低成本、時效短成為制備重組蛋白最廣泛的表達系統(tǒng)之一。但表達的重組蛋白容易形成包涵體, 經(jīng)變性和復性獲得的蛋白會產(chǎn)生錯誤折疊, 不能形成正確的構(gòu)象[28], 而且大腸桿菌缺乏翻譯后修飾機制, 無法進行糖基化、磷酸化等修飾[29]。使用原核蛋白作為抗原制備的抗體有可能不識別具有翻譯后修飾的真核蛋白, 本實驗中獲得的四株抗體中有兩株能與原核重組IL-10結(jié)合, 但不識別HEK293表達的重組IL-10, 可能是由上述原因所致。

本研究制備了特異性較好的CiIL-10單克隆抗體, Western Blot分析顯示,CiIL-10單克隆抗體能夠識別兩條大小為20和40 kD的蛋白條帶, 其中40 kD大小的蛋白與同源二聚體大小吻合, 表明草魚IL-10以同源二聚體形式存在。哺乳類研究表明, IL-10以同源二聚體形式行駛功能, 與受體結(jié)合, 激活下游信號通路[30], 我們的研究提示草魚IL-10結(jié)合受體的方式可能跟哺乳類相似。

哺乳動物中IL-10可由B細胞、巨噬細胞、T細胞和上皮細胞等多種細胞產(chǎn)生[3,4,31]。Boonstra等[32]用TLR9(Toll樣受體9, Toll-like receptor 9)的配體CpG刺激小鼠巨噬細胞、髓樣樹突狀細胞、漿細胞樣樹突狀細胞, 發(fā)現(xiàn)巨噬細胞及髓樣樹突狀細胞皆能產(chǎn)生IL-10, 而漿細胞樣樹突狀細胞則不能; 同樣,poly(I:C)和LPS能誘導單核細胞、巨噬細胞和髓系樹突狀細胞產(chǎn)生IL-10[33,34]。CD4+效應(yīng)T細胞和1型調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cell, Treg)亦可合成IL-10, 以維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受[35,36]。迄今, 有關(guān)魚類IL-10的表達分析均局限于mRNA水平, 對IL-10細胞來源的研究幾乎為空白。本研究初步分析了草魚IL-10產(chǎn)生細胞, 發(fā)現(xiàn)LPS和IL-1β不影響GCO細胞IL-10產(chǎn)生細胞的數(shù)量。但是, 有研究表明LPS上調(diào)草魚頭腎原代細胞中IL-10的mRNA水平[37], 提示LPS和IL-1β誘導后單個細胞中合成的IL-10可能有所增多。此外, 本實驗結(jié)果表明我們制備的單克隆抗體可與草魚內(nèi)源IL-10結(jié)合, 可應(yīng)用于對IL-10產(chǎn)生細胞的分析及T細胞的相關(guān)研究。

細胞因子是鑒定T細胞亞群重要標志分子, T細胞亞群的研究在魚類中進展緩慢, 其主要原因是缺少相關(guān)細胞因子抗體。T細胞亞群可通過細胞特異受體, 結(jié)合細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子進行鑒定,如CD3、CD4、IL-10和FOXP3是調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞的標志分子; Th2細胞表達CD3和CD4受體, 分泌IL-4、IL-5和IL-10[38]。因此, IL-10對于Treg細胞和Th2細胞的鑒定和功能分析至關(guān)重要。研究表明,魚類存在Treg細胞和Th2細胞, 斑馬魚中研究發(fā)現(xiàn)表達il-4/13b的Th2樣細胞存在于鰓特化組織中[39,40];Maisey等[41]利用虹鱒CD3ε和CD4-1單克隆抗體證明了CD3ε+CD4-1+T細胞的存在, 而且表達il-10和tgf-β1。最近, Qin等[26]制備了草魚CD3γ/δ的抗體,分析了頭腎、脾臟和外周血中的CD3γ/δ+細胞數(shù)量。這些研究表明硬骨魚類具有與哺乳類動物相似的Th細胞亞群分布, 但是, 對魚類T細胞亞群的鑒定大多局限于基于表面標志受體抗體, 如CD3、CD4等, 因此, 結(jié)合CD4 T細胞表面特異受體抗體的應(yīng)用, 本研究制備的草魚IL-10單克隆抗體將有利于促進魚類T細胞亞群的鑒定和功能探究。

綜上, 本實驗制備了高純度的草魚IL-10重組蛋白, 獲得了特異性強的單克隆抗體, 可用于Western Blot、ELISA、激光共聚焦和流式細胞術(shù)等分析方法, 為研究草魚ILC2和Th2細胞的分化、增殖和功能奠定基礎(chǔ)。此外, 我們發(fā)現(xiàn)LPS和IL-1β對GCO細胞中產(chǎn)生IL-10的細胞數(shù)量沒有顯著影響。