劉 琴 賈 釗 陳康勇 朱曉真 王梓璇 陳 靜 王俊亞李耀國(guó) 肖調(diào)義 鄒 鈞

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心, 長(zhǎng)沙 410128)

白細(xì)胞介素(Interleukin, IL)10是IL-10家族成員之一, 最初被稱(chēng)為細(xì)胞因子合成抑制因子(Cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)[1], 主要由2型先天淋巴細(xì)胞(Type 2 innate lymphoid cell, ILC2)和輔助性2型T細(xì)胞(T helper 2 cell, Th2)分泌, 具有廣泛的免疫調(diào)控作用[2], 能夠抑制1型輔助性T細(xì)胞(T helper 1 cell, Th1)分泌干擾素γ(Interferon gamma,IFN-γ)。此外, IL-10也可由B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[3,4], IL-10的細(xì)胞來(lái)源很大程度取決于刺激物引發(fā)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和作用的部位[5]。

2003年, Zou等[6]首次在紅鰭東方鲀(Fugu rubripes)基因組中發(fā)現(xiàn)il-10基因。此后,il-10在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、斑馬魚(yú)(Danio rerio)、大西洋鮭(Salmo salar)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)、海鱸(Dicentrarchus labrax)、鯉(Cyprinus carpio)和金魚(yú)(Carassius auratus)等多種硬骨魚(yú)類(lèi)中被克隆[7—16], 魚(yú)類(lèi)il-10基因結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物相似,具有5個(gè)外顯子, 4個(gè)內(nèi)含子, 魚(yú)類(lèi)跟哺乳類(lèi)IL-10氨基酸序列同源性可高達(dá)80%—90%, 均含有由4個(gè)保守半胱氨酸形成的兩對(duì)二硫鍵, 另外, 魚(yú)類(lèi)IL-10還額外存在兩個(gè)保守的半胱氨酸。生物信息學(xué)分析顯示, 魚(yú)類(lèi)IL-10可能以非共價(jià)鍵連接形成同源二聚體與受體結(jié)合, 激活JAK/STAT信號(hào)通路, 調(diào)控靶基因表達(dá)[6,8,11—15]。與哺乳類(lèi)相比, 魚(yú)類(lèi)IL-10功能的研究較為有限。Pinto等[11]發(fā)現(xiàn)海鱸在腹腔注射紫外滅活的發(fā)光細(xì)菌(Photobacterium damselaessp.piscicida)后頭腎及脾臟il-10表達(dá)量顯著升高。Grayfer等[16]對(duì)IL-10的功能進(jìn)行了較深入的分析, 發(fā)現(xiàn)金魚(yú)IL-10能夠抑制嗜水氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)誘導(dǎo)的tnf-α、il-1β、il-10等細(xì)胞因子表達(dá), 此外, 金魚(yú)IL-10還能抑制IFN-γ誘導(dǎo)的超氧陰離子產(chǎn)生, 這與哺乳動(dòng)物中IL-10抑制炎癥的功能類(lèi)似, 表明魚(yú)類(lèi)IL-10功能具有保守性。

迄今, 魚(yú)類(lèi)IL-10的細(xì)胞來(lái)源尚不清楚。魚(yú)類(lèi)具有tcr、cd3、cd4等T細(xì)胞標(biāo)志基因[17—19]。與哺乳類(lèi)不同, 魚(yú)類(lèi)cd4基因有兩個(gè)拷貝, 即cd4-1和cd4-2。與CD4-2相比, CD4-1與哺乳動(dòng)物CD4的親緣關(guān)系更近, CD4-1胞外區(qū)有4個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域, 而CD4-2具有2個(gè)或3個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域[20,21]。Toda等[19]證明硬骨魚(yú)類(lèi)存在CD4+和CD8α+T細(xì)胞亞群, 其形態(tài)特征和組織分布與哺乳動(dòng)物CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞相似,他們發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+雙陽(yáng)性T細(xì)胞僅存在于胸腺中。Xing等[22,23]用牙鲆彈狀病毒(Hirme novirhabdovirus, HIRRV)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)外膜蛋白K對(duì)牙鲆(Paralichthys olivaceus)進(jìn)行腹腔注射, 發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4-1+、CD4-2+、CD8β+T淋巴細(xì)胞和IgM+B淋巴細(xì)胞數(shù)量在注射組中均顯著升高。Piazzon等[24]發(fā)現(xiàn)鯉IL-10能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖,可激活CD8+記憶T細(xì)胞, 抑制Th1和Th2免疫反應(yīng)。此外, IL-10還能促進(jìn)IgM+B細(xì)胞的增殖、分化及抗體分泌, 抑制吞噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

目前, 雖然人們對(duì)魚(yú)類(lèi)Th細(xì)胞有了初步了解,但是依然缺乏對(duì)魚(yú)類(lèi)Th細(xì)胞亞群的深刻認(rèn)知, 其主要原因是缺乏能夠用于檢測(cè)魚(yú)類(lèi)Th細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的單克隆抗體。草魚(yú)是我國(guó)大宗淡水魚(yú)類(lèi)中產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖品種, 其產(chǎn)量超過(guò)全國(guó)淡水養(yǎng)殖總量的五分之一, 是優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖品種。本研究以草魚(yú)為研究對(duì)象, 成功制備了高純度的草魚(yú)IL-10重組蛋白, 并獲得了高特異性的單克隆抗體, 為草魚(yú)ILC2和Th2細(xì)胞的增殖、分化和功能研究奠定了基礎(chǔ),并為發(fā)展魚(yú)類(lèi)疾病防控新措施提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取草魚(yú)IL-10序列(登錄號(hào):JQ768312.1), 用于質(zhì)粒構(gòu)建?？寺≠|(zhì)粒pUC57-CiIL-10和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.4-CiIL-10由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建; pUC57-CiIL-10含草魚(yú)il-10成熟肽編碼區(qū)段(Lys23-His179); pcDNA3.4-CiIL-10包含編碼區(qū)全長(zhǎng), 且其C端附加5個(gè)組氨基酸編碼序列; 表達(dá)載體pET-21d、pcDNA3.4購(gòu)于蘇州金唯智生物科技有限公司。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好表設(shè)計(jì)表達(dá)載體的正向引物(CiIL-10-F):CATGCCATGGCTAAGAAGGTTGATTGCAAG AGC, 反向引物(CiIL-10-F): CGGGATCCTTAGTG TTTTTCGCGTTTGCTCGCCAGATACTGCTCGA TGTACTTGAACAGCATGTCCAGCTCGCCCATT GC。正向引物下劃線為NcoI酶切位點(diǎn), 反向引物下劃線為BamHΙ酶切位點(diǎn)。

以pUC57-CiIL-10為模板, 用高保真酶(Prime STAR Max, TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體積為50 μL: 1 μL pUC57-CiIL-10, 1 μLCiIL-10-F, 1 μLCiIL-10-R, 25 μL Prime STAR Max, 22 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 98℃ 3min; 98℃ 10s、62℃ 15s、72℃10s, 38個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。利用Gel Extraction Kit(Omega)試劑盒純化回收擴(kuò)增片段, 下同。用NcoI和BamH Ι限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增片段及pET-21d載體在37℃下分別酶切過(guò)夜, 瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行回收; 將回收產(chǎn)物和載體在16℃連接4h后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞, 于37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2h, 取100 μL菌液均勻涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上, 37℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑單克隆菌落作PCR篩選,將陽(yáng)性克隆菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2 CiIL-10原核蛋白表達(dá)與純化

將pET-21d-CiIL-10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 取陽(yáng)性單克隆菌落, 轉(zhuǎn)移至含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)2h, 取100 μL接種于含氨芐青霉素的6 mL LB液體培養(yǎng)基中; 當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.4—0.6時(shí), 加入6 μL 1 mmol/L IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷, VWR),37℃、170 r/min培養(yǎng)8h。取1 mL菌液12000 r/min離心2min, 棄上清, 用40 μL PBS重懸菌體, 再加入10 μL蛋白上樣緩沖液(5×), 100℃加熱10min, 隨后12000 r/min離心2min, 取上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

將單克隆菌落接種至50 mL LB培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)8h, 然后將菌液轉(zhuǎn)移至1 L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng), 在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4—0.6,用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8h, 收集細(xì)菌并提取包涵體。用6 mol/L鹽酸胍(VWR)對(duì)包涵體進(jìn)行變性, 采用稀釋復(fù)性法復(fù)性蛋白, 用Superdex 200層析柱(GE Healthcare)純化蛋白, 具體方法參照Xue等[25]。SDSPAGE分析蛋白純度, 用Pierce?BCA Protein Assay Kit(Thermo)試劑盒測(cè)定蛋白濃度, 蛋白分裝后于–80℃冰箱保存。

1.3 單克隆抗體制備

用CiIL-10重組蛋白免疫4只BALB/c雌性小鼠(SPF級(jí)), 每只注射60 μg, 經(jīng)4次加強(qiáng)免疫(30 μg/只)后測(cè)定血清抗體效價(jià)。選用抗體效價(jià)高的小鼠, 用PEG法將其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。通過(guò)ELISA法篩選雜交瘤陽(yáng)性細(xì)胞株, 并鑒定其產(chǎn)生的抗體亞型, 單克隆抗體制備由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司完成。

1.4 單克隆抗體的Western Blot驗(yàn)證分析

在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中, 用25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)HEK293細(xì)胞, 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時(shí), 用胰酶消化細(xì)胞, 加入12 mL DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素), 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板(2 mL/孔), 培養(yǎng)12h。用jetOPTIMUS?DNA Transfection Reagent試劑轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒, 具體操作如下: 在EP管中加入 200 μL jetOPTIMUS?buffer、2 μg pcDNA3.4-CiIL-10或pcDNA3.4、2 μL jetOPTIMUS?Transfection Reagent, 混合均勻后室溫靜置10min, 加入至六孔板中, 輕輕混勻。轉(zhuǎn)染36h后, 加入5 μg蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(碧云天), 12h后加入200 μL RIPA裂解液(碧云天)(含1 mmol/mL PMSF, 蛋白酶抑制劑), 冰上裂解細(xì)胞10min, 然后進(jìn)行Western Blotting分析, 步驟如下: SDS-PAGE電泳后, 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上, 用5%脫脂奶粉封閉1h, 用一抗在4℃下孵育4h, 棄一抗, 用含0.1% 吐溫20的TBS洗滌3×5min, 加入二抗, 4℃孵育1h。一抗為雜交瘤細(xì)胞上清(V﹕V=1﹕4, 抗體稀釋液為含5%脫脂奶粉的TBS, 下同), 二抗為IRDye 800CW?羊抗鼠IgG抗體(V﹕V=1﹕10000, LI-COR)。Western Blot具體方法參照Qin等[26]。

1.5 草魚(yú)IL-10單克隆抗體純化及標(biāo)記

利用HiTrap rProtein A FF柱對(duì)草魚(yú)IL-10單克隆抗體進(jìn)行親和層析提純, SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度, 然后用E L I S A 測(cè)定抗體親和力(親和常數(shù)=150000 × A/抗體濃度, A代表最大OD值的1/2所對(duì)應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù), 在450和630 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定OD值), 并用FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記單克隆抗體, 抗體純化與標(biāo)記均由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司完成。

1.6 激光共聚焦分析

將經(jīng)無(wú)菌處理的蓋玻片置于六孔板中, 加入2 mL HEK293細(xì)胞(1 × 107細(xì)胞/mL), 參照章節(jié)1.4進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn); 48h后, 棄培養(yǎng)基, 用1 mL無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞3次, 加入700 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min,PBS洗滌3次; 加入700 μL含5% BSA和0.5% Triton X-100的PBS(封閉液)封閉30min, 棄封閉液; 加入700 μL稀釋的FITC標(biāo)記的單克隆抗體(V抗體﹕V封閉液=1﹕200), 4℃孵育2h, 棄一抗稀釋液; DAPI染色30min后用含0.25% Triton X-100的PBS洗滌3次, 經(jīng)抗熒光淬滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)下觀察、拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)分析

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)參照1.4, 棄培養(yǎng)基, 用胰酶消化細(xì)胞, 加入1 mL DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管, 250 ×g離心10min(下同),PBS洗滌細(xì)胞2次, 取2 × 106個(gè)細(xì)胞, 用Cytofix/Cytoperm Soln Kit試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜等處理, 步驟如下: 用Stain Buffer重懸細(xì)胞, 經(jīng)Fixation/Permeabilization Solution 4℃固定通透20min后, 離心,BD Perm/Wash Buffer重懸細(xì)胞2次, 加入經(jīng)500 μL BD Perm/Wash Buffer稀釋的FITC標(biāo)記CiIL-10單克隆抗體(V﹕V=1﹕200), 對(duì)照為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG2b(V﹕V=1﹕200), 4℃避光孵育2h; 用BD Perm/Wash Buffer重懸細(xì)胞兩次, 離心, 加入200 μL Stain Buffer重懸細(xì)胞, 最后用BD AccuriTMC6 Plus流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.8 激光共聚焦分析LPS和IL-1β刺激草魚(yú)性腺細(xì)胞(GCO)

將GCO細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中, 置于28℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng), 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時(shí), 用胰酶消化, 加入4 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打混勻, 取1 mL細(xì)胞懸液加入12 mL培養(yǎng)基, 稀釋混勻,將無(wú)菌蓋玻片置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 每孔加入2 mL稀釋的細(xì)胞懸液, 置于28℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h。細(xì)胞貼壁后加入LPS(終濃度為75 μg/mL)或IL-1β(終濃度為250 ng/mL)[27], 對(duì)照組加入同體積的PBS, 32h后分別加入10 μg蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑, 繼續(xù)培養(yǎng)4h, 然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦分析, 細(xì)胞固定、破膜和染色等處理參照1.6進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 pET-21d-CiIL-10質(zhì)粒構(gòu)建、重組蛋白表達(dá)與純化

該研究以克隆載體為模板, 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了il-10成熟肽片段(474 bp, Lys23-His179), 將擴(kuò)增il-10片段連接到pET-21d載體上, 獲得了草魚(yú)IL-10原核蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-21d-CiIL-10, 轉(zhuǎn)化pET-21d-CiIL-10質(zhì)粒的E.coliRosetta(DE3)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高量表達(dá)IL-10蛋白, 隨后進(jìn)行大規(guī)模細(xì)菌培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)CiIL-10蛋白, 細(xì)菌經(jīng)高壓破碎和離心后獲得上清和沉淀, SDS-PAGE分析表明, 重組蛋白以包涵體形式表達(dá), 且表達(dá)量較高。包涵體經(jīng)變性、復(fù)性和凝膠過(guò)濾層析純化后獲得蛋白, SDS-PAGE顯示單一條帶, 表明蛋白純度高(圖1), 蛋白條帶位于15—25 kD, 大小與理論值(18.8 kD)一致。

圖1 CiIL-10重組蛋白的純化Fig.1 Purification of recombinant CiIL-10 protein

2.2 單克隆抗體制備和效價(jià)測(cè)定

采用ELISA方法測(cè)定小鼠血清的抗體效價(jià)(效價(jià)為大于最大OD值/2中的最小OD值所對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度), 如圖2所示, 3號(hào)小鼠血清中的抗體在稀釋倍數(shù)6400時(shí), 呈現(xiàn)較好的親和力, 且效價(jià)最高; 1號(hào)小鼠血清中的抗體效價(jià)稀釋倍數(shù)為3200, 效價(jià)最低,故選用3號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。經(jīng)融合、篩選后, 得到4株分泌CiIL-10抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,并將其進(jìn)行Ig亞類(lèi)鑒定, 結(jié)果顯示, GC4-IL10、GC10-IL10單抗為IgG1亞型, GC5-IL10、GC6-IL10單抗為IgG2b亞型(表1)。

表1 單克隆抗體亞型鑒定Tab.1 Characterization of subtypes of monoclonal antibodies

圖2 免疫小鼠血清中抗體效價(jià)的測(cè)定Fig.2 Determination of serum antibody titers in immunized mice

2.3 Western Blot分析

將pcDNA3.4-CiIL-10轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,收取細(xì)胞裂解液, 進(jìn)行Western Blot分析, 陽(yáng)性對(duì)照為純化的原核重組蛋白。如圖3所示, 四株抗體均可與原核蛋白特異性結(jié)合。GC4-IL10和GC6-IL10單抗能夠特異性結(jié)合兩條真核表達(dá)的蛋白條帶, 其中位于20 kD位置的條帶與IL-10真核蛋白理論分子量(19.3 kD)吻合, 大小約為40 kD條帶與CiIL-10二聚體分子量大小一致, 表明CiIL-10能形成同源二聚體; GC5-IL10和GC10-IL10單抗則檢測(cè)不到HEK293中表達(dá)的IL-10蛋白; 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的蛋白樣品均未出現(xiàn)目的條帶, 表明GC4-IL10和GC6-IL10單抗能夠特異性識(shí)別HEK293細(xì)胞中表達(dá)的CiIL-10重組蛋白。

圖3 單克隆抗體的Western Blot驗(yàn)證Fig.3 Western Blot validation of monoclonal antibodies

2.4 CiIL-10單克隆抗體純化

根據(jù)Western Blot結(jié)果選擇GC6-IL10單抗進(jìn)行純化, SDS-PAGE結(jié)果顯示, 抗體純度高于90%, 重鏈(55 kD)和輕鏈(25 kD)清晰可見(jiàn)(圖4A), 其大小符合小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的理論值。ELISA法測(cè)定抗體的濃度和親和常數(shù), 分析結(jié)果顯示, 抗體濃度為3 mg/mL, GC6-IL10單抗與抗原結(jié)合的親和常數(shù)為6.40 × 108, 表明GC6-IL10單抗親和力較強(qiáng)(圖4B)。

圖4 抗體SDS-PAGE分析及抗體親和常數(shù)測(cè)定Fig.4 SDS-PAGE analysis of monoclonal antibody and determination of antibody affinity

2.5 激光共聚焦分析

將pcDNA3.4-CiIL-10真核表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.4載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中, 用FITC標(biāo)記的GC6-IL10單抗檢測(cè)IL-10的蛋白表達(dá); 如圖5所示, GC6-IL10單抗能檢測(cè)到轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-CiIL-10質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞質(zhì)中的IL-10蛋白, 而對(duì)照組細(xì)胞中未觀察到熒光信號(hào), 表明制備的GC6-IL10單抗可以特異性結(jié)合CiIL-10蛋白, 可用于激光共聚焦檢測(cè)CiIL-10產(chǎn)生細(xì)胞。

圖5 激光共聚焦分析Fig.5 Confocal analysis

2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析

用FITC標(biāo)記的GC6-IL10單抗及羊抗鼠IgG2b抗體(同型抗體陰性對(duì)照)孵育轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-CiIL-10和pcDNA3.4載體的HEK293細(xì)胞, 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。如圖6所示, 通過(guò)同型抗體陰性對(duì)照進(jìn)行屏蔽非特異性信號(hào), GC6-IL10單抗能夠特異性識(shí)別表達(dá)IL-10的HEK293陽(yáng)性細(xì)胞, 并具有良好的分群效果, 陽(yáng)性率為20.6%。

圖6 GC6-IL10抗體的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig.6 Flow cytometry analysis of GC6-IL10

2.7 激光共聚焦分析LPS和IL-1β刺激草魚(yú)GCO細(xì)胞的IL-10表達(dá)情況

LPS(75 μg/mL)和IL-1β(250 ng/mL)刺激GCO細(xì)胞36h后, 用FITC標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行激光共聚焦分析。結(jié)果顯示, GC6-IL10單抗能夠特異性識(shí)別產(chǎn)生IL-10的草魚(yú)GCO細(xì)胞(圖7); 在PBS組、LPS及IL-1β刺激組中均發(fā)現(xiàn)IL-10陽(yáng)性細(xì)胞,但I(xiàn)L-10陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量在對(duì)照組和處理組中無(wú)顯著差異。

圖7 LPS和IL-1β對(duì)GCO細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的影響Fig.7 Effects of LPS and IL-1β on the production of IL-10 in GCO cells

3 討論

單克隆抗體制備對(duì)抗原純度要求高, 大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)量高、操作簡(jiǎn)單、低成本、時(shí)效短成為制備重組蛋白最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一。但表達(dá)的重組蛋白容易形成包涵體, 經(jīng)變性和復(fù)性獲得的蛋白會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊, 不能形成正確的構(gòu)象[28], 而且大腸桿菌缺乏翻譯后修飾機(jī)制, 無(wú)法進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾[29]。使用原核蛋白作為抗原制備的抗體有可能不識(shí)別具有翻譯后修飾的真核蛋白, 本實(shí)驗(yàn)中獲得的四株抗體中有兩株能與原核重組IL-10結(jié)合, 但不識(shí)別HEK293表達(dá)的重組IL-10, 可能是由上述原因所致。

本研究制備了特異性較好的CiIL-10單克隆抗體, Western Blot分析顯示,CiIL-10單克隆抗體能夠識(shí)別兩條大小為20和40 kD的蛋白條帶, 其中40 kD大小的蛋白與同源二聚體大小吻合, 表明草魚(yú)IL-10以同源二聚體形式存在。哺乳類(lèi)研究表明, IL-10以同源二聚體形式行駛功能, 與受體結(jié)合, 激活下游信號(hào)通路[30], 我們的研究提示草魚(yú)IL-10結(jié)合受體的方式可能跟哺乳類(lèi)相似。

哺乳動(dòng)物中IL-10可由B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[3,4,31]。Boonstra等[32]用TLR9(Toll樣受體9, Toll-like receptor 9)的配體CpG刺激小鼠巨噬細(xì)胞、髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞及髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞皆能產(chǎn)生IL-10, 而漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞則不能; 同樣,poly(I:C)和LPS能誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓系樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-10[33,34]。CD4+效應(yīng)T細(xì)胞和1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell, Treg)亦可合成IL-10, 以維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受[35,36]。迄今, 有關(guān)魚(yú)類(lèi)IL-10的表達(dá)分析均局限于mRNA水平, 對(duì)IL-10細(xì)胞來(lái)源的研究幾乎為空白。本研究初步分析了草魚(yú)IL-10產(chǎn)生細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)LPS和IL-1β不影響GCO細(xì)胞IL-10產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。但是, 有研究表明LPS上調(diào)草魚(yú)頭腎原代細(xì)胞中IL-10的mRNA水平[37], 提示LPS和IL-1β誘導(dǎo)后單個(gè)細(xì)胞中合成的IL-10可能有所增多。此外, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們制備的單克隆抗體可與草魚(yú)內(nèi)源IL-10結(jié)合, 可應(yīng)用于對(duì)IL-10產(chǎn)生細(xì)胞的分析及T細(xì)胞的相關(guān)研究。

細(xì)胞因子是鑒定T細(xì)胞亞群重要標(biāo)志分子, T細(xì)胞亞群的研究在魚(yú)類(lèi)中進(jìn)展緩慢, 其主要原因是缺少相關(guān)細(xì)胞因子抗體。T細(xì)胞亞群可通過(guò)細(xì)胞特異受體, 結(jié)合細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子進(jìn)行鑒定,如CD3、CD4、IL-10和FOXP3是調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的標(biāo)志分子; Th2細(xì)胞表達(dá)CD3和CD4受體, 分泌IL-4、IL-5和IL-10[38]。因此, IL-10對(duì)于Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞的鑒定和功能分析至關(guān)重要。研究表明,魚(yú)類(lèi)存在Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞, 斑馬魚(yú)中研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)il-4/13b的Th2樣細(xì)胞存在于鰓特化組織中[39,40];Maisey等[41]利用虹鱒CD3ε和CD4-1單克隆抗體證明了CD3ε+CD4-1+T細(xì)胞的存在, 而且表達(dá)il-10和tgf-β1。最近, Qin等[26]制備了草魚(yú)CD3γ/δ的抗體,分析了頭腎、脾臟和外周血中的CD3γ/δ+細(xì)胞數(shù)量。這些研究表明硬骨魚(yú)類(lèi)具有與哺乳類(lèi)動(dòng)物相似的Th細(xì)胞亞群分布, 但是, 對(duì)魚(yú)類(lèi)T細(xì)胞亞群的鑒定大多局限于基于表面標(biāo)志受體抗體, 如CD3、CD4等, 因此, 結(jié)合CD4 T細(xì)胞表面特異受體抗體的應(yīng)用, 本研究制備的草魚(yú)IL-10單克隆抗體將有利于促進(jìn)魚(yú)類(lèi)T細(xì)胞亞群的鑒定和功能探究。

綜上, 本實(shí)驗(yàn)制備了高純度的草魚(yú)IL-10重組蛋白, 獲得了特異性強(qiáng)的單克隆抗體, 可用于Western Blot、ELISA、激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)等分析方法, 為研究草魚(yú)ILC2和Th2細(xì)胞的分化、增殖和功能奠定基礎(chǔ)。此外, 我們發(fā)現(xiàn)LPS和IL-1β對(duì)GCO細(xì)胞中產(chǎn)生IL-10的細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著影響。