況 睿 周建成 劉小玲 蘇建國(guó) 袁改玲

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2.武漢大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司, 武漢 430090)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖中最主要的養(yǎng)殖品種之一, 2021年中國(guó)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 2020年我國(guó)草魚產(chǎn)量高達(dá)557.1083萬(wàn)噸。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展, 水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害問(wèn)題日漸突出。當(dāng)前用于治療魚類細(xì)菌性疾病的主要是抗生素類化學(xué)藥物, 但抗生素污染問(wèn)題已經(jīng)成為目前影響我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重大科技問(wèn)題。尋找能夠替代抗生素的環(huán)保型飼料添加劑, 研制出無(wú)抗生素的環(huán)境友好型飼料, 是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的迫切需求[1,2]。

抗菌肽廣泛存在于各種生物體中, 是機(jī)體先天性免疫的重要組成部分[3]。抗菌肽對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒等多種病原具有生物活性且不易產(chǎn)生耐藥性[3,4],同時(shí)還具有非常好的免疫調(diào)節(jié)活性, 被認(rèn)為是開發(fā)抗菌藥物的新方向。Ganz等[5]將在人和兔白細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)相似的抗菌肽命名為“防御素”, 之后研究發(fā)現(xiàn)防御素幾乎廣泛分布在所有的生物體中, 根據(jù)防御素六個(gè)保守的半胱氨酸的位置及形成二硫鍵的連接方式不同可將動(dòng)物防御素分為α、β和θ三種[6], β-防御素在所有脊椎動(dòng)物中廣泛分布, α-防御素僅存在于哺乳動(dòng)物中, θ-防御素僅在恒河猴和狒狒中被發(fā)現(xiàn)[7]。α-和θ-防御素被認(rèn)為是從古老的β-防御素進(jìn)化而來(lái)[8]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), β-防御素除了具有強(qiáng)大的直接抗病原微生物活性以外, 還可以在天然免疫中發(fā)揮趨化等調(diào)節(jié)作用[9], 而巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞定向遷移到病原入侵部位對(duì)宿主防御和誘發(fā)免疫反應(yīng)至關(guān)重要[10]。了解防御素對(duì)魚類白細(xì)胞的趨化作用及其免疫佐劑效應(yīng)可以為魚類防治微生物感染及疫苗提供新的策略, 為魚類β-防御素在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)草魚和細(xì)菌

實(shí)驗(yàn)草魚[(1000±100)g 和(30±5)g]購(gòu)自湖北省仙桃市排湖風(fēng)景區(qū)漁場(chǎng), 在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周。水溫控制在(26±2)℃, 每日投喂魚體重量2%的商品化飼料(武漢大北農(nóng)集團(tuán))。實(shí)驗(yàn)魚通過(guò)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理審核(倫理號(hào): HZAUFI-2021-0018), 一切操作均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。金黃色葡萄球菌(S.aureus, ATCC 25923)、無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae, ATCC 13813)、大腸桿菌(E.coli,ATCC 25922)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila, ATCC 7966)分別從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)(American Type Culture Collection, ATCC)中獲得, 由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大后自主保管。

1.2 生物信息學(xué)分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載得到人類(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、原雞(Gallus gallus)和包含草魚在內(nèi)的多種魚類β-防御素的氨基酸序列。將包含所有序列信息的文檔上傳到Clustal Οmega在線程序(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)完成各物種β-防御素的多序列比對(duì), 并通過(guò)MEGA7軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

利用在線網(wǎng)站https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0預(yù)測(cè)CiBD1成熟肽, 將成熟肽序列通過(guò)在線同源建模系統(tǒng)SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)CiBD1三級(jí)結(jié)構(gòu)。之后將其三級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMOL軟件(PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3, 2011)中進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)成像, 進(jìn)行可視化分析。最后, 利用軟件直觀展現(xiàn)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu), 分析CiBD1的α螺旋與β折疊結(jié)構(gòu)和CiBD1的表面凈電荷分布。

1.3 引物合成

根據(jù)CiBD1(GenBank登錄號(hào): KX906958.1)基因核苷酸序列, 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物, 在引物上游引入KpnⅠ限制性內(nèi)切酶和腸激酶(Enterokinase, EK)酶切位點(diǎn), 在引物下游引入XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中用于擴(kuò)增CiBD1基因及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)使用的引物序列見表1, 由武漢擎科生物工程有限公司合成。

1.4 A.hydrophila感染前后草魚各組織中CiBD1的轉(zhuǎn)錄分析

隨機(jī)取5尾健康草魚[(30±5)g]用MS222麻醉,先進(jìn)行尾靜脈放血然后解剖取各組織(脾臟、皮膚、鰾、肝胰腺、鰓、后腸、腦、眼、頭腎和體腎)混樣后用TRIzol試劑盒(中國(guó)北京, Aidlab)提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度并根據(jù)260和280 nm下的吸光度比值判斷RNA質(zhì)量,A260/A280值在1.8—2.0為佳。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR with gDNA wiper(中國(guó)南京,Vazyme)試劑盒按說(shuō)明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)為: AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix (中國(guó)南京, Vazyme)10 μL, 上下游引物(表1)各0.4 μL, cDNA 1.0 μL, ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性3min; 95℃變性10s; 60℃退火30s; 72℃延伸20s; 重復(fù)40個(gè)循環(huán)。溶解曲線:95℃ 15s, 60℃ 1min , 95℃ 15s。以草魚β-actin作為內(nèi)參基因, 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。使用2–??Ct方法計(jì)算各組織CiBD1相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平, 將感染前脾臟轉(zhuǎn)錄水平設(shè)為1, 其余組織是此基準(zhǔn)的相對(duì)值。

表1 本研究所用到的引物Tab.1 Primers used in this study

取5×107CFU/mL嗜水氣單胞菌懸液以200 μL/尾注射20尾草魚, 72h后進(jìn)行取樣。之后操作步驟同感染前草魚樣品的處理一致。

1.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建與CiBD1重組蛋白的獲得

根據(jù)預(yù)測(cè)得到的成熟肽對(duì)應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物, 原核表達(dá)載體選擇pET-32a。以草魚后腸cDNA為模板, 采用PCR擴(kuò)增目的片段, 用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。使用Gel Extraction kit 試劑盒(中國(guó)杭州, Axygen), 參照說(shuō)明書純化回收CiBD1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ(中國(guó)北京, TaKaRa)和XhoⅠ(中國(guó)北京, TaKaRa)對(duì)CiBD1的PCR擴(kuò)增片段和pET-32a載體進(jìn)行雙酶切, 37℃水浴酶切30min, 將酶切產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接。采用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆篩選, 以單個(gè)克隆的菌液為模版,用CiBD1擴(kuò)增引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 選擇 PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性的菌落送武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。確認(rèn)無(wú)誤后擴(kuò)大培養(yǎng)菌液并提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21(DE3)pLysS中進(jìn)行重組表達(dá), 轉(zhuǎn)化和鑒定方法同上。經(jīng)確認(rèn)的重組載體命名為pET-32a-CiBD1。

表達(dá)菌株的最適誘導(dǎo)條件: 1.0 mmol/L IPTG,37℃, 5h。誘導(dǎo)結(jié)束后5000 r/min離心10min收集菌體, 使用平衡緩沖液(10 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 20 mmol/L 咪唑, pH=7.2)重懸菌體, 使用高壓破碎儀(中國(guó)上海, 勵(lì)途, FB-110X)在850 Pa下破碎5min, 然后12000 r/min離心60min, 分別收集上清和沉淀。添加 5×SDS-PAGE上樣緩沖液后, 在沸水中變性10min后于–20℃保存樣品。用SDS-PAGE凝膠試劑盒(中國(guó)北京, Solarbio)配制12% SDSPAGE凝膠。取上清和包涵體樣品進(jìn)行點(diǎn)樣檢測(cè),凝膠電泳條件為 80 V 2h。在電泳完成后, 分離SDS-PAGE凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色1h, 用水沖洗凝膠后, 于沸水中脫色20min后拍照檢測(cè)。確定CiBD1表達(dá)于上清后, 采用Ni-NTA柱進(jìn)行蛋白純化, 使用腸激酶去除標(biāo)簽蛋白, 收集酶切產(chǎn)物。用Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠試劑盒(中國(guó)北京, Solarbio)配制15%凝膠進(jìn)行酶切產(chǎn)物檢測(cè)。使用His標(biāo)簽抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)。

1.6 CiBD1重組蛋白的體外抑菌活性檢測(cè)

本研究中檢測(cè)CiBD1重組蛋白抗菌活性的方法為 CFU平板法。將凍存的金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、無(wú)乳鏈球菌(ATCC 13813)、大腸桿菌(ATCC 25922)和嗜水氣單胞菌(ATCC 7966)接種到LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇。將復(fù)蘇的菌液以1﹕100比例重新接種到新LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。使用平衡緩沖液稀釋細(xì)菌到1×106CFU/mL, 吸取50 μL菌液與含CiBD1蛋白100 μg/200 μg的蛋白溶液150 μL混合后在細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度(金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌為37℃, 嗜水氣單胞菌為28℃)水浴1h, 吸取50 μL 涂布在無(wú)抗LB固體平板上, 培養(yǎng)16h后拍照計(jì)數(shù), 以Tris-HCl緩沖液為陰性對(duì)照。

1.7 CiBD1重組蛋白的趨化活性分析

用Percoll梯度離心法分離草魚[(1000±100)g]頭腎白細(xì)胞[11]。清洗兩遍后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106CFU/mL。在遷移小室(Corning, 規(guī)格3 μm)中進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn), 將500 μL含有5% FBS(Fetal Calf Serum, 胎牛血清)和不同濃度CiBD1蛋白(0、12.5、25、50、100和200 ng/mL)的DMEM培養(yǎng)液(美國(guó), Life Technologies)引入外室, 在內(nèi)室中引入300 μL白細(xì)胞懸液。28℃趨化2h后收集外室的細(xì)胞懸液, 采用流式細(xì)胞儀(美國(guó), BD Biosciences)進(jìn)行計(jì)數(shù), 并基于SSC(前向角散射)和FSC(側(cè)向角散射)參數(shù)分析遷移細(xì)胞的種類。

1.8 滅活疫苗制備與個(gè)體感染實(shí)驗(yàn)

采用福爾馬林滅活法制備嗜水氣單胞菌滅活疫苗, 首先將嗜水氣單胞菌復(fù)壯培養(yǎng)24h后加入福爾馬林溶液(分析純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),使終濃度為0.2%, 37℃滅活24h。將滅活后的嗜水氣單胞菌于5000 r/min 離心10min 沉淀菌體, 棄置上清后用PBS 懸浮再離心以去除殘余的甲醛, 重復(fù)3次。用PBS稀釋調(diào)整菌的濃度至1.0×108CFU/mL, 即為嗜水氣單胞菌滅活疫苗。將滅活疫苗與Montanide ISA206(法國(guó), Seppic)佐劑按1﹕1(質(zhì)量比)準(zhǔn)備, 然后分別加熱至(30±2)℃, 將Montanide ISA206佐劑倒入組織勻漿機(jī)中, 以200 r/min攪拌,并將滅活疫苗緩慢加入, 待滅活疫苗加完后, 提高攪拌速度至2000 r/min, 保持在30℃攪拌10min后逐漸降低攪拌速將苗液冷卻至15℃停機(jī), 在15℃以下靜置24h后完成制備, 于4℃保存?zhèn)溆?。CiBD1的佐劑組是先將CiBD1重組蛋白與嗜水氣單胞菌滅活疫苗混合后再按上述方法與Montanide ISA206佐劑混合完成制備。吸取100 μL 疫苗涂布在無(wú)抗LB固體平板上, 37℃培養(yǎng)72h, 期間沒有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng),完成疫苗的無(wú)菌性檢測(cè)。以100 μL/尾的劑量, 將制備好的各疫苗組注射到20尾健康草魚體內(nèi), 以PBS作為陰性對(duì)照。觀察7d后, 草魚未出現(xiàn)死亡即完成疫苗的安全性檢測(cè)。

將暫養(yǎng)兩周的健康草魚[(30±5)g]隨機(jī)分為對(duì)照組, 疫苗組和疫苗+CiBD1組置于3個(gè)單獨(dú)的400 L養(yǎng)殖水缸中。每組3個(gè)平行, 每個(gè)平行30尾魚, 每組的3個(gè)平行在同一個(gè)大缸中并用特制網(wǎng)箱分隔開。每尾魚腹腔注射100 μL PBS/疫苗/疫苗+CiBD1進(jìn)行免疫, 控制水溫為(28±2)℃, 免疫14d后用半致死濃度的嗜水氣單胞菌(5×107CFU/mL)進(jìn)行腹腔注射感染, 每尾注射量為200 μL。在感染前及感染后14d分別進(jìn)行1次取樣, 包括血清、頭腎和后腸。注射感染后每8h監(jiān)測(cè)1次, 統(tǒng)計(jì)14d的死亡率。

1.9 血清酶活測(cè)定和免疫相關(guān)基因qRT-PCR檢測(cè)

采用尾椎靜脈抽取草魚[(30±5)g]血液后在4℃靜置12h, 在4℃, 3000×g下離心15min, 收集血清。血清總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)、溶菌酶活性(Lysozyme Activity, LA)和補(bǔ)體C3酶活性的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。免疫相關(guān)基因采用qRT-PCR檢測(cè)方法同1.4。

1.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計(jì)分析和圖形展示。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的方式表示。用單因素變量方差分析法(ANOVA)對(duì)抑菌、趨化等只有單一變量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 兩組間采用非配對(duì)雙尾Student’st檢驗(yàn)判斷是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,用Mantel-Cox檢驗(yàn)對(duì)保護(hù)率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P<0.05被認(rèn)為具有顯著差異, 并用“*”標(biāo)記;P<0.01用“**”表示;P<0.001用“***”表示。

2 結(jié)果

2.1 CiBD1的生物信息學(xué)分析

參與比對(duì)的所有β-防御素均具有6個(gè)高度保守的半胱氨酸, 但是, 魚類β-防御素高度保守的第4號(hào)半胱氨酸與人、鼠和原雞的第4號(hào)半胱氨酸位置存在差異。圖1展現(xiàn)了人類、小鼠、原雞和多種魚類共39條β-防御素氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 。使用Neighbor-Joining聚類法, 在bootstrap檢驗(yàn)中, 進(jìn)行 500次重復(fù), 使用p-distance模型計(jì)算進(jìn)化距離,在任何位置都允許少于50%的比對(duì)間隙、缺失數(shù)據(jù)和模糊的堿基。在進(jìn)化關(guān)系上, 草魚β-防御素與鯉、團(tuán)頭魴和斑馬魚更為相近。通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)得到的CiBD1成熟肽序列為: ASFPWTCASLSGVCRQGVCLPSELYFGSLGCGKGFLCCVSH FG。使用PyMOL軟件對(duì)CiBD1成熟肽進(jìn)行可視化分析, CiBD1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中C端有一個(gè)α螺旋, 另外最為明顯的特征是3個(gè)反向平行的β折疊, 這正是其高度保守的6個(gè)半胱氨酸兩兩連接組成, 是β-防御素最為典型的結(jié)構(gòu)特征之一。當(dāng)展現(xiàn)CiBD1靜電勢(shì)表面時(shí), 其表面包含疏水基團(tuán)與親水基團(tuán), 同時(shí)正電荷分布大于負(fù)電荷, 由此可見CiBD1為陽(yáng)離子兩親性蛋白。

圖1 β-防御素氨基酸序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 NJ phylogenetic tree of β-defensin amino acid sequence

2.2 嗜水氣單胞菌感染前后CiBD1的組織轉(zhuǎn)錄水平

為了探究CiBD1的生理學(xué)作用, 我們研究了CiBD1基因在正常生理?xiàng)l件下草魚不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平(圖2), 在感染前的各組織中, 皮膚和眼是CiBD1轉(zhuǎn)錄水平最高的兩個(gè)組織。嗜水氣單胞菌感染72h后的草魚各組織中CiBD1轉(zhuǎn)錄水平與感染前相比有明顯差異, 表現(xiàn)為與黏膜免疫相關(guān)的組織,如皮膚、鰾、后腸和眼中的CiBD1的轉(zhuǎn)錄水平較為顯著。

圖2 嗜水氣單胞菌感染前后CiBD1在各組織中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Constitutive levels of CiBD1 transcription in different tissues before and after A.hydrophila infection

2.3 獲得CiBD1重組蛋白

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中進(jìn)行菌液PCR后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果(圖3A)顯示在159 bp處有一條特異性條帶, 大小與預(yù)測(cè)的目的條帶一致。采用pET-32a質(zhì)粒, 選擇KpnⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)間插入目的基因片段。12%的SDSPAGE凝膠電泳結(jié)果顯示, IPTG誘導(dǎo)后在22.5 kD大小處出現(xiàn)特異性條帶(圖3B), 與重組融合蛋白預(yù)測(cè)大小一致。使用His標(biāo)簽進(jìn)行融合蛋白免疫印跡檢測(cè), 結(jié)果顯示在22.5 kD大小處出現(xiàn)與預(yù)測(cè)大小一致的特異性條帶(圖3C)。腸激酶切后用15%的Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠檢測(cè)結(jié)果顯示在4.7 kD大小處出現(xiàn)特異性條帶(圖3D), 與目的蛋白大小一致。

圖3 重組質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白表達(dá)純化及檢測(cè)Fig.3 Construction of recombinant plasmid and expression, purification and detection of protein

2.4 CiBD1蛋白具有體外抑菌活性

CFU平板法檢測(cè)CiBD1蛋白的抗菌活性。選擇兩種革蘭氏陰性菌(嗜水氣單胞菌和大腸桿菌)和兩種革蘭氏陽(yáng)性菌(無(wú)乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌)進(jìn)行蛋白抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示CiBD1蛋白對(duì)兩種G–和G+均具有抑制活性(圖4A)。對(duì)細(xì)菌平板拍照后用ImageJ軟件進(jìn)行計(jì)數(shù), 將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成柱形圖直觀展示, 并進(jìn)行顯著性分析(圖4B)。

圖4 CiBD1的抗菌活性分析Fig.4 Antibacterial activity analysis of CiBD1

2.5 CiBD1蛋白對(duì)草魚原代白細(xì)胞具有趨化功能

使用Percoll梯度離心法分離草魚頭腎白細(xì)胞,吸取100 μL制備涂片后通過(guò)吉姆薩染色并進(jìn)行掃描電鏡, 參照相關(guān)研究報(bào)道[12]對(duì)淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察與鑒定(圖5A)。

采用遷移小室進(jìn)行白細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn), 收集趨化后的外室細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分群與計(jì)數(shù)(圖5B)。將各組細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)換成柱形圖的方式進(jìn)行展現(xiàn), 淋巴系細(xì)胞與髓系細(xì)胞分開展現(xiàn)(圖5C和5D)。以5%FBS作為陽(yáng)性對(duì)照, 結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)CiBD1蛋白對(duì)草魚白細(xì)胞的趨化遷移能力與蛋白濃度正相關(guān)。CiBD1蛋白在50 ng/mL時(shí)對(duì)草魚頭腎淋巴系細(xì)胞和髓系細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨化活性。

圖5 CiBD1對(duì)草魚白細(xì)胞的趨化活性Fig.5 Chemotactic activity of CiBD1 on grass carp leukocyte

2.6 CiBD1蛋白能保護(hù)草魚抵抗嗜水氣單胞菌感染

依據(jù)草魚免疫應(yīng)答產(chǎn)生規(guī)律[13], 設(shè)置免疫和感染時(shí)間節(jié)點(diǎn)如圖6A所示。感染后14d的存活率曲線(圖6B)顯示, 疫苗+CiBD1組草魚存活率最高, 且與疫苗組和對(duì)照組存在顯著性差異。

用分光光度法對(duì)血清T-SOD、LA和C3進(jìn)行測(cè)定(圖6C—E)。免疫后14d疫苗組和疫苗+CiBD1組的T-SOD、LA和C3均顯著高于對(duì)照組, 且疫苗+CiBD1組的T-SOD和LA顯著高于疫苗組。感染后14d疫苗+CiBD1組的T-SOD、LA和C3均顯著高于對(duì)照組和疫苗組。

免疫前、免疫后14d(感染前)和感染后14d分別檢測(cè)后腸和頭腎中免疫基因IL-1β、IL-6、MHCII、IgM和IgZ的表達(dá)水平(圖6F1—F4)。結(jié)果顯示,免疫后14d, 疫苗+CiBD1組頭腎中IL-1β和IgM表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組及疫苗組,IL-6和IgZ的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(圖6F1); 疫苗+CiBD1組和疫苗組后腸中IL-1β、IgM和IgZ的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著提高, 但疫苗+CiBD1組和疫苗組之間未表現(xiàn)出顯著性差異(圖6F2)。感染后14d, 疫苗+CiBD1組頭腎中IgM和MHC II表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和疫苗組, 疫苗+CiBD1組和疫苗組IL-6表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(圖6F3); 疫苗+CiBD1組和疫苗組后腸中IL-1β表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組, 疫苗+CiBD1組MHC II表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和疫苗組, 疫苗組IgZ表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組, 而疫苗+CiBD1組IgZ表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(圖6F4)。

3 討論

3.1 CiBD1的生物信息學(xué)與組織分布分析

防御素是一類廣泛存在于動(dòng)植物界中的小型陽(yáng)離子抗菌肽, 但在魚類中僅存在β-防御素[14]。對(duì)CiBD1多肽的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 其具有β-防御素的典型結(jié)構(gòu), 即6個(gè)高度保守的半胱氨酸組成的3個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。本研究檢測(cè)CiBD1在嗜水氣單胞菌感染前后的組織表達(dá)水平結(jié)果表明, 感染前CiBD1呈組成型分布在草魚各組織并高表達(dá)于一些黏膜組織, 而細(xì)菌感染后一些與外周環(huán)境接觸密切的組織中的CiBD1轉(zhuǎn)錄水平上升顯著。CiBD1高表達(dá)于皮膚、眼和腸道等黏膜組織的結(jié)果預(yù)示著CiBD1在黏膜免疫的防御中可能發(fā)揮著重要作用,與高等脊椎動(dòng)物β-防御素主要在各種器官或組織的上皮細(xì)胞中產(chǎn)生一致[15]。隨著物種進(jìn)化, β-防御素結(jié)構(gòu)、種類和功能變得多樣, 草魚作為早期進(jìn)化的脊椎動(dòng)物, 目前僅發(fā)現(xiàn)三種結(jié)構(gòu)相似的β-防御素。而在人和鼠上有多達(dá)48種β-防御素[16,17], 這些β-防御素功能多樣, 如抗細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲活性, 以及趨化, 誘導(dǎo)細(xì)胞成熟, 補(bǔ)體激活, 結(jié)合LPS和損傷修復(fù)等免疫調(diào)節(jié)功能[18]。CiBD1在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性, 在功能上也與哺乳動(dòng)物存在很大的相似性。

3.2 CiBD1的抗菌活性及趨化活性檢測(cè)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)用于外源蛋白的表達(dá)具有方便高效且低廉的優(yōu)勢(shì), 通過(guò)腸激酶去除融合標(biāo)簽可以最大程度地保留重組蛋白的活性。本研究顯示純化并腸激酶切去融合標(biāo)簽的CiBD1對(duì)G+和G–具有一定的抑制活性, 但是最小殺菌濃度(MIC)較高。目前研究認(rèn)為, 抗菌肽主要通過(guò)膜破損的方式殺菌[19], 其殺菌能力在一定范圍與所帶正電荷成正比, 推測(cè)CiBD1較弱的電荷限制了其體外殺菌能力, 相較于PI值更高的蛋白如CXCL20a[20], CiBD1對(duì)細(xì)菌具有更高的MIC, 這與其他魚類β-防御素的報(bào)道一致[21]。

關(guān)于防御素的趨化活性, 在高等哺乳動(dòng)物已有大量報(bào)道, 而且不同類型人防御素表現(xiàn)出對(duì)不同細(xì)胞的趨化活性[22]。比如人β-防御素2是人上第一個(gè)被證明具有趨化活性的防御素[23], 其對(duì)肥大細(xì)胞具有趨化作用[24]; 在納克濃度下, HNP-1和HNP-2可以募集單核細(xì)胞集合到炎癥部位, 并對(duì)T細(xì)胞和未成熟的樹突狀細(xì)胞也有趨化活性[25]; 魚β-防御素趨化活性也有報(bào)道[26,27]。脊椎動(dòng)物免疫細(xì)胞趨化是一種重要的宿主防御機(jī)制[28,29], 尤其是抗原提呈細(xì)胞的趨化對(duì)免疫應(yīng)答的啟動(dòng)起著重要作用[30—32]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)50 ng/mL的CiBD1重組蛋白在體外對(duì)草魚白細(xì)胞具有明顯的趨化活性, 提示CiBD1具備免疫佐劑的應(yīng)用潛力。

3.3 免疫佐劑效應(yīng)探究

免疫佐劑是一類能夠非特異性增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng), 但本身不具備抗原性的物質(zhì)[33]。免疫佐劑具有減少抗原使用量, 迅速激活免疫系統(tǒng),增強(qiáng)免疫應(yīng)答等作用。免疫佐劑種類很多, 包含鋁佐劑、微生物類佐劑、蜂膠佐劑、油乳佐劑、左旋咪唑佐劑、中藥佐劑及小肽類佐劑等。一些常規(guī)佐劑雖然具有一定的免疫增強(qiáng)效果, 但同時(shí)會(huì)存在一些副作用, 如鋁佐劑在白鼠體內(nèi)可進(jìn)入大腦,存在安全風(fēng)險(xiǎn); 左旋咪唑佐劑長(zhǎng)期使用會(huì)引起腹瀉[34]。開發(fā)生物來(lái)源的小肽佐劑是疫苗佐劑的研究新方向, 因其具有更高的生物安全性。目前研究證實(shí)β-防御素具有較好的免疫佐劑效果, 如人β-防御素3作為免疫佐劑可以增強(qiáng)金黃色葡萄球菌滅活疫苗對(duì)小鼠保護(hù)效果, 潛在機(jī)理可能是通過(guò)上調(diào)CD80/CD86和MHCⅡ表達(dá)水平[35]; 重組禽β-防御素rAvBD12613作為免疫佐劑在新城疫活疫苗和滅活疫苗中均具有良好的免疫佐劑活性[36]。本研究探究了CiBD1蛋白對(duì)嗜水氣單胞菌滅活疫苗的佐劑增強(qiáng)效應(yīng), 各組存活率如圖6B所示, 疫苗+ CiBD1組較疫苗組顯著提高了草魚存活率, 表明CiBD1可以增強(qiáng)疫苗免疫效果, 提高草魚抵抗嗜水氣單胞菌的感染。白細(xì)胞介素-1 (IL-1)家族成員是先天免疫系統(tǒng)中非常重要的炎癥因子[37],IL-1包括IL-1α和IL-1β兩種形式,IL-1β可以激活I(lǐng)L-6表達(dá), 選擇性介導(dǎo)對(duì)血管損傷的修復(fù)[38]。本研究發(fā)現(xiàn)免疫后14d, 疫苗+ CiBD1組頭腎中IL-1β轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組和疫苗組; 后腸中IL-6轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組。感染后14d, 與對(duì)照組相比, 疫苗+ CiBD1組頭腎中IL-1β和IL-6轉(zhuǎn)錄水平均有所下降。提示CiBD1可調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)水平。補(bǔ)體和溶菌酶是魚類先天性免疫的重要免疫分子, 本研究發(fā)現(xiàn),免疫后14d和感染后14d實(shí)驗(yàn)組血清中溶菌酶和C3含量高于對(duì)照組。以上結(jié)果提示CiBD1作為免疫佐劑可以增強(qiáng)疫苗對(duì)草魚先天性免疫系統(tǒng)的激活。

圖6 嗜水氣單胞菌體外感染實(shí)驗(yàn)Fig.6 A.hydrophila infection in vitro

MHC II對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞至關(guān)重要, 本研究結(jié)果顯示, 疫苗+CiBD1組在感染14d后MHCⅡ顯著上升, 說(shuō)明CiBD1可以增強(qiáng)疫苗的抗原提呈, 促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。IgM是硬骨魚類血清中最主要的免疫球蛋白, 在硬骨魚類抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用[39], 此外, 硬骨魚類所特有的免疫球蛋白IgZ在功能上與哺乳動(dòng)物IgA類似,主要表達(dá)于皮膚、鰓等黏膜組織, 在黏膜免疫中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn), 免疫后14d, 疫苗+ CiBD1組頭腎IgM轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組, 而后腸IgM和IgZ轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高。感染后14d, 疫苗+CiBD1組頭腎中IgM仍維持較高水平, 而疫苗組后腸IgZ轉(zhuǎn)錄水平顯著高于疫苗+ CiBD1組。這提示在免疫階段IgM和IgZ在頭腎和后腸中會(huì)大量表達(dá),參與機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng); 感染后IgM和IgZ會(huì)發(fā)揮免疫防御作用, 參與病原體的清除。以上結(jié)果提示CiBD1可以提高疫苗對(duì)適應(yīng)性免疫的應(yīng)答能力,具有潛在的免疫佐劑效應(yīng)。

4 總結(jié)

綜上所述, CiBD1 是一類高度保守的小分子陽(yáng)離子抗菌肽,CiBD1呈組成型分布在草魚各組織并高表達(dá)于一些黏膜組織, 在機(jī)體受到病原或環(huán)境刺激時(shí), 一些與外周環(huán)境接觸密切組織中的CiBD1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)更顯著。CiBD1重組蛋白不僅在體外具有一定的抑菌活性, 而且對(duì)草魚頭腎淋巴系細(xì)胞和髓系細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨化活性。CiBD1可以提高嗜水氣單胞菌滅活疫苗的保護(hù)率和抗病力,具有良好的免疫佐劑效應(yīng)。