程安怡 王永陽(yáng) 翁華松 陳新華 張偉妮,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院, 福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué), 中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002; 3.寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司, 寧德 352100)

大黃魚(Larimichthys crocea)又稱黃花魚、黃魚, 屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Larimichthys), 是我國(guó)特有的海水經(jīng)濟(jì)魚類。2020年我國(guó)大黃魚產(chǎn)量為25.4×107kg, 較2019年上漲了12.6%, 穩(wěn)居海水養(yǎng)殖魚類榜首[1]。然而, 隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展, 疾病問(wèn)題日益突出, 已成為制約大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[2—4]。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌屬(Vibrio), 是一種嗜鹽嗜溫的兼性厭氧菌, 在海洋弧菌中占比最多[5,6], 還可導(dǎo)致人類細(xì)菌性食物中毒和腹瀉[7]。溶藻弧菌對(duì)多種水生動(dòng)物都具有致病性, 可以引起石珊瑚(Acroporasp.)的白化[8]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)的白便綜合征[9]、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的幼體壞死[10]和翡翠貽貝(Perna viridis)免疫器官功能障礙[11]等。該菌還能通過(guò)損傷的皮膚感染大黃魚[12]、金頭鯛(Sparus aurata)[13]和點(diǎn)帶石斑魚(Epi-nephelus malabaricus)[14]等多種海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類,給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。溶藻弧菌病是大黃魚養(yǎng)殖過(guò)程中的易發(fā)病害, 在我國(guó)大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)廣泛流行。感染初期, 患病大黃魚游動(dòng)緩慢,嘴部等體表充血并伴有炎癥, 肌肉松散, 鱗片易脫落; 感染后期出現(xiàn)體表潰瘍、嘴部爛穿和肝腎紅腫等癥狀, 最終死亡[12,15]。然而目前, 關(guān)于大黃魚抗溶藻弧菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制尚不清楚。鑒于大黃魚溶藻弧菌病的頻發(fā)及嚴(yán)重危害, 開展大黃魚抗該菌感染的機(jī)制探究十分必要。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)是借助高通量測(cè)序手段快速獲得某一物種的特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本信息, 已成為研究水產(chǎn)動(dòng)物免疫防御、脅迫應(yīng)激和生長(zhǎng)發(fā)育等分子機(jī)制的有效手段[16,17]。RNA-Seq已廣泛應(yīng)用于揭示魚類應(yīng)對(duì)病原感染的反應(yīng)機(jī)制, 如羅非魚抗海豚鏈球菌感染機(jī)制[18], 草魚抗嗜水氣單胞菌[19]和草魚呼腸孤病毒感染機(jī)制[20],大黃魚抗刺激隱核蟲[21]、嗜水氣單胞菌[22]和變形假單胞菌感染機(jī)制[23]等研究。

頭腎是大黃魚發(fā)育過(guò)程中最先出現(xiàn)的免疫器官, 是大黃魚巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等主要免疫細(xì)胞發(fā)生、分化和增殖的場(chǎng)所, 兼具中樞免疫器官和外周免疫器官的雙重功能[24]。本研究通過(guò)腹腔注射溶藻弧菌, 借助RNA-Seq和生物信息學(xué)分析的手段, 探究溶藻弧菌感染24h后大黃魚頭腎組織中基因表達(dá)水平的變化, 研究結(jié)果可為解析大黃魚抗溶藻弧菌感染的應(yīng)答機(jī)制及溶藻弧菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

溶藻弧菌為實(shí)驗(yàn)室前期從患病大黃魚上分離所得的菌株。用2216E液體培養(yǎng)基, 28℃, 200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)12h, 調(diào)整菌液濃度至1×108cfu/mL備用。

1.2 試驗(yàn)魚處理及樣品采集

試驗(yàn)用大黃魚購(gòu)自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司,挑選大小均一、狀態(tài)健康的30尾大黃魚[全長(zhǎng)(15±4)cm, 體質(zhì)量(52±10)g], 隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組, 飼養(yǎng)于1 m×1 m的小網(wǎng)箱中。試驗(yàn)期間水溫(28.56±0.90)℃, 鹽度34.51±0.71, 溶氧(6.52±0.40)mg/L, pH 7.84±0.62。

在1周暫養(yǎng)結(jié)束后, 實(shí)驗(yàn)組大黃魚腹腔注射200 μL濃度為1×108cfu/mL(半數(shù)致死量)的溶藻弧菌。注射后24h, 分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)撈取9尾魚,丁香酚(阿拉丁公司)麻醉后剖取頭腎, 每3尾魚的頭腎組織合并為一個(gè)混合樣, 無(wú)酶凍存管液氮速凍保存。對(duì)照(Control, C)組樣本命名為C1、C2和C3,注射溶藻弧菌(V.alginolyticus, V)的實(shí)驗(yàn)組樣本命名為V1、V2和V3, 共獲得6個(gè)樣本(2個(gè)組×3個(gè)生物學(xué)重復(fù))用于RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 RNA 的提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

組織總RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen, 美國(guó))法, mRNA通過(guò)帶有Oligo(dT)的磁珠從總RNA中分離出來(lái), 片段化后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)純化、末端修復(fù)、連接接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 得到cDNA文庫(kù), 最后用Illumina HiSeq 2000進(jìn)行測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析及轉(zhuǎn)錄本組裝

經(jīng)Illumina平臺(tái)測(cè)序, 獲得6個(gè)樣本的原始數(shù)據(jù)(Raw reads), 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾, 去除低質(zhì)量片段后, 獲得清潔數(shù)據(jù)(Clean reads), 將Clean reads與參考基因組比對(duì), 得到匹配數(shù)據(jù)(Mapped reads), 再用StringTie軟件(版本1.3.3b)[25]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝。參考基因來(lái)源:Larimichthys crocea(Gen-Bank登錄號(hào): JRPU02000000[26,27])。

1.5 差異表達(dá)基因的鑒定

基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量借助RNA Seq by Expectation Maximization(RSEM)軟件(版本1.3.1)進(jìn)行計(jì)算, 以Transcripts Per Million reads(TPM)作為定量指標(biāo)[28]。使用DESeq2(版本1.24.0)分析鑒定樣本間差異表達(dá)的基因, 當(dāng)一個(gè)基因同時(shí)滿足false discovery rate(FDR)<0.05和|log2Fold Change|≥1時(shí),則認(rèn)為該基因是差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)[29]。

1.6 DEGs功能注釋和信號(hào)通路分析

借助Goatools軟件、用Fisher精確檢驗(yàn)方法將所有的DEGs比對(duì)到Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)。同時(shí)使用KOBAS軟件、用Fisher精確檢驗(yàn)方法將DEGs比對(duì)到Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)。GO和KEGG富集分析多重檢驗(yàn)采用Benjamini and Hochberg(BH)方法[30]。當(dāng)校正的P<0.05時(shí), 認(rèn)為該GO功能分類/KEGG通路存在顯著富集;P<0.01時(shí)存在極顯著富集。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qPCR)驗(yàn)證

測(cè)序后選取7個(gè)差異表達(dá)基因(C7、Hepcidin-1、IL-8、JUN、ZAP-70、GATA3和TCRβ)進(jìn)行qPCR驗(yàn)證(引物序列見表1)。使用與測(cè)序同批次的總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國(guó))合成cDNA。PCR反應(yīng)總體系為20 μL, 包括10 μL SYBR Mix(Promega, 美國(guó)), 0.1 μL上下游引物(10 μmol/L), 0.5 μL cDNA和9.3 μL雙蒸水。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性150s; 95℃ 15s, 58℃ 20s, 72℃ 20s, 40個(gè)循環(huán); 熔解曲線分析產(chǎn)物特異性。以β-actin為內(nèi)參基因, 采用2–ΔΔCt方法[31]分析, 使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

2 結(jié)果

2.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估、序列比對(duì)分析

本研究構(gòu)建了對(duì)照和溶藻弧菌注射24h后大黃魚頭腎共6個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù), 經(jīng)Illumina平臺(tái)測(cè)序, 在移除adaptor和低質(zhì)量序列后, 各樣本的clean reads均在4847萬(wàn)條以上, 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的測(cè)序堿基平均錯(cuò)誤率均小于0.026%, Q20堿基百分比在97.75%以上, Q30堿基百分比在93.69%以上, 說(shuō)明測(cè)序結(jié)果質(zhì)量較好; 對(duì)照組(C1、C2和C3)和實(shí)驗(yàn)組(V1、V2和V3)的clean reads成功比對(duì)到大黃魚基因組的比例分別為87.43%、86.26%、85.96%、88.93%、90.07%和88.10%, 說(shuō)明參考基因組的選擇合理; 成功比對(duì)到CDS的比例為70.15%、67.33%、61.64%、70.94%、74.40%和71.31%, 說(shuō)明測(cè)序深度足以覆蓋轉(zhuǎn)錄組(表2)。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary of sequencing data

2.2 DEGs聚類分析

在注射溶藻弧菌24h后, 實(shí)驗(yàn)組大黃魚頭腎轉(zhuǎn)錄組與對(duì)照組相比, 有1903個(gè)差異表達(dá)基因, 其中641個(gè)上調(diào)基因, 1262個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類熱圖分析(圖1), 溶藻弧菌感染對(duì)大黃魚頭腎基因表達(dá)水平的影響顯著, 同一樣本的不同重復(fù)基因表達(dá)相近。

圖1 差異表達(dá)基因聚類熱圖Fig.1 Clustering heatmap of DEGs

2.3 DEGs的GO功能分類

對(duì)1903個(gè)DEGs進(jìn)行GO富集分析, 發(fā)現(xiàn)在47個(gè)GO terms存在顯著富集(P<0.05), 包括32個(gè)生物學(xué)進(jìn)程(Biological process, BP)類、10個(gè)分子功能(Molecular function, MF)類和5個(gè)細(xì)胞組分(Cellular component, CC)類。存在極顯著富集(P<0.01)的26個(gè)GO terms如圖2所示, 其中免疫系統(tǒng)進(jìn)程(Immune system process)、免疫應(yīng)答(Immune response)、細(xì)胞因子活性(Cytokine activity)、趨化因子活性(Chemokine activity)和趨化因子受體結(jié)合(Chemokine receptor binding)等免疫相關(guān)的GO terms在大黃魚頭腎中都極顯著富集。此外, 血紅蛋白復(fù)合物(Hemoglobin complex)、氧結(jié)合(Oxygen binding)和氧載體活性(Oxygen carrier activity)也發(fā)生了極顯著富集, 且這3個(gè)GO terms中的12個(gè)DEGs在感染組中均顯著下調(diào)。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能富集(P<0.01)Fig.2 Enrichment of gene ontology classifications for the DEGs(P<0.01)

2.4 DEGs的KEGG功能分類

對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG功能注釋, 發(fā)現(xiàn)45個(gè)信號(hào)通路存在顯著富集(P<0.05), 其中極顯著富集的有31個(gè)(P<0.01; 圖3), 且28個(gè)都與疾病和免疫相關(guān),包括金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureusinfection)、致病性大腸桿菌感染(PathogenicEscherichia coliinfection)等與疾病相關(guān)的通路; 造血細(xì)胞譜系(Hematopoietic cell lineage)、Th1和Th2細(xì)胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)等與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路; 如細(xì)胞因子受體互作(Cytokine-cytokine receptor interaction)、NF-κB信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)等與信號(hào)分子和傳導(dǎo)相關(guān)的通路。而且, 富集到T細(xì)胞受體信號(hào)通路(圖4)中的26個(gè)DEGs在感染組中的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析(P<0.01)Fig.3 KEGG highly significant enrichment pathways of DEGs (P<0.01)

圖4 T細(xì)胞受體信號(hào)通路Fig.4 T cell receptor signal pathway

2.5 免疫應(yīng)答相關(guān)的主要DEGs

基于GO和KEGG分析的結(jié)果, 統(tǒng)計(jì)了與免疫相關(guān)的代表性DEGs(表3)。與先天性免疫相關(guān)的如補(bǔ)體家族(C1qbp、C1QL2和C7)、熱休克蛋白家族(hspd1、hspa4、hspa5和hspa9)、抗菌肽(Hepcidin-1)、C型凝集素受體(Clec4e和MR1)、己糖激酶(hex1)、精氨酸酶(Arg-II)和線粒體翻譯延伸因子(TUFM)等均顯著上調(diào)。而與T、B細(xì)胞增殖分化(FcR5和CCL17)、T細(xì)胞調(diào)控(TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3γδ、CD3ζ、LCK、FYN、ZAP-70、ITK、JUN和NFATC2)及免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)參與抗原識(shí)別(Ighv 5A、Ighv 914和Ighv XIG14)等獲得性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)。此外, 血紅蛋白亞基基因(HBA1、HBAA、HBAD和HBB2)等需氧代謝相關(guān)DEGs均顯著下調(diào)。

表3 免疫應(yīng)答相關(guān)的主要DEGsTab.3 Main DEGs related to immune response

2.6 熒光定量PCR驗(yàn)證部分DEGs

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在溶藻弧菌感染后, 大黃魚頭腎組織中C7和Hepcidin-1的表達(dá)水平顯著上調(diào),IL-8、JUN、ZAP-70、GATA3和TCRβ基因的表達(dá)水平顯著下調(diào), 這些基因的變化趨勢(shì)與測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致(圖5)。

圖5 熒光定量PCR驗(yàn)證部分DEGsFig.5 qPCR validation of partial DEGs

3 討論

作為我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類, 大黃魚的健康養(yǎng)殖受到學(xué)者的普遍關(guān)注。溶藻弧菌是大黃魚養(yǎng)殖過(guò)程中的常見病原菌, 然而其抗溶藻弧菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制尚不明確。因此, 本文以溶藻弧菌為試驗(yàn)菌, 比較了該菌感染后大黃魚頭腎組織轉(zhuǎn)錄水平的變化, 共篩選到1903個(gè)DEGs, 占大黃魚26000多個(gè)基因總數(shù)[27]的約7.3%, 說(shuō)明溶藻弧菌感染可以有效刺激大黃魚產(chǎn)生免疫應(yīng)答。經(jīng)質(zhì)控分析和qPCR驗(yàn)證, 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好、結(jié)果可信。

3.1 溶藻弧菌感染對(duì)大黃魚先天性免疫的影響

先天性免疫是魚類抵抗病原感染的第一道防線, 也是適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)者[32]。先天性免疫分子主要包括補(bǔ)體、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等[33]。本研究發(fā)現(xiàn), 在注射溶藻弧菌24h后, 大黃魚頭腎中一些先天性免疫相關(guān)基因, 包括補(bǔ)體(C1qbp、C1QL2和C7)、抗菌肽(hepcidin-1)、C型凝集素受體(Clec4e和MR1)、己糖激酶(hex1)和精氨酸酶(Arg-II)等表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。補(bǔ)體(Complement, C)系統(tǒng)是魚類先天免疫的重要組分之一,激活后具有細(xì)胞溶解、調(diào)理吞噬等生物學(xué)效應(yīng),C1和C7均為補(bǔ)體固有成分, C7已被證明參與了溶藻弧菌刺激大黃魚產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[34]。hepcidin抗菌肽具有廣泛的抗細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物活性[27,35], 大黃魚hepcidin已被證實(shí)能抑制嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的生長(zhǎng)[36]。C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員E(C-type lectin domain family 4 member E, Clec4e)又稱巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素(the macrophage-inducible C-type lectin, Mincle), 主要分布在單核/巨噬細(xì)胞表面, 哺乳類Clec4e已被證實(shí)能夠識(shí)別細(xì)菌、真菌等病原[37], 本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)大黃魚Clec4e通過(guò)結(jié)合病原菌表面的糖類病原體相關(guān)分子模式來(lái)識(shí)別病原, 參與大黃魚抗細(xì)菌感染的免疫防御。甘露糖受體(Mannose receptor, MR)也屬于C型凝集素超家族, 參與先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞甘露糖受體MR1可以結(jié)合致病菌、病毒和真菌表面的甘露糖結(jié)構(gòu), 通過(guò)吞噬作用實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的清除[38]。作為經(jīng)典的代謝酶, 己糖激酶hexokinase-1不僅能催化各種己糖的磷酸化, 還能通過(guò)充當(dāng)細(xì)菌肽聚糖的模式識(shí)別受體參與先天免疫和炎癥[39]。精氨酸酶(Arginase)是巨噬細(xì)胞極化的主要標(biāo)志, 牙鲆腎、鰓等免疫組織及離體巨噬細(xì)胞Arg-Ⅱ基因已被證實(shí)響應(yīng)遲緩愛德華氏菌感染[40]。線粒體翻譯延伸因子(Tu translation elongation factor, TUFM), 是一種線粒體蛋白, 主要參與機(jī)體抗病毒信號(hào)通路的調(diào)控, 青魚TUFM基因在LPS刺激后出現(xiàn)顯著上調(diào)[41]。在細(xì)菌感染后, 補(bǔ)體[23,42]、抗菌肽[23,43]和模式識(shí)別受體[18,19,22,42,44]等先天性免疫基因的表達(dá)上調(diào)已在多種魚類中被證實(shí), 說(shuō)明先天性免疫是魚類抗細(xì)菌感染的普遍應(yīng)答反應(yīng)。

細(xì)菌感染早期往往會(huì)引起魚類IL-1β和IL-8等炎性因子的表達(dá)上調(diào)[18,19,22], 然而張恒澤等[45]研究發(fā)現(xiàn)大黃魚脾臟IL-1β在假單胞菌活疫苗免疫后的早期出現(xiàn)下調(diào), 在7d后上調(diào)。本研究也發(fā)現(xiàn)頭腎組織中IL-8的表達(dá)水平在溶藻弧菌感染24h后顯著下調(diào)。熱休克蛋白(Heat shock protein, HSP)是典型的應(yīng)激蛋白, 然而魚類HSP70已被證實(shí)可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力, 抑制氧自由基的生成, 發(fā)揮對(duì)炎癥損傷機(jī)體的保護(hù)作用[46]。在本實(shí)驗(yàn)中,HSP70基因(hspa4、hspa5和hspa9)在溶藻弧菌感染后的高表達(dá)可能是導(dǎo)致炎性因子IL-8表達(dá)下調(diào)的原因之一。這與高溫脅迫下大黃魚肝臟蛋白組學(xué)中的研究結(jié)果是吻合的[47]。

3.2 溶藻弧菌感染對(duì)大黃魚獲得性免疫的影響

獲得性免疫系統(tǒng)通過(guò)特異性受體(如TCR)識(shí)別來(lái)自病原體的特定抗原[48]。TCR位于T細(xì)胞表面,多由α和β兩條鏈組成, 直接參與T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別[49]。CD3是TCR的輔助受體, 哺乳動(dòng)物CD3包括γ、δ、ε和ζ四個(gè)亞基, 而硬骨魚類CD3包括ε、ζ和γδ(哺乳動(dòng)物CD3γ和CD3δ的前身)三個(gè)亞基[50]。ZAP-70參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答, 被活化的TCR招募后激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[51]。ITK屬于Tec家族非受體酪氨酸激酶, 是TCR下游的關(guān)鍵信號(hào)介質(zhì)[52], 參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的分化[53]。本文結(jié)果顯示, 在注射溶藻弧菌24h后, 大黃魚TCR信號(hào)通路上的許多基因, 如TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3γδ、CD3ζ、ZAP-70和ITK等均顯著下調(diào), 說(shuō)明該通路被抑制。這與本團(tuán)隊(duì)前期用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[22]和變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)[23]感染大黃魚后脾臟中TCR信號(hào)通路受到抑制的結(jié)果是一致的。

FcR5是一種B細(xì)胞應(yīng)答抗原的調(diào)節(jié)蛋白, 可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖[54]。趨化因子CCL17能夠促進(jìn)T細(xì)胞的發(fā)育, 并參與成熟T細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和激活[55]。在本試驗(yàn)中, 溶藻弧菌感染組大黃魚FcR5和CCL17的表達(dá)量都顯著下調(diào)。同時(shí), KEGG富集分析結(jié)果顯示, 造血細(xì)胞譜系(Hematopoietic cell lineage)中大部分DEGs顯著下調(diào), 也驗(yàn)證了T、B細(xì)胞的增殖分化受到抑制?？梢? 注射溶藻弧菌24h后大黃魚特異性免疫細(xì)胞的增殖受到抑制。由于機(jī)體適應(yīng)性免疫的激活較晚, 在感染早期阻斷TCR途徑、抑制特異性免疫細(xì)胞的增殖發(fā)育, 可能為先天免疫節(jié)省足夠的能量, 有利于魚類抗病原感染的免疫應(yīng)答。

此外, 溶藻弧菌感染后大黃魚頭腎血紅蛋白亞基基因(HBA1、HBAA、HBAD和HBB2)表達(dá)水平均顯著下調(diào)。血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧氣的特殊蛋白質(zhì), 是一個(gè)由兩個(gè)α鏈(HBA)和兩個(gè)β鏈(HBB)組成的四聚體[56]。血紅蛋白亞基表達(dá)水平的下降會(huì)直接影響血紅蛋白。含量從而影響紅細(xì)胞的攜氧能力。同時(shí), GO富集分析顯示, 與需氧代謝有關(guān)的氧結(jié)合(Oxygen binding)和氧載體活性(Oxygen carrier activity)也發(fā)生極顯著富集, 且其中的DEGs在感染組中均顯著下調(diào)。該結(jié)果顯示, 在溶藻弧菌感染后, 大黃魚血液的氧傳輸能力下降, 可能跟該菌的溶血活性有關(guān)[57], 但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述, 本研究分析了溶藻弧菌感染后24h大黃魚頭腎轉(zhuǎn)錄組的變化, 結(jié)果顯示, 大黃魚補(bǔ)體、熱激蛋白、抗菌肽和甘露糖受體等一些先天性免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào), 而TCR信號(hào)通路、特異性免疫細(xì)胞增殖發(fā)育等相關(guān)基因表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。可見在溶藻弧菌感染早期, 大黃魚的先天性免疫被激活、獲得性免疫被抑制。本文結(jié)果表明, 先天性免疫在大黃魚抗溶藻弧菌早期感染中發(fā)揮重要作用。