程安怡 王永陽 翁華松 陳新華 張偉妮,

(1.福建農(nóng)林大學海洋研究院, 福建省海洋生物技術重點實驗室, 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學, 中西獸醫(yī)結合與動物保健福建省高校重點實驗室, 福州 350002; 3.寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司, 寧德 352100)

大黃魚(Larimichthys crocea)又稱黃花魚、黃魚, 屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Larimichthys), 是我國特有的海水經(jīng)濟魚類。2020年我國大黃魚產(chǎn)量為25.4×107kg, 較2019年上漲了12.6%, 穩(wěn)居海水養(yǎng)殖魚類榜首[1]。然而, 隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展, 疾病問題日益突出, 已成為制約大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[2—4]。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌屬(Vibrio), 是一種嗜鹽嗜溫的兼性厭氧菌, 在海洋弧菌中占比最多[5,6], 還可導致人類細菌性食物中毒和腹瀉[7]。溶藻弧菌對多種水生動物都具有致病性, 可以引起石珊瑚(Acroporasp.)的白化[8]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)的白便綜合征[9]、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的幼體壞死[10]和翡翠貽貝(Perna viridis)免疫器官功能障礙[11]等。該菌還能通過損傷的皮膚感染大黃魚[12]、金頭鯛(Sparus aurata)[13]和點帶石斑魚(Epi-nephelus malabaricus)[14]等多種海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類,給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。溶藻弧菌病是大黃魚養(yǎng)殖過程中的易發(fā)病害, 在我國大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)廣泛流行。感染初期, 患病大黃魚游動緩慢,嘴部等體表充血并伴有炎癥, 肌肉松散, 鱗片易脫落; 感染后期出現(xiàn)體表潰瘍、嘴部爛穿和肝腎紅腫等癥狀, 最終死亡[12,15]。然而目前, 關于大黃魚抗溶藻弧菌感染的免疫應答機制尚不清楚。鑒于大黃魚溶藻弧菌病的頻發(fā)及嚴重危害, 開展大黃魚抗該菌感染的機制探究十分必要。

轉錄組測序(RNA-Seq)是借助高通量測序手段快速獲得某一物種的特定組織或細胞在特定狀態(tài)下的轉錄本信息, 已成為研究水產(chǎn)動物免疫防御、脅迫應激和生長發(fā)育等分子機制的有效手段[16,17]。RNA-Seq已廣泛應用于揭示魚類應對病原感染的反應機制, 如羅非魚抗海豚鏈球菌感染機制[18], 草魚抗嗜水氣單胞菌[19]和草魚呼腸孤病毒感染機制[20],大黃魚抗刺激隱核蟲[21]、嗜水氣單胞菌[22]和變形假單胞菌感染機制[23]等研究。

頭腎是大黃魚發(fā)育過程中最先出現(xiàn)的免疫器官, 是大黃魚巨噬細胞、粒細胞和B淋巴細胞等主要免疫細胞發(fā)生、分化和增殖的場所, 兼具中樞免疫器官和外周免疫器官的雙重功能[24]。本研究通過腹腔注射溶藻弧菌, 借助RNA-Seq和生物信息學分析的手段, 探究溶藻弧菌感染24h后大黃魚頭腎組織中基因表達水平的變化, 研究結果可為解析大黃魚抗溶藻弧菌感染的應答機制及溶藻弧菌病的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

溶藻弧菌為實驗室前期從患病大黃魚上分離所得的菌株。用2216E液體培養(yǎng)基, 28℃, 200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)12h, 調整菌液濃度至1×108cfu/mL備用。

1.2 試驗魚處理及樣品采集

試驗用大黃魚購自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司,挑選大小均一、狀態(tài)健康的30尾大黃魚[全長(15±4)cm, 體質量(52±10)g], 隨機分為對照組和實驗組, 飼養(yǎng)于1 m×1 m的小網(wǎng)箱中。試驗期間水溫(28.56±0.90)℃, 鹽度34.51±0.71, 溶氧(6.52±0.40)mg/L, pH 7.84±0.62。

在1周暫養(yǎng)結束后, 實驗組大黃魚腹腔注射200 μL濃度為1×108cfu/mL(半數(shù)致死量)的溶藻弧菌。注射后24h, 分別從對照組和實驗組中隨機撈取9尾魚,丁香酚(阿拉丁公司)麻醉后剖取頭腎, 每3尾魚的頭腎組織合并為一個混合樣, 無酶凍存管液氮速凍保存。對照(Control, C)組樣本命名為C1、C2和C3,注射溶藻弧菌(V.alginolyticus, V)的實驗組樣本命名為V1、V2和V3, 共獲得6個樣本(2個組×3個生物學重復)用于RNA提取和轉錄組測序。

1.3 RNA 的提取與轉錄組測序

組織總RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen, 美國)法, mRNA通過帶有Oligo(dT)的磁珠從總RNA中分離出來, 片段化后將mRNA逆轉錄成cDNA,經(jīng)純化、末端修復、連接接頭后進行PCR擴增, 得到cDNA文庫, 最后用Illumina HiSeq 2000進行測序。文庫構建和測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析及轉錄本組裝

經(jīng)Illumina平臺測序, 獲得6個樣本的原始數(shù)據(jù)(Raw reads), 對原始數(shù)據(jù)進行質控和過濾, 去除低質量片段后, 獲得清潔數(shù)據(jù)(Clean reads), 將Clean reads與參考基因組比對, 得到匹配數(shù)據(jù)(Mapped reads), 再用StringTie軟件(版本1.3.3b)[25]進行轉錄本組裝。參考基因來源:Larimichthys crocea(Gen-Bank登錄號: JRPU02000000[26,27])。

1.5 差異表達基因的鑒定

基因和轉錄本的表達量借助RNA Seq by Expectation Maximization(RSEM)軟件(版本1.3.1)進行計算, 以Transcripts Per Million reads(TPM)作為定量指標[28]。使用DESeq2(版本1.24.0)分析鑒定樣本間差異表達的基因, 當一個基因同時滿足false discovery rate(FDR)<0.05和|log2Fold Change|≥1時,則認為該基因是差異表達基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)[29]。

1.6 DEGs功能注釋和信號通路分析

借助Goatools軟件、用Fisher精確檢驗方法將所有的DEGs比對到Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)。同時使用KOBAS軟件、用Fisher精確檢驗方法將DEGs比對到Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)。GO和KEGG富集分析多重檢驗采用Benjamini and Hochberg(BH)方法[30]。當校正的P<0.05時, 認為該GO功能分類/KEGG通路存在顯著富集;P<0.01時存在極顯著富集。

1.7 實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qPCR)驗證

測序后選取7個差異表達基因(C7、Hepcidin-1、IL-8、JUN、ZAP-70、GATA3和TCRβ)進行qPCR驗證(引物序列見表1)。使用與測序同批次的總RNA通過反轉錄試劑盒(Promega, 美國)合成cDNA。PCR反應總體系為20 μL, 包括10 μL SYBR Mix(Promega, 美國), 0.1 μL上下游引物(10 μmol/L), 0.5 μL cDNA和9.3 μL雙蒸水。反應程序: 95℃預變性150s; 95℃ 15s, 58℃ 20s, 72℃ 20s, 40個循環(huán); 熔解曲線分析產(chǎn)物特異性。以β-actin為內參基因, 采用2–ΔΔCt方法[31]分析, 使用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

2 結果

2.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)質量評估、序列比對分析

本研究構建了對照和溶藻弧菌注射24h后大黃魚頭腎共6個樣本的轉錄組文庫, 經(jīng)Illumina平臺測序, 在移除adaptor和低質量序列后, 各樣本的clean reads均在4847萬條以上, 質控數(shù)據(jù)的測序堿基平均錯誤率均小于0.026%, Q20堿基百分比在97.75%以上, Q30堿基百分比在93.69%以上, 說明測序結果質量較好; 對照組(C1、C2和C3)和實驗組(V1、V2和V3)的clean reads成功比對到大黃魚基因組的比例分別為87.43%、86.26%、85.96%、88.93%、90.07%和88.10%, 說明參考基因組的選擇合理; 成功比對到CDS的比例為70.15%、67.33%、61.64%、70.94%、74.40%和71.31%, 說明測序深度足以覆蓋轉錄組(表2)。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.2 Summary of sequencing data

2.2 DEGs聚類分析

在注射溶藻弧菌24h后, 實驗組大黃魚頭腎轉錄組與對照組相比, 有1903個差異表達基因, 其中641個上調基因, 1262個下調基因。進一步對差異表達基因進行聚類熱圖分析(圖1), 溶藻弧菌感染對大黃魚頭腎基因表達水平的影響顯著, 同一樣本的不同重復基因表達相近。

圖1 差異表達基因聚類熱圖Fig.1 Clustering heatmap of DEGs

2.3 DEGs的GO功能分類

對1903個DEGs進行GO富集分析, 發(fā)現(xiàn)在47個GO terms存在顯著富集(P<0.05), 包括32個生物學進程(Biological process, BP)類、10個分子功能(Molecular function, MF)類和5個細胞組分(Cellular component, CC)類。存在極顯著富集(P<0.01)的26個GO terms如圖2所示, 其中免疫系統(tǒng)進程(Immune system process)、免疫應答(Immune response)、細胞因子活性(Cytokine activity)、趨化因子活性(Chemokine activity)和趨化因子受體結合(Chemokine receptor binding)等免疫相關的GO terms在大黃魚頭腎中都極顯著富集。此外, 血紅蛋白復合物(Hemoglobin complex)、氧結合(Oxygen binding)和氧載體活性(Oxygen carrier activity)也發(fā)生了極顯著富集, 且這3個GO terms中的12個DEGs在感染組中均顯著下調。

圖2 差異表達基因的GO功能富集(P<0.01)Fig.2 Enrichment of gene ontology classifications for the DEGs(P<0.01)

2.4 DEGs的KEGG功能分類

對DEGs進行KEGG功能注釋, 發(fā)現(xiàn)45個信號通路存在顯著富集(P<0.05), 其中極顯著富集的有31個(P<0.01; 圖3), 且28個都與疾病和免疫相關,包括金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureusinfection)、致病性大腸桿菌感染(PathogenicEscherichia coliinfection)等與疾病相關的通路; 造血細胞譜系(Hematopoietic cell lineage)、Th1和Th2細胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等與免疫系統(tǒng)相關的通路; 如細胞因子受體互作(Cytokine-cytokine receptor interaction)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等與信號分子和傳導相關的通路。而且, 富集到T細胞受體信號通路(圖4)中的26個DEGs在感染組中的表達水平均顯著低于對照組。

圖3 差異表達基因的KEGG富集分析(P<0.01)Fig.3 KEGG highly significant enrichment pathways of DEGs (P<0.01)

圖4 T細胞受體信號通路Fig.4 T cell receptor signal pathway

2.5 免疫應答相關的主要DEGs

基于GO和KEGG分析的結果, 統(tǒng)計了與免疫相關的代表性DEGs(表3)。與先天性免疫相關的如補體家族(C1qbp、C1QL2和C7)、熱休克蛋白家族(hspd1、hspa4、hspa5和hspa9)、抗菌肽(Hepcidin-1)、C型凝集素受體(Clec4e和MR1)、己糖激酶(hex1)、精氨酸酶(Arg-II)和線粒體翻譯延伸因子(TUFM)等均顯著上調。而與T、B細胞增殖分化(FcR5和CCL17)、T細胞調控(TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3γδ、CD3ζ、LCK、FYN、ZAP-70、ITK、JUN和NFATC2)及免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)參與抗原識別(Ighv 5A、Ighv 914和Ighv XIG14)等獲得性免疫相關基因表達水平均顯著下調。此外, 血紅蛋白亞基基因(HBA1、HBAA、HBAD和HBB2)等需氧代謝相關DEGs均顯著下調。

表3 免疫應答相關的主要DEGsTab.3 Main DEGs related to immune response

2.6 熒光定量PCR驗證部分DEGs

qPCR實驗結果顯示, 在溶藻弧菌感染后, 大黃魚頭腎組織中C7和Hepcidin-1的表達水平顯著上調,IL-8、JUN、ZAP-70、GATA3和TCRβ基因的表達水平顯著下調, 這些基因的變化趨勢與測序數(shù)據(jù)基本一致(圖5)。

圖5 熒光定量PCR驗證部分DEGsFig.5 qPCR validation of partial DEGs

3 討論

作為我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類, 大黃魚的健康養(yǎng)殖受到學者的普遍關注。溶藻弧菌是大黃魚養(yǎng)殖過程中的常見病原菌, 然而其抗溶藻弧菌感染的免疫應答機制尚不明確。因此, 本文以溶藻弧菌為試驗菌, 比較了該菌感染后大黃魚頭腎組織轉錄水平的變化, 共篩選到1903個DEGs, 占大黃魚26000多個基因總數(shù)[27]的約7.3%, 說明溶藻弧菌感染可以有效刺激大黃魚產(chǎn)生免疫應答。經(jīng)質控分析和qPCR驗證, 轉錄組數(shù)據(jù)質量良好、結果可信。

3.1 溶藻弧菌感染對大黃魚先天性免疫的影響

先天性免疫是魚類抵抗病原感染的第一道防線, 也是適應性免疫的啟動者[32]。先天性免疫分子主要包括補體、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等[33]。本研究發(fā)現(xiàn), 在注射溶藻弧菌24h后, 大黃魚頭腎中一些先天性免疫相關基因, 包括補體(C1qbp、C1QL2和C7)、抗菌肽(hepcidin-1)、C型凝集素受體(Clec4e和MR1)、己糖激酶(hex1)和精氨酸酶(Arg-II)等表達量均顯著高于對照組。補體(Complement, C)系統(tǒng)是魚類先天免疫的重要組分之一,激活后具有細胞溶解、調理吞噬等生物學效應,C1和C7均為補體固有成分, C7已被證明參與了溶藻弧菌刺激大黃魚產(chǎn)生的免疫應答[34]。hepcidin抗菌肽具有廣泛的抗細菌、病毒、真菌和原生動物活性[27,35], 大黃魚hepcidin已被證實能抑制嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的生長[36]。C型凝集素結構域家族4成員E(C-type lectin domain family 4 member E, Clec4e)又稱巨噬細胞誘導的C型凝集素(the macrophage-inducible C-type lectin, Mincle), 主要分布在單核/巨噬細胞表面, 哺乳類Clec4e已被證實能夠識別細菌、真菌等病原[37], 本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)大黃魚Clec4e通過結合病原菌表面的糖類病原體相關分子模式來識別病原, 參與大黃魚抗細菌感染的免疫防御。甘露糖受體(Mannose receptor, MR)也屬于C型凝集素超家族, 參與先天性和適應性免疫反應。巨噬細胞甘露糖受體MR1可以結合致病菌、病毒和真菌表面的甘露糖結構, 通過吞噬作用實現(xiàn)對病原的清除[38]。作為經(jīng)典的代謝酶, 己糖激酶hexokinase-1不僅能催化各種己糖的磷酸化, 還能通過充當細菌肽聚糖的模式識別受體參與先天免疫和炎癥[39]。精氨酸酶(Arginase)是巨噬細胞極化的主要標志, 牙鲆腎、鰓等免疫組織及離體巨噬細胞Arg-Ⅱ基因已被證實響應遲緩愛德華氏菌感染[40]。線粒體翻譯延伸因子(Tu translation elongation factor, TUFM), 是一種線粒體蛋白, 主要參與機體抗病毒信號通路的調控, 青魚TUFM基因在LPS刺激后出現(xiàn)顯著上調[41]。在細菌感染后, 補體[23,42]、抗菌肽[23,43]和模式識別受體[18,19,22,42,44]等先天性免疫基因的表達上調已在多種魚類中被證實, 說明先天性免疫是魚類抗細菌感染的普遍應答反應。

細菌感染早期往往會引起魚類IL-1β和IL-8等炎性因子的表達上調[18,19,22], 然而張恒澤等[45]研究發(fā)現(xiàn)大黃魚脾臟IL-1β在假單胞菌活疫苗免疫后的早期出現(xiàn)下調, 在7d后上調。本研究也發(fā)現(xiàn)頭腎組織中IL-8的表達水平在溶藻弧菌感染24h后顯著下調。熱休克蛋白(Heat shock protein, HSP)是典型的應激蛋白, 然而魚類HSP70已被證實可以增強機體的抗氧化能力, 抑制氧自由基的生成, 發(fā)揮對炎癥損傷機體的保護作用[46]。在本實驗中,HSP70基因(hspa4、hspa5和hspa9)在溶藻弧菌感染后的高表達可能是導致炎性因子IL-8表達下調的原因之一。這與高溫脅迫下大黃魚肝臟蛋白組學中的研究結果是吻合的[47]。

3.2 溶藻弧菌感染對大黃魚獲得性免疫的影響

獲得性免疫系統(tǒng)通過特異性受體(如TCR)識別來自病原體的特定抗原[48]。TCR位于T細胞表面,多由α和β兩條鏈組成, 直接參與T細胞對抗原的識別[49]。CD3是TCR的輔助受體, 哺乳動物CD3包括γ、δ、ε和ζ四個亞基, 而硬骨魚類CD3包括ε、ζ和γδ(哺乳動物CD3γ和CD3δ的前身)三個亞基[50]。ZAP-70參與T細胞免疫應答, 被活化的TCR招募后激活下游信號轉導途徑[51]。ITK屬于Tec家族非受體酪氨酸激酶, 是TCR下游的關鍵信號介質[52], 參與調節(jié)T細胞以及CD4+T細胞的分化[53]。本文結果顯示, 在注射溶藻弧菌24h后, 大黃魚TCR信號通路上的許多基因, 如TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3γδ、CD3ζ、ZAP-70和ITK等均顯著下調, 說明該通路被抑制。這與本團隊前期用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[22]和變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)[23]感染大黃魚后脾臟中TCR信號通路受到抑制的結果是一致的。

FcR5是一種B細胞應答抗原的調節(jié)蛋白, 可以促進B細胞增殖[54]。趨化因子CCL17能夠促進T細胞的發(fā)育, 并參與成熟T細胞的轉運和激活[55]。在本試驗中, 溶藻弧菌感染組大黃魚FcR5和CCL17的表達量都顯著下調。同時, KEGG富集分析結果顯示, 造血細胞譜系(Hematopoietic cell lineage)中大部分DEGs顯著下調, 也驗證了T、B細胞的增殖分化受到抑制?？梢? 注射溶藻弧菌24h后大黃魚特異性免疫細胞的增殖受到抑制。由于機體適應性免疫的激活較晚, 在感染早期阻斷TCR途徑、抑制特異性免疫細胞的增殖發(fā)育, 可能為先天免疫節(jié)省足夠的能量, 有利于魚類抗病原感染的免疫應答。

此外, 溶藻弧菌感染后大黃魚頭腎血紅蛋白亞基基因(HBA1、HBAA、HBAD和HBB2)表達水平均顯著下調。血紅蛋白是紅細胞內運輸氧氣的特殊蛋白質, 是一個由兩個α鏈(HBA)和兩個β鏈(HBB)組成的四聚體[56]。血紅蛋白亞基表達水平的下降會直接影響血紅蛋白。含量從而影響紅細胞的攜氧能力。同時, GO富集分析顯示, 與需氧代謝有關的氧結合(Oxygen binding)和氧載體活性(Oxygen carrier activity)也發(fā)生極顯著富集, 且其中的DEGs在感染組中均顯著下調。該結果顯示, 在溶藻弧菌感染后, 大黃魚血液的氧傳輸能力下降, 可能跟該菌的溶血活性有關[57], 但具體機制有待進一步闡明。

綜上所述, 本研究分析了溶藻弧菌感染后24h大黃魚頭腎轉錄組的變化, 結果顯示, 大黃魚補體、熱激蛋白、抗菌肽和甘露糖受體等一些先天性免疫相關基因的表達水平均顯著上調, 而TCR信號通路、特異性免疫細胞增殖發(fā)育等相關基因表達水平出現(xiàn)下調?？梢娫谌茉寤【腥驹缙? 大黃魚的先天性免疫被激活、獲得性免疫被抑制。本文結果表明, 先天性免疫在大黃魚抗溶藻弧菌早期感染中發(fā)揮重要作用。