王文博 曹 娟 李春穎 孫盛雁 黃雨瑩 劉屹楠 魯義善

(1.咸陽師范學院生命科學系, 咸陽 712000; 2.中國科學院水生生物研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室,武漢 430072; 3.中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072;4.廣東海洋大學水產(chǎn)學院, 湛江 524088)

中國大鯢(Andrias davidianus)是國家二級重點保護物種, 野生大鯢多棲息在山區(qū)溪流里, 喜穴居,怕光怕聲, 以魚蟹等水生動物為食, 在陜西秦嶺山區(qū)分布較多[1]。現(xiàn)存于世的大鯢有3個種, 分別是中國大鯢(A.davidianus)、美國大鯢(Cryptobranchus alleganiensis)和日本大鯢(A.japonicus)[2]。后兩者在當?shù)責o論野生種還是養(yǎng)殖種均不能買賣, 只能進行保護, 因此沒有形成人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè), 而中國大鯢允許人工繁殖的子二代進行交易, 已具備一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。然而, 在養(yǎng)殖過程中由于病害的發(fā)生, 給養(yǎng)殖者帶來了慘重的經(jīng)濟損失, 其中, 由嗜水氣單胞菌引發(fā)的大鯢敗血癥是常見病害之一[3,4]。嗜水氣單胞菌是常見的水生細菌, 自然水體中多有存在,但通常情況下并不會引起疾病, 只有當水生動物免疫力下降, 其才有可能通過消化道或者皮膚傷口感染機體, 引發(fā)敗血癥[4]。

因此, 如果能增強大鯢免疫細胞及免疫分子的活性, 提高其自身免疫力, 就可有效阻斷嗜水氣單胞菌的感染途徑, 降低敗血癥的發(fā)病概率。中草藥在我國資源豐富, 成本低廉, 且比較環(huán)保, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了越來越多的應用[5]。除了亞洲國家, 歐美國家也有用草藥成功控制魚蝦病害的報道[6,7]。然而, 在以上研究中, 中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用方法多為生藥直接投喂, 沒有對免疫活性成分進行提取、濃縮。來自家禽養(yǎng)殖業(yè)的報道認為, 甘草對機體具有免疫調節(jié)作用[8], 但尚未發(fā)現(xiàn)甘草對兩棲動物大鯢抗敗血癥能力影響的報道。本研究對甘草有效成分進行針對性提取后開展了這方面探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘草(Glycyrrhiza uralensisFiseh)購自甘肅省武威市, 采用其根部切成圓片后提取有效成分。大鯢(Andrias davidianus)購自陜西省漢中市大鯢人工養(yǎng)殖場, 平均體重為(248.05±3.07)g。實驗前在持續(xù)流動的山泉水養(yǎng)殖池中馴養(yǎng)1周, 投喂雜魚及配合飼料。溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)購自道生試劑公司(陜西西安)。

1.2 藥餌的制備

采用水提醇沉法提取工藝對甘草多糖及甙類化合物進行粗提[9]。甘草切片置10倍量95%酒精中, 60℃回流醇洗, 除雜。酒精廢液60℃旋轉蒸發(fā),回收。藥渣經(jīng)蒸餾水浸提, 過慮, 棄藥渣。水提液加乙醇以4000 r/min離心沉淀20min, 棄上清, 將離心所得浸膏蒸干, 研磨成粉, 4℃?zhèn)浯?。將甘草粗提粉?.5%和2%的質量分數(shù)與基礎粉料混和, 制成顆粒餌料。其中, 基礎粉料配比(占干物質%)為魚粉30%、魚油10%、豆粕20%、淀粉20%、麩皮15%、無機鹽預混料4.5%和維生素預混料0.5%。

1.3 分組及采樣

同源同批大鯢被隨機分配到3個水泥池(每個容積約300 L)中, 分別為對照組、低劑量組和高劑量組。每個池50尾大鯢, 中間用隔板隔開, 用于平行實驗, 均避光處理。對照組投喂無藥餌料, 低劑量組投喂0.5%甘草餌料, 高劑量組投喂2%甘草餌料。

分別在投喂后第14、第28、第35、第42和第56天采樣, 每次每池取10尾。對照組在實驗之前(0d)采樣。采樣時, 先稱量體重, 之后用一次性醫(yī)用注射器于尾靜脈抽血, 最后取脾臟稱重。

1.4 免疫學檢測

血清溶菌酶活性按Parry所述方法[10]進行。5 μL新鮮血清加入3 mL菌液中, 測定波長為540 nm。以1min內(nèi)吸光值下降0.001為一個活性單位(U)。

腎臟巨噬細胞的吞噬活性腎臟巨噬細胞懸液按Secombes方法制備[11]。菌懸液按Thompson方法制備[12], 所不同的是菌株為嗜水氣單胞菌, 而非A.salmonicidaMT004。操作方法按Rafiq等[13]所述。顯微鏡下觀察計數(shù)200個巨噬細胞中吞噬嗜水氣單胞菌的細胞數(shù), 按下式求出吞噬百分率:

吞噬百分率(Phagocytic Percent, %)＝(吞噬細菌的巨噬細胞數(shù)/200)×100%

白細胞比容將采集的血液樣本裝于肝素化的醫(yī)用白細胞壓積管中, 22℃ 2000 r/min 離心30min, 小心將壓積管取出, 用游標卡尺測量白細胞壓積的高度占全長的百分比, 即為白細胞比容(Leucocrit)。

脾臟臟器系數(shù)先對大鯢稱量體重, 摘取脾臟, 用生理鹽水稍加沖洗, 吸水紙吸干表面水分, 立即在電子稱上秤重。脾臟重量與體重之比即為脾臟臟器系數(shù)(Spleen weight index)。

人工感染實驗將兩次活化后的嗜水氣單胞菌用0.5%的生理鹽水洗脫菌苔, 先進行倍比稀釋進行預實驗, 選擇能顯示出組間差異的濃度, 用分光光度計精確調配, 確定終濃度為3×106CFUs/mL。在最后一次采樣后, 每尾腹腔注射5 mL, 觀察1周,統(tǒng)計死亡率和免疫保護率。死亡率(Mortality rate)=(死亡尾數(shù)/受試尾數(shù))×100%; 免疫保護率(Relative percent survival, %)=(1–免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%。

1.5 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(X±SD), 學生t檢驗(Student’st-test)對結果進行分析, 當P<0.05時認為有顯著差異, 當P<0.01時認為有極顯著差異。

2 結果

2.1 血清溶菌酶活性測定結果

如圖1所示, 從28d開始, 藥物組先升后降, 呈拋物線趨勢, 低劑量組在42d出現(xiàn)最大值(158.4±34.7)U/mL, 高劑量組在35d出現(xiàn)最大值(178.3±28.8)U/mL,兩者都顯著高于同期對照組(P<0.05)。

圖1 投喂甘草提取物對大鯢血清溶菌酶活性的影響Fig.1 Effect of feeding of G.uralensis Fiseh extract on lysozyme activity in A.davidianus serum

2.2 吞噬實驗結果

如表1所示, 藥物組在最后兩次采樣期, 即42d和56d時, 吞噬活性顯著高于對照組(P<0.05)。低劑量組和高劑量組最大值均出現(xiàn)在42d, 分別為(59.4±8.5)%和(58.4±5.2)%。

表1 投喂甘草提取物對大鯢腎臟巨噬細胞吞噬活性的影響Tab.1 Effect of feeding of G.uralensis Fiseh extract on phagocytic activity of macrophages in A.davidianus kidney

2.3 壓積實驗結果

與同期相比, 藥物組白細胞比容值均高于對照組(表2)。其中, 高劑量組在28d時白細胞比容值為(5.8±1.7)%, 低劑量組在56d時為(5.5±0.8)%, 高劑量組在56d時為(5.9±1.7)%, 三者都顯著高于同期對照組(P<0.05)。

表2 投喂甘草提取物對大鯢白細胞比容的影響Tab.2 Effect of feeding of G.uralensis Fiseh extract on leucocrit value of A.davidianus

2.4 脾臟臟器系數(shù)測定結果

如表3所示, 藥物組和對照組的脾臟臟器系數(shù)之間沒有顯示出顯著差異。

表3 投喂甘草提取物對大鯢脾臟臟器系數(shù)的影響Tab.3 Effect of feeding of G.uralensis Fiseh extract on spleen weight index of A.davidianus

2.5 攻毒實驗結果

如表4所示, 最后一次采樣(56d)后人工感染嗜水氣單胞菌, 對照組死亡率為90%, 低劑量組和高劑量組都為60%, 均低于對照組, 而藥物組免疫保護率為33.3%, 也都高于對照組。

表4 投喂甘草提取物對大鯢感染嗜水氣單胞菌后死亡率的影響Tab.4 Effect of feeding of G.uralensis Fiseh extract on mortality rate of A.davidianus induced by A.hydrophila infection

3 討論

大鯢病害病原主要有病毒、細菌和寄生蟲, 如虹彩病毒(A.davidianus iridovirus)可致大鯢大腳病,嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)可致大鯢敗血癥, 復口吸蟲(Diplostomulum hupehensis)可致大鯢白內(nèi)障[14]。其中, 嗜水氣單胞菌是最為常見的水生機會致病菌,具有普遍性, 因此本研究用它進行攻毒試驗。嗜水氣單胞菌屬弧菌科(Vibrionaceae)、氣單胞菌屬(Aeromonas), 是一類能運動的氣單胞菌[15], 能引起多種水生動物的敗血癥, 其中也包括大鯢[16]。嗜水氣單胞菌可通過皮膚和腸道入侵機體, 定植于皮膚及腸道細胞, 然后大量繁殖, 吸取宿主營養(yǎng), 致使機體抵抗力下降。嗜水氣單胞菌的致病性和它的毒力基因密切相關。研究表明, 嗜水氣單胞菌的溶血素、外膜蛋白及絲氨酸蛋白酶等都是重要的毒力基因[17]。嗜水氣單胞菌一經(jīng)進入機體, 就會在不同的組織細胞內(nèi)定植、增殖后產(chǎn)生外毒素, 在各種毒力因子的作用下, 對大鯢機體造成損傷。受感染的病鯢通常表現(xiàn)為體表黏液增多, 肝臟、腎臟、胰臟和肺出現(xiàn)腫大, 肌肉、腸道和胃等均出現(xiàn)不同程度的充血和出血, 腹部脹大且有積水, 并伴隨溶血[18],嚴重影響大鯢的能量代謝, 破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài), 降低大鯢的免疫能力, 最終造成其死亡。因此, 嗜水氣單胞菌是大鯢養(yǎng)殖過程中重要的致病菌, 危害極大,急需找到有效的防治手段。

非特異性免疫反應也稱為先天性免疫反應, 是機體抵抗病原體攻擊的第一道防線, 在預防感染和激活特異性免疫反應方面起著至關重要的作用。當病原體入侵機體時, 它們將面對一系列免疫細胞和免疫分子, 這些細胞和分子相互作用并啟動炎癥反應。其中, 免疫細胞包括單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、非特異性細胞毒性細胞、自然殺傷細胞和肥大細胞等。免疫分子包括溶菌酶、補體、轉鐵蛋白、干擾素、抗蛋白酶和C反應蛋白等[19]。血清溶菌酶活性、巨噬細胞吞噬活性、白細胞比容、脾臟臟器系數(shù)等指標是檢測機體免疫機能, 尤其是非特異性免疫機能較為典型的指標[9], 涉及免疫因子、免疫細胞和免疫器官三個層面, 人工感染實驗是對最終免疫保護效果的驗證, 因此本研究所選指標具有代表性。溶菌酶大量存在于魚類的血清和黏液中, 通過破壞革蘭氏陽性和陰性菌的細胞壁, 導致其溶解從而發(fā)揮殺菌作用。血清溶菌酶活性被認為是評估各種免疫增強劑的免疫效果的重要標志之一[20]。有研究表明[21], 在中華鱉(Peiodiscus sinesis)稚鱉飼料中添加甘草素, 不僅提高了中華鱉血液溶菌酶活性和白細胞吞噬活性, 從而促進了其免疫應答水平, 還改善了肝功能, 增強了抗嗜水氣單胞菌感染的能力, 對生長也有一定的促進作用。這與本實驗中甘草對大鯢的作用結果大致相同。在本實驗中, 甘草在一定程度上提高了大鯢血清溶菌酶活性、白細胞數(shù)量及對嗜水氣單胞菌的免疫保護率, 但是對免疫器官脾臟沒有顯示出明顯的促進作用。類似的報道還有, 中藥醇提液通過調節(jié) S1、ATPase-β、isocitrate lyase 和 NSE 這 4 種代謝酶的表達而抑制了嗜水氣單胞菌的生長, 為中藥作為飼料添加劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了理論依據(jù)[22]。同樣, 甘草作為飼料添加劑也提高了羅非魚(Oreochromis niloticus)溶菌酶活性和抗體水平, 提高了對嗜水氣單胞菌感染的抗性, 使其致死率降低,表明甘草對提高魚的免疫應答有一定作用[23]。此外, 甘草可與包括單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞在內(nèi)的免疫細胞相互作用, 以增強機體的先天免疫, 并可通過增加白細胞計數(shù)來增強非特異性免疫力[23], 這些都與本實驗結果相吻合。然而, 需要指出的是, 和其他中藥材一樣, 甘草在水產(chǎn)實踐上的應用也存在一些問題, 比如藥材質量不穩(wěn)定、使用方法粗放、規(guī)范化藥方少及命名和描述不準確等, 因此, 應當盡早健全和規(guī)范其質量標準,使用方法精細化, 加強精方和專方的研制, 規(guī)范水產(chǎn)應用術語[5]。

蛋白質是構成生命的物質基礎, 參與幾乎所有的生命活動。而蛋白質的產(chǎn)生是由遺傳物質DNA或RNA指導的, 它們具有一定的穩(wěn)定性, 通過控制蛋白質的合成來控制機體的生命代謝活動, 包括生長、發(fā)育、遺傳與變異等生命過程。因此, 中草藥可通過影響菌體DNA的自我復制, 來間接影響著蛋白質的合成, 最終使菌體生長受到抑制[24]。另一方面, 在機體的非特異性免疫防御功能方面, 溶菌酶、白細胞和巨噬細胞都是極其重要的免疫分子和免疫細胞, 它們都可通過溶解或者吞噬外來病原菌, 從而起到殺傷作用, 有效保護機體。那么, 在本實驗中, 甘草提高了大鯢受嗜水氣單胞菌感染后的存活率, 同時, 大鯢血清溶菌酶活性、白細胞數(shù)量和巨噬細胞吞噬活性都有所升高, 它們之間是否存在關聯(lián)? 大鯢存活率的提高是由于這幾項指標的提高造成的還是由于前面所說, 中草藥影響了菌體的DNA的合成從而影響了菌體蛋白的合成而造成的? 這些問題還有待進一步研究。