史蘭琴，孟 鳳，任慧慧

山西省太原市動物防疫檢疫中心，太原 030027

硝基呋喃類藥物是一類人工合成抗菌藥，其產(chǎn)生是在呋喃環(huán)的5 號位上引入硝基，再在呋喃環(huán)的2 號位引入其他基團所組成的一類藥物，有著這一結(jié)構(gòu)的藥物統(tǒng)稱為硝基呋喃類藥物。常用的四大硝基呋喃類藥物為呋喃它酮（FTD）、呋喃唑酮（FZD）、呋喃西林（NFZ）和呋喃妥因（NFT）。低濃度硝基呋喃類藥物對大多數(shù)真菌、部分革蘭氏菌和原蟲都有著很好的抑菌作用，高濃度有滅殺作用[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物存在著強烈的生物毒性，其本體和代謝產(chǎn)物對人類均具有致癌、致畸、致突變的副作用[4]。但由于該藥物的成本低及抗菌效果好，使用起來相比其他抗菌藥性價比更高，我國在禁止該藥物后仍然還有人或組織在銷售或使用此類藥物。

目前，檢測硝基呋喃類藥物殘留的技術(shù)較多，如超高效液相色譜（UPLC）、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、免疫層析技術(shù)（ICA）和熒光免疫分析法（FIA）等。其中，主要使用的方法是超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，已用于測定不同樣品基質(zhì)中硝基呋喃類藥物。本文建立了豬肉中常見4 種硝基呋喃類藥物殘留的分析方法，優(yōu)化了提取條件和檢測方法，回收率、定量限等參數(shù)能夠滿足現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)的要求，可快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測豬肉中硝基呋喃類藥物殘留。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試劑。甲醇、醋酸銨、甲酸、乙酸乙酯、乙腈和正己烷均購自德國Merck 公司；磷酸二氫鉀、三氯乙酸均購自北京曼哈格生物科技有限公司。二甲基亞砜、2-硝基苯甲醛、購自美國SIGMA 公司；硝基呋喃類藥物4 種代謝物AMOZ、SEM、AHD、AOZ 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)品純度均不低于99%，購自韓國德山藥品工業(yè)（株），其對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)購自德國Dr.Ehrensorfer 公司。

2）儀器與設(shè)備。ACQUITYUPLCI-ClassPLUS 超高效液相色譜儀串聯(lián)XevoTQ-Smicro 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；電子天平ML204T/02（梅特勒-托利多儀器）；Milli-QAcademic 超純水器（蘇州賽恩斯儀器）；ortex-2 實驗室小型渦旋混勻儀（上海葉拓科技）；B1020 臺式PH 分析儀（得利特北京科技有限公司）；AYAN-30L1 氮氣發(fā)生器（上海秉越電子儀器）；M1324R 微量高速冷凍離心機（瑞沃德生命科技）；VP 手動單通道移液器（艾斯瑪特儀器貿(mào)易）；HD-SYC 水浴恒溫振蕩器（湖南昊德儀器設(shè)備）。

1.2 試驗方法

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液：100 μg/mL，精準(zhǔn)稱取AMOZ、SEM、AHD、AOZ 各10 mg（精確到0.000 1 g）于4 個100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，超聲溶解，于4 ℃可以保存6 個月。硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：10 μg/mL，精密量取100 μg/mL 的4 種硝基呋喃類藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液各10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線。于4 ℃可以保存6 個月。

混合內(nèi)標(biāo)儲備液的配制：精準(zhǔn)稱取4 種內(nèi)標(biāo)物各0.10 g，分別用甲醇溶解并定容至1 000 mL 的棕色容量瓶中制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的混合儲備液。于-18 ℃下密封、避光保存，保質(zhì)期1 個月，使用時按照需求濃度稀釋。2-硝基苯甲醛溶液：精準(zhǔn)稱取7.56 g 2-硝基苯甲醛溶于二甲基亞砜中，定容到50 mL，制成后的濃度為0.1 mol/L。

硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液于6 個10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成硝基呋喃類藥物含量為1、5、10、50、100 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液；根據(jù)最終的上機質(zhì)量濃度（10 ng/mL）添加混合內(nèi)標(biāo)工作液。

2）樣品前處理。取約200 g 的市場豬肉放入組織搗實機充分粉碎后攪勻，精準(zhǔn)稱取2.0 g（精確到0.01 g）裝入50 mL 聚丙烯離心管，剩下部分裝入聚乙烯瓶中于-18 ℃冷凍保存。在離心管中加入10 mL 體積比為1∶1 的甲醇-水溶液，渦旋振蕩5 min，然后再放入離心機以5 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去液體。在離心管中依次加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/mL）、150 μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.1 mol/L）、10 mL 10%三氯乙酸溶液，渦旋振蕩5 min，置于37 ℃水浴恒溫振蕩器中避光衍生化反應(yīng)16 h。衍生化反應(yīng)完成后，取出離心管，先用1 mol/L 的磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)溶液pH 至7.0～8.0，再加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩5 min 后放入離心機10 000 r/min 離心2 min，收集乙酸乙酯層，殘留物用10 mL 乙酸乙酯重復(fù)上述步驟再提取1 次，合并2 次收集的乙酸乙酯層于氮氣發(fā)生器45 ℃吹干。吹干后的殘渣加入1 mL 醋酸銨溶液（濃度與初始流動相相同）充分溶解，再用1 mL 乙腈飽和的正己烷液液萃取除脂，棄去上層正己烷層，下層液體過0.22 μm 濾膜后待測。

3）試驗條件。色譜條件：色譜柱為ACQUITYUPLCCSHC18 色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）；流動相A 為乙腈，B 為0.1%的甲酸和0.5 mmol/mL醋酸銨混合水溶液；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為0.25 mL/min；采用梯度洗脫程序0～2.00 min，5%～50% A；2.01～3.00 min，50%～90% A；3.01～3.20 min，90%～5% A；3.21～4.50 min，5% A。

質(zhì)譜條件：在本試驗中離子源使用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電離電壓：5.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣：30 psi，流速10 L/min；霧化氣：35 psi，流速10 L/min；輔助氣：55 psi，流速10 L/min；碰撞氣：氬氣（純度大于99.9%），流量：270 kp；質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 4 種硝基呋喃代謝物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

1）樣品洗滌。研究發(fā)現(xiàn)呋喃西林的代謝物氣基脈（SEM）產(chǎn)生的機制復(fù)雜，來源多樣，所以檢出SEM 不一定全部是藥物濫用造成的，有可能是試驗試劑污染、次氯酸鈉消毒的副產(chǎn)物及膠帶等方式污染的豬肉。而這些污染一般以游離態(tài)的形式存在，故試驗時應(yīng)先用甲醇-水溶液洗滌樣品，去除游離態(tài)的SEM，使僅能檢測到與蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合態(tài)代謝物，本研究使用體積比為1∶1 的甲醇-水溶液效果較好。

2）水解與衍生化。硝基呋喃類在動物身體內(nèi)的代謝過程快速、半衰期較短，而代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的結(jié)合物化學(xué)性質(zhì)也比較穩(wěn)定，可以通過蛋白有機結(jié)合物的形態(tài)在動物體內(nèi)較長時間存在，所以很難直接檢測到這類藥品的原藥化合物。該蛋白結(jié)合物在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下能夠釋放出代謝物，故試驗中一般測定其代謝物濃度來反映硝基呋喃類藥物的殘留。硝基呋喃類藥物的代謝物SEM、AOZ、AHD、AMOZ 為小分子化合物，相對分子質(zhì)量較小，用質(zhì)譜儀直接檢測其代謝物會因為特征離子少、背景干擾大而不能達(dá)到檢測需求靈敏度，無法精準(zhǔn)定性與定量分析。研究發(fā)現(xiàn)，可以用2-硝基苯甲醛與代謝物發(fā)生衍生化反應(yīng)（過程見圖1），增加其相對分子質(zhì)量，再對衍生物進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析。本次衍生化反應(yīng)將鹽酸替換成10%的三氯乙酸，其優(yōu)點是不僅能提供酸性環(huán)境讓代謝物與2-硝基苯甲醛發(fā)生衍生化反應(yīng)，還能更有效地除去樣品中的蛋白質(zhì)以減少干擾。硝基呋喃代謝物檢測一般要求水解衍生化后將pH 調(diào)節(jié)至7.0～7.5，查閱資料后發(fā)現(xiàn)，pH 在7.5～8.0的回收率和pH 在7.0～7.5 的回收率沒有明顯差別[5]，故將pH 范圍擴大至7.0～8.0 更方便試驗操作。

圖1 硝基呋喃類藥物代謝物的水解和衍生化過程

3）提取次數(shù)對回收率的影響。在處理硝基呋喃類代謝物時，使用乙酸乙酯對樣品萃取的次數(shù)對回收率產(chǎn)生了較大的影響，次數(shù)過少會使代謝物提取不充分，過多則費時費力。采取合適的提取次數(shù)可以簡便試驗的操作過程，節(jié)約試劑和時間，提升試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)為3 次時可得最佳回收率。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將處理好的標(biāo)準(zhǔn)工作液上機進(jìn)行測定，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為各定量離子的離子質(zhì)量色譜峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，橫坐標(biāo)為對照溶液的濃度。4 種代謝物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。根據(jù)回歸方程和相關(guān)系數(shù)分析，4 種硝基呋喃類代謝物在1～100 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，4種代謝物的檢測下限均為0.3 μg/kg。

表2 4 種硝基呋喃代謝物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率和精密度

1.0、2.0、5.0 μg/kg 添加硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，再按照最終質(zhì)量濃度10 ng/mL 添加混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，得到的平均回收率和RSD（n=6）如表3 所示。說明使用上述試驗方法檢測硝基呋喃類藥物殘留方法具備良好的可行性。

表3 4 種硝基呋喃代謝物的回收率與精密度

3 結(jié) 論

本研究使用的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，除去蛋白質(zhì)的脂肪效果較好，減少了測定過程中的雜物干擾，在代謝物質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL 時有良好的線性關(guān)系，檢測下限均為0.3 μg/mL，平均回收率為91.0%～117.8%，RSD 為2.9%～7.3%，均滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求。本方法還具有操作簡便、成本小、回收率高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，適用于市場豬肉中硝基呋喃類藥物殘留的檢測。