羊 青，王茂媛，王清隆，李英英，晏小霞，王祝年*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?571101；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶農(nóng)業(yè)野生植物基因資源鑒定評價(jià)中心，海南 儋州 571737；3.海南省熱帶藥用植物工程研究中心，海南 儋州 571737)

苦木科植物常具有特殊的化學(xué)成分和優(yōu)異的生物活性，如苦木、鴉膽子、牛筋果、臭椿等植物中含有苦木素類、生物堿類、色原酮類、聚酮類、萜類、甾醇等多種成分，具有抗瘧疾、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗病毒、抗菌、降血糖、抗氧化和昆蟲拒食活性等多種藥理活性[1-11]，具有良好的治療效果，苦木科植物的藥用價(jià)值值得關(guān)注。海人樹(SurianamaritimaLinnaeus)為苦木科(Simaroubaceae)海人樹屬(SurianaLinn.)常綠灌木或小喬木[12]，分布于印度、印度尼西亞、菲律賓、太平洋島嶼以及我國的臺灣及西沙群島等地，生于海島邊緣的沙地或石縫中。目前關(guān)于海人樹的研究較少，國外對海人樹化學(xué)成分進(jìn)行研究的報(bào)道僅有兩篇文獻(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)海人樹中含有蘆丁、木質(zhì)素、烷烴類、谷甾醇、黃酮醇苷等成分[13-14]，國內(nèi)僅本項(xiàng)目組報(bào)道過海人樹莖的化學(xué)成分，并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究[15]。為更全面地了解海人樹的藥用價(jià)值，本文將對海人樹葉的化學(xué)成分和抗氧化活性進(jìn)行分析。

近年來，超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)已廣泛應(yīng)用于中藥研究，可在缺少對照品的情況下對成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，具有高效、快速且靈敏度高的特點(diǎn)。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對海人樹葉提取物進(jìn)行分析，根據(jù)色譜峰在質(zhì)譜中的精確相對分子質(zhì)量、碎片離子信息、質(zhì)譜裂解規(guī)律和色譜保留規(guī)律，并結(jié)合對照品的質(zhì)譜信息和參考文獻(xiàn)，鑒定化合物結(jié)構(gòu)，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供參考；并采用DPPH法和ABTS法對海人樹葉提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，為資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本實(shí)驗(yàn)中所用樣品由作者于2018年6月采自西沙群島，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為苦木科海人樹屬植物海人樹。

1.1.2 儀器與試劑 Xevo G2-XS QTof液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)；Secura513-1CN精密天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q超純水儀(德國Merck Millipore公司)；Centrifuge 5810R臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，純度≥99.99%)美國Fisher公司；甲酸(色譜純)，德國Merck Millipore公司；乙醇(色譜純)，美國Sigma公司；氫氧化鈉(分析純)，美國Sigma公司；亮氨酸腦啡肽(Standards Kit for Tof G2-S)，美國Waters公司；超純水由Milli-Q超純水儀制備，其他試劑均為分析純。DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，美國Sigma公司)；ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，北京索萊寶科技有限公司)；過硫酸鉀(K2S2O8)、乙醇為分析純，購自上海國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 原材料干燥后粉碎過80目篩，精確稱取一定量樣品，用95%乙醇水溶液回流提取1 h。將提取液冷凍離心10 min(12 000 r/min，10 ℃)，取上清液過Waters HLB固相微萃取柱，分別用5%和95%甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集95%甲醇洗脫液，過0.2 μm微孔濾膜，保存于冰箱備用(4 ℃)。

1.2.2 UPLC-Q-TOF-MS檢測方法[15](1)UPLC條件。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3，流速為0.3 mL/min；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.01%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，1%～10% B；2～4 min，10%～15% B；4～8 min，15%～20% B；8～11 min，20%～45% B；11～12 min，45%～65% B；12～15 min，65%～99% B；15～19 min，99%～99% B；19～20 min，99%～1% B；20～23 min，1%～1% B)。進(jìn)樣體積1μL，柱溫40 ℃。

(2)MS檢測條件。電噴霧離子源(ESI)在正(+)、負(fù)離子(-)條件下，Continuum模式，采集MSE數(shù)據(jù)。掃描范圍：質(zhì)荷比(m/z)50～1200，掃描時(shí)間：0.2 s，檢測時(shí)間：20 min。低能量碰撞電壓(CE)：6 V，高能量碰撞電壓：20～60 V；正離子模式的毛細(xì)管電壓分別為3.0 kV，負(fù)離子模式的毛細(xì)管電壓為2.0 kV，錐孔電壓：40 V，離子源溫度：100 ℃，輔助噴霧電離與去溶劑氣體：N2，去溶劑化溫度：450 ℃，錐孔氣流量：0.83 L/min，去溶劑化氣體流量10 L/min。校正液為200 pg/μL亮氨酸腦啡肽，0.5 mmol/L甲酸鈉(Sodium-formate)。

(3)數(shù)據(jù)采集和處理。采用Masslynx V4.1、TCM Chiese[UNIFI1.7]、ChemSpider軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 抗氧化活性測試 (1)DPPH自由基的清除能力。參照文獻(xiàn)[16]方法測定海人樹葉提取物對DPPH自由基的清除能力，簡述如下：用無水乙醇將海人樹葉提取物配制成不同濃度梯度，分別取0.05 mL 不同濃度樣品溶液加入2.95 mL DPPH溶液(6.5×10-5mol/L)中，避光反應(yīng)后在517 nm波長下測定其吸光度值(Ai)；在2.95 mL DPPH溶液中加入0.05 mL無水乙醇為空白對照測定吸光度值(Ao)；在2.95 mL無水乙醇中加入0.05 mL供試樣品溶液測定吸光度值(Aj)；抗壞血酸為陽性對照。每組樣品重復(fù)測試3次，以平均值代入下式計(jì)算DPPH清除率：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100，計(jì)算出DPPH清除率達(dá)50%時(shí)的樣品濃度，即半數(shù)清除率(IC50)。

(2)ABTS自由基的清除能力。參考文獻(xiàn)[17]方法測定海人樹葉提取物對ABTS自由基的清除能力。將7 mmol/L ABTS 與2.45 mmol/L K2S2O8溶液按1∶1的體積比混勻，暗處反應(yīng)16 h后用乙醇將其稀釋至波長734 nm處吸光值為(0.70±0.02)，制備得到ABTS+·溶液。分別取50 μL不同濃度的海人樹葉提取物加入2.95 mL ABTS+·溶液中，混勻反應(yīng)6 min并測其吸光值(Ax)；將50 μL乙醇與2.95 mL 的ABTS+·溶液混合均勻后測定吸光值(A0)；50 μL不同濃度海人樹葉提取物與2.95 mL乙醇溶液混合后測定吸光值(Ay)。每組樣品重復(fù)測試3次，以平均值按下列公式計(jì)算清除率：清除率(%)=[1-(Ax-Ay)/A0]×100[17]，計(jì)算出ABTS清除率達(dá)50%時(shí)的樣品濃度(IC50)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 海人樹葉提取物的化學(xué)成分分析

海人樹葉中富含大量的葉綠素類成分，且化合物的極性會相對較小。因此，本材料首先在提取物時(shí)優(yōu)先選擇能夠大量提取植物葉類成分的95%乙醇，并且進(jìn)行回流提取，在80 ℃沸騰的提取溫度下，進(jìn)行索氏提取，充分將植物葉片中的化學(xué)物質(zhì)全部提取出來。經(jīng)過減壓蒸除乙醇后，提取物呈現(xiàn)出深綠色。因材料中含有大量的葉綠色和葉黃素類成分，因此必須進(jìn)行前處理，使得葉綠色和葉黃素能夠很好地保留在柱子上而不被洗脫下來，才能夠進(jìn)行液質(zhì)分析。通過對比Waters公司的Oasis系列固相萃取柱，最后優(yōu)選HLB柱進(jìn)行提取液的前處理，可以有效吸附葉黃素類成分，而對于其他的次生代謝物質(zhì)不吸附，這樣可以最大可能地保留有效化學(xué)物質(zhì)，從而剔除掉色素雜質(zhì)對化學(xué)成分的干擾和對液質(zhì)柱子的影響。通過UPLC-Q-TOF-MS對供試樣品化學(xué)成分的定性分析，采用電噴霧離子源(ESI)，在正負(fù)離子模式下掃描采集數(shù)據(jù)，其中(-)ESI-MS質(zhì)譜總離子流圖(TIC)的分離度較好，響應(yīng)較高，如圖1所示。因此，以負(fù)離子數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI 對海人樹葉提取物進(jìn)行分析，最終從該材料的液質(zhì)數(shù)據(jù)中分析收集得到400多個(gè)響應(yīng)值超過1×105的化合物，通過文獻(xiàn)檢索、裂解規(guī)律分析、化學(xué)結(jié)構(gòu)推斷、誤差值計(jì)算、匹配度對比等進(jìn)行詳細(xì)的化學(xué)成分鑒定，結(jié)果見表1，結(jié)構(gòu)圖見圖2。

根據(jù)質(zhì)譜給出的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜碎片，誤差范圍±6 ppm左右，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及在線數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果推斷，鑒定了海人樹葉提取物中的45個(gè)化學(xué)成分，其中包括21個(gè)黃酮類化合物(6，9，15，16，17，19，20，23，25，26，27，28，29，30，31，34，35，36，38，39，40)，1個(gè)花青素類成分(5)，9個(gè)酚酸類成分(1，7，10，12，14，18，22，24，42)，3個(gè)苯丙素類成分(4，8，32)，1個(gè)環(huán)烯醚萜類成分(21)，10個(gè)長鏈脂肪酸類化合物(2，3，11，33，37，41，43，44，45，46)。研究結(jié)果表明，該材料的主要成分為黃酮和酚酸類成分。該材料的成分特征性非常強(qiáng)，其中黃酮類成分占到半數(shù)以上，黃酮類成分是天然的抗氧化劑，具有抗炎、抗菌、抗病毒的生物活性，常用于治療心腦血管疾病，具有抗心律失常、降壓、降血脂等作用[18]，且該材料為葉類成分，非常適宜于進(jìn)行保健茶的開發(fā)，并且材料來源特殊，具有廣闊的開發(fā)前景。

圖1 海人樹葉提取物的負(fù)離子模式下的總離子流(TIC)和基峰離子流(BPI)

表1 海人樹葉化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 海人樹葉的抗氧化活性

分別采用DPPH法和ABTS法測定海人樹葉的抗氧化活性，以抗壞血酸為對照，結(jié)果見表2，趨勢圖見圖3。從圖3中可知，海人樹葉提取物對DPPH和ABTS自由基有明顯的清除作用，且提取物濃度與清除率間呈正相關(guān)，隨著提取物濃度的逐漸增大，清除率逐步增大。從表2結(jié)果可知，海人樹葉提取物濃度(X)與DPPH自由基清除率(Y)的回歸方程為：Y=161.13X+1.502 1(R2=0.998 9)，對照抗壞血酸的回歸方程為Y=181.03X-1.728 7(R2=0.999 5)。海人樹葉和抗壞血酸對DPPH自由基清除作用的IC50值分別為0.301 0、0.285 8 mg/mL，二者差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；海人樹葉提取物濃度(X)與ABTS自由基清除率(Y)的回歸方程為：Y=245.33X+2.260 9(R2=0.996 5)，抗壞血酸的回歸方程為Y=487.58X+4.309 2(R2=0.991 3)。海人樹葉和抗壞血酸對ABTS自由基清除作用的IC50值分別為0.194 6、0.093 8 mg/mL，二者差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。海人樹葉提取物對DPPH自由基的清除能力與對照抗壞血酸相當(dāng)，對ABTS自由基的清除能力低于抗壞血酸，研究結(jié)果表明海人樹葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3 討論

前人對海人樹化學(xué)成分的研究很有限，Hershenson等[13]最早從海人樹莖中鑒定出烷烴類、β-谷甾醇和木質(zhì)素類化合物;Mitchell等[14]從海人樹植株的干燥粉末中也鑒定出了β-谷甾醇，此外，還鑒定了蘆丁、三萜二醇類和黃酮醇苷類化學(xué)成分;本課題組從海人樹莖中鑒定出黃酮、花青素和三萜皂苷類化合物，各成分特征性非常強(qiáng)，尤其是花青素類，是原花青素的二聚體、三聚體、四聚體，也充分證實(shí)了樣品屬于莖類原料，因此富含鞣質(zhì)類[15]。本研究從海人樹葉中鑒定出黃酮類、長鏈脂肪酸類、酚酸類、苯丙素類、花青素類和環(huán)烯醚萜類成分，該材料的成分特征性也非常強(qiáng)，其中黃酮類成分占到半數(shù)以上。

研究結(jié)果表明，海人樹葉和莖的成分存在較大差異，在開發(fā)利用時(shí)應(yīng)根據(jù)不同成分特征區(qū)別應(yīng)用，該研究豐富了海人樹化學(xué)成分的種類，這可能是因?yàn)闄z測手段和植物研究部位不同產(chǎn)生的結(jié)果。本課題組前期研究表明，海人樹莖具有很強(qiáng)的抗氧化活性[15]，因此本文也對海人樹葉的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，海人樹葉提取物對DPPH的抗氧化活性與對照抗壞血酸活性相當(dāng)，對ABTS的抗氧化活性稍低于抗壞血酸，總體說明海人樹葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。自然界植物中含有多種天然抗氧化活性成分，包括黃酮、酚酸、維生素等都是很強(qiáng)的天然抗氧化劑[18-20]。海人樹葉中含有大量的黃酮類和酚酸類化合物，此外還含有花青素類成分，花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性類黃酮色素，研究表明，花青素具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種生物活性[21]，海人樹葉含有多種天然抗氧化活性成分，這可能是其抗氧化活性較強(qiáng)的原因。海人樹為苦木科海人樹屬唯一的物種，針對其開展的科學(xué)研究很少，海人樹功能性成分及藥理活性分析仍需進(jìn)行深入研究。本研究豐富了海人樹化學(xué)成分和生物活性研究，為其進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

圖2 海人樹葉提取物的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)

表2 海人樹葉提取物的抗氧化能力

注：同列比較不同小寫字母，aP<0.05，bP<0.05，表示不同樣品間存在顯著差異。

圖3 海人樹葉提取物對DPPH(A)和ABTS(B)自由基的清除作用