沈宏，周子路，王彩霞，陶逸萍，郭燕君

（嘉興學院醫(yī)學院，浙江 嘉興 314001）

1 細胞衰老機制

1961年，Hayflick 和 Moorehead 首次研究了細胞水平上增殖的永久停滯，他們表明原代人類細胞的壽命僅限于大約 60 個分裂。最近，已經有關于選擇性消除衰老細胞和隨后的組織再生或緩解疾病癥狀的研究[1]。衰老目前被定義為響應內在或外在因素的細胞狀況，包括致癌基因激活、氧化應激、線粒體功能障礙、輻射和暴露于化療藥物。衰老的早期階段是響應這些刺激中的一種或多種而開始的。在這個階段，衰老細胞發(fā)生特征性的形態(tài)變化，變得扁平和擴大。這一過程伴隨著核染色質重塑和核纖層蛋白 B1 的丟失，線粒體中氧化代謝的誘導，以及衰老細胞抗凋亡途徑 (SCAP) 的激活，使細胞對死亡具有抵抗力。由于溶酶體活性的增加，還觀察到衰老相關的β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal），并誘導衰老相關的分泌表型（SASP）。自噬是在應激刺激促進生物體內平衡后，細胞中的溶酶體降解受損大分子或細胞器的過程。它可能與細胞凋亡和衰老有關。

2 細胞衰老生物標志物

衰老細胞具有多種形態(tài)和生化特征，可用于體外和/或體內檢測。因為沒有單一的標記以明確識別衰老細胞，所以通常使用標記和分析技術的組合來提高檢測的特異性。衰老細胞通常大而扁平，這些形態(tài)特征可以使用光學顯微鏡或流式細胞術 (FC)來觀察。其他常用于檢測衰老細胞的技術包括免疫熒光 (IF)、免疫組織化學 (IHC)、蛋白質印跡 (WB)、報告基因檢測、染料摻入、酶染色、PCR（聚合酶鏈式反應）、FISH（熒光原位雜交）和ELISA（酶聯免疫吸附試驗）。最合適的檢測方法將取決于研究的目標和選擇的衰老模型。

第一組主要的衰老標志物由與衰老細胞結構變化相關的標志物組成。除了前面提到的細胞大小和形狀的變化外，衰老通常伴隨著溶酶體活性的增加，這可以通過酶染色檢測到。一種特別值得注意的與衰老相關的溶酶體酶是衰老相關的 β-半乳糖苷酶（SA-β-半乳糖苷酶），其最適 pH 值為 6.0。長期以來，SA-β-gal 是檢測衰老細胞的金標準，但最近的研究對其特異性提出了擔憂。例如，SA-βgal 在神經元中具有活性并在發(fā)育中的胚胎中表達，但這些觀察結果均不被認為與衰老有關。因此，雖然 SA-β-gal 活性與衰老和細胞增殖狀態(tài)密切相關，但它仍然被廣泛使用，因此不能認為 SA-β-gal 活性足夠特異性以單獨識別衰老細胞。另一個經常被利用的衰老標志是 SA-α-巖藻糖苷酶活性，隨著衰老過程中溶酶體的活化而增加。重要的是，它的上調可能比 SA-β-gal 更具特異性。另外可用作衰老標志物的是脂褐質——一種黃褐色殘留物，由溶酶體中不完全降解或代謝的脂質組成——它會在衰老組織中積累。它的存在可以使用光學顯微鏡、利用其自發(fā)熒光或蘇丹黑 B (SBB) 染色來檢測。最近還報道了一種新的生物素綴合的 SBB，用于靈敏的脂褐質檢測 (GL13)，可以使用特定的抗生物素抗體進行可視化。另一類敏感的衰老指標由 DDR 基因產物組成，其表達通常通過免疫熒光可視化。最常用的 DDR 蛋白是在 Ser-139 處磷酸化的γH2AX，它在雙鏈 DNA 斷裂位點積累并能夠檢測雙鏈斷裂 (DSB) 修復途徑蛋白。

屬于 p16/RB 和 p53/p21 衰老誘導途徑的蛋白質也是常見的衰老標志物。特別是，p16INK4a、pRB、磷酸化-pRB 或 p21、p53 和磷酸化-p53 的過表達可以通過 WB、IHC 和/或 IF 來確定。這些途徑中鮮為人知的分子，如 DEC1 和 PPP1A，也已被確定為潛在的生物標志物。DEC1 是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子，可介導 p53 依賴性過早衰老，而 PPP1A 是 PP1α 的催化亞基，在癌基因誘導衰老 (OIS) 期間在 p53 介導的途徑中具有活性。

與SASP相關的細胞因子分泌，其特點是促炎化合物的廣泛分泌。SASP 因子分泌到組織微環(huán)境中是在損傷或癌基因誘導的衰老過程中誘導的，并且可以通過 WB、ELISA 或 SASP 特異性測定來檢測。在最近的出版物中已經討論了幾種 SASP 相關化合物和結構的檢測，但僅基于這些標記物確認衰老是非常具有挑戰(zhàn)性的，并且獲得的結果可能會產生誤導，因為這些物質也在某些條件下由非衰老細胞分泌。衰老細胞分泌的常見 SASP 因子包括信號分子，如白細胞介素（如 IL-6 和 IL-8）、膜陰影粘附分子和其他生長因子。

3 細胞衰老在卵巢癌治療中的作用

在最近的研究中，已經證實誘導腫瘤細胞衰老以防止腫瘤細胞的無限增殖可以成為一種重要的治療方法。正常細胞積累了癌基因應激、氧化應激和DNA損傷的變化，這些變化觸發(fā)了細胞異常增殖的初始階段。這種異常的增殖可以引起癌前病變；與這種異常情況相平行的是，卵巢癌細胞的內在故障安全機制，如衰老和凋亡被激活。在卵巢癌的進展過程中，損傷的積累推翻了這些保護機制，導致了卵巢癌的發(fā)生。實驗研究證實，化療和放射治療等常規(guī)治療方法可以誘導細胞衰老；同時，針對卵巢癌的靶向生物治療的研究也取得了一定的進展。化療、放射治療和生物治療導致的細胞衰老永久地阻止了生長。在癌細胞中，化療誘導的衰老是一種重要的細胞命運的替代[2]。該研究報告了在癌癥中不依賴凋亡的p53功能，并表明過度表達Bcl-2的小鼠淋巴瘤化療的機制是通過由p53和p16INK4a控制的衰老程序而不是通過凋亡[3]。 相反，有文獻報道，DNA 甲基轉移酶（DNMT）DNMT3a在阿霉素誘導的結直腸癌細胞衰老和凋亡之間切換中發(fā)揮重要作用，DNA損傷藥物阿霉素（Dox）誘導細胞衰老，其濃度明顯低于誘導細胞凋亡所需的濃度。在Dox低濃度下，腫瘤抑制因子p53被激活，被激活的p53增強p21的表達。在Dox高濃度下，Dox激活p53導致細胞凋亡而不增強p21表達?？刂艱ox誘導衰老和細胞凋亡的差異效應的潛在機制和因素尚不清楚。DNMT3a被Dox上調，特別是在誘導HCT116結直腸癌細胞凋亡的濃度下，這個過程受到p53的調節(jié)。同時，p21的表達在誘導衰老的濃度下顯著上調，并且在使用誘導凋亡的Dox濃度進行處理時保持較低水平。DNMT3a和p21對Dox的差異表達表明，DNMT3a可能是Dox誘導的衰老和細胞凋亡之間切換的關鍵因素。此外，當DNMT3a沉默時，用誘導凋亡的Dox濃度處理HCT116細胞增加了發(fā)生衰老的細胞的百分比，伴隨著p21的上調。相反，誘導衰老的Dox濃度促進了細胞凋亡率，p21表達受到抑制。令人驚訝的是，在Dox的兩個范圍內都沒有檢測到p21啟動子的DNA甲基化狀態(tài)的變化[4]。當衰老細胞受到依賴于P53的凋亡刺激時，它們會因治療而發(fā)生壞死[5]。有趣的是，卵巢癌細胞衰老的激活與強烈的衰老相關分泌表型(SASP)有關，SASP可以吸引和激活免疫系統(tǒng)細胞來改變卵巢癌的微環(huán)境。關于免疫功能障礙，SASP的促炎性質可以招募免疫細胞，免疫細胞可以殺死和清除衰老細胞或其他存活的癌細胞[6]。總而言之，可以探索化療、放射治療和生物治療誘導的細胞衰老作為卵巢癌的替代或補充治療。

3.1 細胞衰老與卵巢癌化療

卵巢癌最常用的治療方法是手術輔助化療，但這些方法很難顯著延長5年生存率(約20%)[7]。尤其是卵巢癌的化療耐藥性和較強的侵襲轉移能力，嚴重降低了卵巢癌患者的遠期療效和生存率。卵巢癌化療主要是通過誘導卵巢癌細胞凋亡來治療的。但是，腫瘤細胞普遍存在凋亡障礙，卵巢癌治療的一大難題是腫瘤細胞凋亡抵抗。隨著研究的深入，研究證實化療藥物可以誘導腫瘤細胞衰老。衰老的細胞處于永久性生長停滯狀態(tài)，修復DNA損傷后，仍然經歷細胞周期停滯?；熆梢哉T導細胞周期停滯和衰老，但細胞周期停滯不是衰老的同義詞。一種類型的靜止是簡單的靜止，一種可逆的停止。細胞停滯是因為缺乏生長因子，而添加生長因子會導致增殖。另一種類型的靜止是鎖定靜止，一種不可逆轉的停頓。分化的細胞被踩剎車，過度的刺激導致衰老。許多研究發(fā)現，低劑量的化療藥物可以導致腫瘤細胞衰老，并進一步證明，誘導腫瘤細胞衰老是逆轉耐藥性的可行策略。誘導衰老的化療，一方面可以減少化療的劑量；研究表明，低劑量的化療藥物可誘導A2780卵巢癌細胞衰老，導致細胞周期延長，主要停滯在細胞周期的G1期[8]。此外，根據Schmitt’s小鼠化療研究發(fā)現，化療藥物可引起腫瘤細胞發(fā)生衰老變化，而細胞衰老的機制直接影響化療效果，衰老細胞的表達量與預后密切相關。目前認為化療藥物誘導的細胞周期停滯與DNA損傷直接相關。如果小劑量化療藥物引進無法修復的DNA損傷，卵巢癌細胞往往會發(fā)生衰老，而不是細胞凋亡。因此，衰老在體內對化療的反應中起著重要作用。

3.2 細胞衰老與卵巢癌放射治療

在卵巢癌中，放射治療在卵巢癌治療中的應用較少，手術和化療仍然是腫瘤基本的治療方法。卵巢癌腫瘤對放射敏感；放射治療目前并不是卵巢癌的主要治療方法，放射治療只作為腫瘤手術后的輔助治療，卵巢癌晚期及復發(fā)病變的姑息治療方法。迄今為止，許多研究證實放射治療對卵巢癌具有治療效果。

在上皮性卵巢癌中，放射治療可以用來緩解晚期卵巢癌引起的疼痛、出血或壓迫癥狀[9]。Yahara等人選擇了27名完全緩解后有限復發(fā)的患者，評估了確定性放射治療對上皮性卵巢癌復發(fā)的療效和毒性。他們發(fā)現，放療對復發(fā)性上皮性卵巢癌的局部控制率較好，且無嚴重毒副作用[9]。Wei也證實放療聯合化療對鉑耐藥復發(fā)性上皮性卵巢癌有良好療效[10]。Albuquerque等報道，長期隨訪證實了介入野放射治療對局部復發(fā)卵巢癌的益處[11]。在卵巢透明細胞癌中，放療可以提高早期(ⅠC期和Ⅱ期)患者5年的無瘤生存率20%(相對風險為0.5)[12]。Macrie等人評估了盆腔放療在卵巢透明細胞癌中的作用。他們發(fā)現，這種疾病的患者在手術和化療后表現出盆腔復發(fā)的傾向，而且盆腔放射治療可以有效地殺菌微觀腫瘤細胞，并提示盆腔放射治療可能使卵巢透明細胞癌患者受益[13]。

眾所周知，提高腫瘤細胞對放射治療的敏感性是放射治療成功的關鍵。一些數據表明，大規(guī)模輻射(X射線)可以誘導腫瘤細胞衰老，并進一步改變腫瘤細胞對X射線的敏感性。Penha等人報道，不同劑量和時間的輻射暴露對腫瘤細胞的影響不同[14]。由于衰老在抗癌策略中發(fā)揮著越來越重要的作用，誘導衰老的放射治療已廣泛應用于甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌等[15]。雖然誘導衰老放射治療發(fā)展迅速，但這一療法在卵巢癌治療上尚未廣泛應用，希望這一新療法能為卵巢癌的治療提供一種有用的工具。

3.3 細胞衰老與卵巢癌生物治療

與傳統(tǒng)的化療和放射治療不同，生物治療可以顯著延長患者的生存時間，而不會出現很大的不良反應。因此，恢復衰老途徑、誘導腫瘤細胞衰老是一個很有前景的治療新靶點。有一些研究不僅在卵巢癌細胞系中提供了衰老特征的證據，而且在標本中也提供了證據。在Konecny等人的研究中，他們發(fā)現p16在原發(fā)臨床卵巢癌標本中的過度表達可能導致衰老[16]。Mikuaapietrasik等人[17]表明，SA-A-Gal在誘導衰老的卵巢癌轉移標本中的表達顯著增加。

在基因治療方面，Bitler等人首次證明Wnt5a的激活通過促進組蛋白細胞周期調節(jié)因子/早幼粒細胞白血病衰老途徑來誘導人上皮性卵巢癌細胞衰老。Wnt5a的不同表達與上皮性卵巢癌患者的不同腫瘤分期和總生存期有關。這些數據與Wnt5a信號促進人卵巢癌細胞衰老是一種潛在的卵巢癌治療新策略的觀點是一致的[18]。Pan等研究發(fā)現Daxx缺失可以以p53/p21依賴的方式加速小鼠卵巢表面上皮細胞的衰老，并誘導DNA損傷相關蛋白(p-H2AX和p-Chk2)和細胞周期相關基因(p21和p27)的高表達。這些結果提示DAXX可能在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起作用，并可能成為抗癌的靶點[19]。Aird等人發(fā)現，上皮性卵巢癌細胞株和標本中核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)的表達顯著高于正常對照，并且RRM2的表達下調通過細胞衰老機制抑制了人上皮性卵巢癌細胞的生長。這些數據表明，抑制RRM2誘導衰老是上皮性卵巢癌患者的一種新的治療策略[20]。