劉園園，蘇熠，王琪

（南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，江蘇 南京 210044）

臭氧（O3）是溫暖晴朗天氣下氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)化合物經(jīng)光化學(xué)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的一種氧化性氣體，其地表背景濃度為20～40 μg/L[1]。O3濃度超過正常的本底濃度后，就會成為空氣污染物[2]，不僅對植物產(chǎn)生傷害，還影響人體健康。

在過去的30年里，人們對O3的研究越來越多。O3是全球范圍內(nèi)能嚴(yán)重傷害植物的空氣污染物之一，工業(yè)革命以來的人為活動致使近年來O3濃度一直呈迅速升高趨勢[3]。據(jù)估計，在未來幾十年里北半球的地面O3濃度還會繼續(xù)以每年0.5%～2.0%的速度增長，到2060年全球平均地表濃度將達(dá)到40～60 μg/m3[1]。近幾十年來，我國許多城市和地區(qū)經(jīng)歷了高O3事件，且地表O3濃度呈上升趨勢。目前我國存在著難以想象的O3污染，2005～2010年O3年平均濃度峰值高達(dá)60 μg/L[4]?？諝獗O(jiān)測發(fā)現(xiàn)，亞洲一些地區(qū)的重要農(nóng)作物生長季節(jié)，O3月平均濃度達(dá)到50 μg/L十分常見[5]。印度學(xué)者進(jìn)行模型研究后認(rèn)為，未來幾年O3濃度將會進(jìn)一步升高[6，7]。

高濃度的O3會對植物造成各個方面的不利影響，其直接影響植物的生理生化過程，從而可能導(dǎo)致植物對其他生物或非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)降低[8]。如，O3脅迫可能會導(dǎo)致植物葉綠素含量下降，光合作用和氣孔導(dǎo)度降低[9]；降低植物的抗氧化劑水平，加速葉片衰老[10]，最終導(dǎo)致植物總生物量和營養(yǎng)產(chǎn)量降低[11～15]。最近一項關(guān)于全球性O(shè)3污染導(dǎo)致作物減產(chǎn)的風(fēng)險評估數(shù)據(jù)顯示，2010～2012年我國每年因為O3污染造成的水稻、小麥減產(chǎn)幅度分別為8.1%和9.8%[16]。長三角地區(qū)是我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展活躍區(qū)域之一，也是我國農(nóng)作物主產(chǎn)區(qū)和O3主要污染區(qū)，2014～2017年O3污染導(dǎo)致該區(qū)域水稻年均減產(chǎn)2 445百萬t，年經(jīng)濟(jì)損失約為10億美元[17]。由于水稻種植季節(jié)與環(huán)境的O3濃度峰值重疊，今后由O3污染造成的產(chǎn)量損失將進(jìn)一步加大[18]。小麥?zhǔn)莾H次于玉米的第二大糧食作物，2016年世界小麥產(chǎn)量為7.49億t（糧農(nóng)組織2016年）。我國小麥主產(chǎn)省位于華北平原以及華中和華東地區(qū)，這些區(qū)域也是O3污染嚴(yán)重的地區(qū)[19]。一項meta分析表明，與生長在木炭過濾空氣中的植物相比，O3濃度升高（50～75 μg/L）會造成小麥減產(chǎn)24%[12]。據(jù)估計，因O3濃度升高，2030年全球小麥產(chǎn)量與2000年相比將下降4%～17%[20]?？梢钥闯?，當(dāng)前我國高濃度O3對稻麥作物的負(fù)面影響已經(jīng)到了不容忽視的地步。

意識到O3污染的嚴(yán)重性后，人們開始尋找解決辦法。1978年Carnahan等[21]報道了一種名為Ethylenediurea（EDU）的物質(zhì)，似乎在保護(hù)植物免受O3傷害方面非常有效。截至目前，EDU仍被人們廣泛應(yīng)用于緩解O3脅迫的不良影響。眾多研究也表明了EDU能夠有效抑制O3脅迫，對許多受O3脅迫的植物如水稻[22]、小麥[23]、玉米[24]、豆類[25]和楊樹[26]等具有明顯的保護(hù)作用。對EDU緩解稻麥臭氧脅迫的作用與機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期提高人們對EDU緩解O3脅迫作用機(jī)理的認(rèn)識，有利于在O3濃度較高的情況下合理應(yīng)用EDU來保護(hù)作物。

1 EDU的簡介

1.1 EDU的由來

EDU由杜邦公司于1970年開發(fā)出來，并在1975年首次被人們發(fā)現(xiàn)具有抗O3脅迫的作用。EDU是一種非商業(yè)性化合物，但截至目前尚未見到其合成的詳細(xì)報道。EDU基本的兩大組成是尿素（U）和苯基脲（PU），在EDU的相對分子質(zhì)量中，U、PU分別占23.46%和53.18%。EDU是一種含氮化合物，其中10.5%的氮素來自尿素，10.94%的氮素來自苯基脲成分[27]。從EDU的分子結(jié)構(gòu)（圖1）可以看出，由于Remarkably化合物不含烯烴雙鍵，因此不太可能直接清除O3[2]。

圖1 EDU的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular formula of EDU

1.2 EDU在植物體內(nèi)的運(yùn)輸和吸收

眾所周知，當(dāng)O3通過氣孔進(jìn)入葉片，到達(dá)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，即質(zhì)外體時，就開始對植物組織產(chǎn)生影響[28，29]。O3是通過破壞植物的膜結(jié)構(gòu)和通過膜中脂質(zhì)的過氧化作用改變膜的通透性，從而影響植物細(xì)胞膜的[30]。前人研究結(jié)果表明，EDU對受O3脅迫植物的保護(hù)作用發(fā)生在植物的質(zhì)外體中，而不是發(fā)生在原生質(zhì)體中[31～34]。

EDU在注射后不久就開始遵循頂瓣方向在植物器官里移動，并且速度很快[35]；使用2 h后，便會出現(xiàn)在植物的所有組織，并且EDU濃度隨著使用后時間的推移而增加，直至應(yīng)用的劑量被吸收[32]。植物根和莖中的EDU濃度隨使用后時間的延長而降低，但是葉片中的EDU濃度不存在該現(xiàn)象。

1.3 EDU的應(yīng)用方式

1.3.1 莖注射 該方法主要適用于樹木，是對樹木木質(zhì)組織注入化學(xué)物質(zhì)的有效使用方法。但不論是作物還是樹木，與其他2種方式相比，該方法所需EDU劑量均較小[36]，且效果好于土壤噴施法。應(yīng)用該方法需要在樹木上打開多個孔才能促進(jìn)EDU充分吸收，所以會對樹木造成傷口，加大疾病感染的風(fēng)險，且使用過程較土壤噴施和葉面噴施更復(fù)雜、耗時。

1.3.2 土壤噴施 該方法較其他2種方法使用簡單，且節(jié)省時間。但在使用過程中，需要考慮到影響EDU吸收和有效性的土壤因素，如土壤微生物數(shù)量、土壤有機(jī)質(zhì)含量、土壤肥力、土壤結(jié)構(gòu)等[2，37]。

1.3.3 葉面噴施 該方法是在稻麥作物上最常用的方法，使用劑量根據(jù)作物葉面積而定。該方式需要在植物氣孔完全打開時才能應(yīng)用；在多風(fēng)、干燥地區(qū)，植物氣孔大多關(guān)閉，EDU使用后可能無效，這種情況下需要在每次施用前一天對植物進(jìn)行灌溉[36]。

1.4 EDU的適用濃度及有效時間

印度的一項研究表明，400 mg/L的EDU去評估環(huán)境O3的影響最有效，且能夠為生長好、產(chǎn)量高的小麥品種提供最大程度的保護(hù)。當(dāng)EDU施用濃度達(dá)到400 mg/L以上時，對小麥正常生長無明顯影響。此外，僅在植物生命的特定階段或僅在旗葉上施用EDU不足以評估O3對植株的影響，因此在植株的整個生長期都需要施用EDU。需要注意的是，EDU葉面噴施1 h后若受到雨水沖洗，其濃度將在第3天開始下降[38]。一般來說，EDU在植物體內(nèi)可以留存8～15 d，但在植物中的有效性和持久性因植物類型而異，因此需重復(fù)施用。

關(guān)于EDU的施用量，有人提出通過植物總?cè)~面積來計算，因此，每次施用的EDU劑量較整個生長季節(jié)施用的EDU累計總劑量更有意義。已有證據(jù)表明，應(yīng)用莖注射方式，按葉面積施用13～26 mg/m2的EDU，可有效防止O3毒性[38，39]。根據(jù)Agathokleou提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行重新計算，結(jié)果表明，按葉面積噴施14.6～29.1 mg/m2的EDU，相當(dāng)于葉面噴施EDU的濃度為200 mg/L，可提供足夠的保護(hù)作用[40]。

2 EDU的作用

2.1 作為篩選作物O3耐性的工具

O3濃度不斷升高對糧食安全造成了一定威脅，我們要培育出適應(yīng)高濃度O3環(huán)境的優(yōu)良作物品種，以確保糧食安全生產(chǎn)。這就要求我們在育種過程中對作物的高濃度O3適應(yīng)性進(jìn)行充分的實(shí)地評估，但是O3熏蒸設(shè)施的技術(shù)挑戰(zhàn)和建設(shè)成本都很大。近年來有研究表明，可以通過EDU來評估大田條件下O3對作物的負(fù)面影響，如利用EDU篩選稻麥作物及部分樹種對O3的敏感程度[41～44，2，37]，因為O3脅迫下，對O3敏感的基因型植物對EDU的反應(yīng)較耐O3基因型植物強(qiáng)烈得多。Ashrafuzzaman等[45]為了研究EDU作為篩選作物是耐O3型還是敏感型的有效工具，選取3個不同基因型的水稻（耐O3型L81，敏感型NB和BR28）采用4種處理方式（空白對照，施用EDU的對照，O3處理，施用EDU的O3處理）研究了不同基因型水稻對EDU的反應(yīng)，結(jié)果表明，O3脅迫處理下，施用EDU對水稻MDA含量、SPAD值、氣孔導(dǎo)度和光譜反射指數(shù)具有顯著影響，其中，對敏感基因型BR28和NB的單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)等重要產(chǎn)量性狀影響顯著，而對耐性基因型L81僅在株高、SPAD值和氣孔導(dǎo)度等少數(shù)性狀上影響較大。因此，EDU可以作為改良稻麥作物雜種優(yōu)勢的有效工具，用來篩選稻麥作物及其不同品種在自然田間條件下對O3的敏感性。尤其在O3監(jiān)測技術(shù)尚不成熟的發(fā)展中國家，使用EDU評估O3對植物的影響很有必要。在未來O3濃度升高的環(huán)境下，通過改良作物性狀培育耐O3或抗O3稻麥新品種可有效提升稻麥產(chǎn)量[46]，預(yù)計到2030年由高濃度O3引起的全球作物損害較2000年可減輕12%[47]，最終有望基本消除高濃度O3對作物造成的破壞性影響，確保全球糧食安全。

2.2 對稻麥作物的影響

2.2.1 對稻麥作物生長和形態(tài)參數(shù)的影響 以往研究早已證實(shí)，高濃度O3脅迫下施用EDU可以保護(hù)植物進(jìn)行正常生長。研究表明，EDU能夠改善高O3脅迫植物的各種形態(tài)參數(shù)[48，49]，300 mg/L處理下小麥株高顯著增加[50]，500 mg/L處理下小麥葉片數(shù)量明顯增多[51]。

2.2.2 對稻麥作物生物量和產(chǎn)量的影響 高濃度O3脅迫會加速稻麥作物葉片衰老，表現(xiàn)為脂質(zhì)氧化增強(qiáng)，色素含量和光合速率快速下降[52]，最終導(dǎo)致千粒重和產(chǎn)量降低[53]。施用EDU可以減少O3對稻麥作物的可見傷害和生長衰退[2]，盡管這種保護(hù)作用通常并不完美。EDU處理后，相對生長速率和凈同化率等生長指標(biāo)提高，表明生物積累量增加，植物已經(jīng)克服了O3的負(fù)面影響[54]；比葉重增大，表明光合產(chǎn)物在葉片分配得較多，導(dǎo)致有效葉面積比高于非EDU處理。與未EDU處理的對照組相比，450 mg/L的EDU處理可明顯提高水稻葉、穗、莖、芽、根以及整個植物的干物質(zhì)重，指標(biāo)值增幅分別為15.3%、16.2%、25.3%、18.2%、23.9%和18.7%[55]。

EDU對受O3脅迫稻麥作物的保護(hù)作用最終體現(xiàn)在產(chǎn)量和產(chǎn)量性狀上，EDU處理的稻麥作物產(chǎn)量和產(chǎn)量性狀較未處理對照顯著增加。在作物生長過程中重復(fù)施用EDU，可為作物提供一系列的保護(hù)，最終使產(chǎn)量增加（圖2）。EDU能使?fàn)I養(yǎng)生長期的葉片保持較高的生物量，并將更多的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到生殖部位，從而提高產(chǎn)量[56]。與水分處理相比，EDU處理的所有品種小麥均可顯著提高千粒重和收獲指數(shù)，指標(biāo)值增幅分別為16.7%和17.7%[57]。環(huán)境O3濃度為34.2～54.2 μg/L時，400 mg/L的EDU處理可顯著提高小麥產(chǎn)量，且對O3越敏感的品種對EDU處理的反應(yīng)越積極，5個小麥品種（HUW468、HUW510、HUW234、Sonalika和PBW343）中最敏感品種HUW468施用EDU后增產(chǎn)幅度最大[48]。Agrawal等[51]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，在產(chǎn)量上HUW468對O3的敏感性高于其他小麥品種（HUW234和HD2329）。Shang等[55]研究表明，水稻在2個不同濃度的O3（NF和NF60）脅迫下，EDU處理的水稻平均產(chǎn)量和千粒重較非EDU處理分別提高16.4%和6.7%；且O3×EDU互作效應(yīng)顯著，NF60較NF顯著降低了非EDU處理植株的穗粒數(shù)。因此，EDU處理不僅能防止作物總產(chǎn)量損失，還能有效避免作物產(chǎn)量構(gòu)成的其他因素受到影響。

圖2 作物生長過程中施用EDU對作物的積極影響Fig.2 The positive impact of EDU on crops during growth

3 EDU的作用機(jī)制

3.1 生理學(xué)機(jī)制

EDU在緩解O3對植物的傷害方面具有積極作用。研究表明，EDU可能通過直接影響生理參數(shù)或通過抗氧化劑介導(dǎo)的防御反應(yīng)來清除O3對植物的有害活動[2]。O3通過植物膜中脂質(zhì)的過氧化作用影響膜的通透性，而EDU可以通過清除O3產(chǎn)生的活性氧和提高相關(guān)自由基的酶活性來保護(hù)植物組織免受脂質(zhì)過氧化。O3會在細(xì)胞間隙產(chǎn)生一系列潛在的破壞性活性氧（ROS），從而引發(fā)抗氧化反應(yīng)[58]。同時在葉子內(nèi)部潮濕的環(huán)境中這些氧化過程會產(chǎn)生H2O2，這是很重要的O3衍生氧化劑之一，它的產(chǎn)生可能會導(dǎo)致其他ROS如超氧化物和羥基自由基的形成[59]。ROS能夠氧化細(xì)胞成分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、巰基和核酸，并引發(fā)自由基連鎖反應(yīng)[60]。研究表明，EDU對受O3脅迫植物的積極影響是因為EDU引起了植物質(zhì)外體抗氧化劑水平的變化，從而提高ROS清除酶的效率[61]。植物體內(nèi)的幾種抗氧化劑（如抗壞血酸、谷胱甘肽）和抗氧化酶〔如抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）〕可保護(hù)植物免受O3的氧化傷害。在芥菜上的研究結(jié)果顯示，EDU處理后可誘導(dǎo)抗壞血酸含量增加，谷胱甘肽循環(huán)酶、SOD和CAT活性提高，這對ROS解毒有很大幫助[62]。

O3脅迫對植物類囊體膜中的電子傳遞過程會產(chǎn)生負(fù)面影響[63]，而EDU處理可保護(hù)葉綠素免受損失[64]。有研究顯示，EDU處理有助于緩解O3誘導(dǎo)的PSⅡ反應(yīng)中心失活等問題[65]，且對光反應(yīng)的積極影響能夠延續(xù)到暗反應(yīng)中，使植物光合速率提高，主要表現(xiàn)為植物固碳能力的增強(qiáng)。但大多數(shù)研究表明，EDU對植物光合作用的影響并不顯著[48，66]。值得思考的是，既然EDU對植物的光合作用無明顯影響，那么，為什么經(jīng)過EDU處理后植物會生長得更好？探究EDU對O3環(huán)境中幾種植物氣孔導(dǎo)度的影響，結(jié)果顯示，EDU并未對氣孔導(dǎo)度產(chǎn)生直接影響[67，68]。一項關(guān)于EDU對植物影響的分析也表明，EDU對植物氣孔的直接影響甚微[44]?？梢钥闯鯫3對植物氣孔的作用機(jī)制復(fù)雜，今后應(yīng)在這方面開展更多的研究和探討。

3.2 遺傳學(xué)機(jī)制

2018年Ashrafuzzaman等[18]將O3敏感和耐受的水稻品種暴露于O3和對照環(huán)境中，然后對水稻進(jìn)行RNA測序，并對轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，對O3敏感的品種有上千個基因?qū)3做出了反應(yīng)，卻沒有一個基因?qū)DU做出反應(yīng)。該研究結(jié)果為EDU是一種表面保護(hù)劑提供了有力證據(jù)，說明EDU可以在不直接干擾植物脅迫反應(yīng)系統(tǒng)的情況下減輕O3脅迫。

Gupta等[24]通過鑒定小麥葉片質(zhì)外體和葉綠體中的EDU響應(yīng)蛋白，啟動了MAE的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。這是首次對質(zhì)外體和葉綠體分離株響應(yīng)EDU蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。結(jié)果表明，EDU能夠影響植物的光合作用蛋白，同時減輕ROS造成的氧化壓力。使用1D/2D PAGE對2種EDU濃度（200、300 mg/L）的葉綠體分離蛋白在高濃度O3條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)組圖譜分析，并從2個小麥品種（Kundan、PBW 343）的鮮葉中分離出質(zhì)外體和葉綠體，結(jié)果表明，質(zhì)外體蛋白（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、類胚芽蛋白和抗壞血酸過氧化物酶）通過維持O3脅迫下的最佳ROS池來達(dá)到清除O3損害的作用。在葉綠體中，參與光合作用、能量代謝和PSAD的蛋白如Rubisco LSU、OEE、細(xì)胞色素b-6-f復(fù)合物、捕光a/b結(jié)合蛋白、FNR等增加了蛋白豐度，以應(yīng)對O3脅迫帶來的不利影響。這一研究極大地擴(kuò)展了我們對EDU作用模式的認(rèn)知。分析葉綠體分離株的蛋白質(zhì)豐度模式，可以從分子水平上更好地解釋在普遍的O3脅迫下EDU是如何影響光合作用機(jī)制的。

4 總結(jié)與討論

通過文獻(xiàn)分析，我們很清楚地了解到EDU對遭受O3脅迫的植物具有一定的保護(hù)作用，且稻麥敏感品種對這種保護(hù)反應(yīng)更加顯著。雖然這種保護(hù)并不完美，但在一定程度上能夠減少O3脅迫造成的損失。EDU可以作為檢測稻麥作物品種對O3敏感性的有效工具，用于培育耐O3品種，降低高O3造成的損失，在一定程度上確保糧食安全。

EDU對稻麥作物的保護(hù)作用是系統(tǒng)性的，對作物的生理生化過程以及生物量和產(chǎn)量均有一定的積極效應(yīng)，但是具體的代謝途徑我們還不完全明白。目前專家們對EDU的保護(hù)作用研究已經(jīng)開始往“組學(xué)”方面深入，這將使我們在未來能夠更加清楚地了解EDU的保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)階段應(yīng)用“組學(xué)”工具解釋EDU的作用機(jī)制研究較少，基因表達(dá)和蛋白質(zhì)譜的研究可以幫助我們更好地了解EDU使植物免受O3傷害、提供部分保護(hù)的實(shí)際機(jī)制。