高月，郭秀林，趙敏，李國(guó)良*

（1.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051）

小麥為世界主要糧食作物之一，其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)是維護(hù)糧食安全與社會(huì)穩(wěn)定的重要保障。由于耕作、氣候等因素的影響，致使小麥白粉病、銹病、赤霉病等頻發(fā)，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。小麥白粉病是由小麥白粉病菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的一種氣傳性真菌病害，流行范圍廣、強(qiáng)度高、變異快，造成小麥大幅度減產(chǎn)，歐美病害嚴(yán)重地區(qū)小麥減產(chǎn)高達(dá)20%，在亞洲、非洲等冷涼及溫暖潮濕地區(qū)也均嚴(yán)重發(fā)生[2]。小麥對(duì)白粉病的抗性是由抗病基因決定的，因此，攜帶何種抗白粉病基因是決定小麥抗病與否的關(guān)鍵。傳統(tǒng)育種方法選擇周期長(zhǎng)，且效率低。利用分子標(biāo)記輔助選育抗病基因聚合小麥新種質(zhì)，可縮短育種周期，提高基因檢測(cè)準(zhǔn)確率。

目前，國(guó)際玉米和小麥改良中心已記載大量與抗病相關(guān)的分子標(biāo)記，有100多個(gè)白粉病抗性基因（Pm）和等位變異基因被鑒定，156個(gè)QTL被定位[3，4]，但只有部分Pm基因表現(xiàn)出有效抗性。來源于阿富汗地方小麥品種的抗白粉病基因Pm59，對(duì)美國(guó)大平原發(fā)生的小麥白粉病產(chǎn)生有效的抗病性[5]。濟(jì)麥23含有抗白粉病基因PmJM23，該基因具有白粉病廣譜抗性，位于5D染色體的短臂上，煙臺(tái)大學(xué)利用濟(jì)麥23創(chuàng)制了一系列農(nóng)藝性狀優(yōu)良且高抗白粉病的種系[6]。曹廷杰等[7]發(fā)現(xiàn)Pm2或其等位基因抗性較好且比較穩(wěn)定，適合在我國(guó)部分麥區(qū)發(fā)揮抗病優(yōu)勢(shì)。Pm21源于簇毛麥（Heuchera villosa）染色體6V的短臂，對(duì)絕大多數(shù)白粉菌生理小種表現(xiàn)免疫，在我國(guó)北方冬麥區(qū)具有有效的廣譜抗性，且不同的遺傳背景下抗病表現(xiàn)穩(wěn)定，是已知最好的抗白粉病基因[8]。Pm35源于粗山羊草（Aegilops tauschii），定位于染色體5D的長(zhǎng)臂，與同在5D染色體上的Pm2和Pm34對(duì)白粉菌的反應(yīng)不同，遺傳上獨(dú)立[9]。良星99先后通過河北省、國(guó)家品種審定，是我國(guó)北方重要的小麥品種[4]，因攜帶2B染色體長(zhǎng)臂單基因Pm52，對(duì)白粉病表現(xiàn)高抗[10]。

自然界白粉病原菌不斷變異，但小麥品種抗源單一，單個(gè)基因抗性逐漸喪失，造成病害傳播速度快、范圍廣，流行趨勢(shì)難以控制。為了預(yù)防和應(yīng)對(duì)不斷變異的白粉病，育種工作者越來越重視聚多個(gè)抗白粉病基因于一體的新種質(zhì)創(chuàng)制。美國(guó)、英國(guó)、加拿大等均通過抗病基因聚合育成了小麥抗病新品種[11]。我國(guó)也有科研工作者進(jìn)行了抗白粉病基因聚合研究。高安禮等[12]創(chuàng)制了一批聚合多基因的抗病植株，如Pm2+Pm4a+Pm21、Pm2+Pm21、Pm4a+Pm21、Pm2+Pm4a，這些基因單獨(dú)存在時(shí)抗性低，但聚合后抗性表現(xiàn)較好。董娜等[8]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行了Pm21與Pm13抗病基因聚合，抗性鑒定結(jié)果表明，聚合Pm21與Pm13的株系抗病性良好，整體表現(xiàn)免疫或高抗，Pm21對(duì)小麥白粉病的抗性優(yōu)于Pm13，且聚合后基因間不存在負(fù)向作用。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將多個(gè)抗白粉病基因聚合，可提高小麥抗病性，有效防治白粉病。

以攜帶不同抗白粉病基因的小麥品種為供體，以攜帶抗白粉病基因的當(dāng)?shù)匦←溨髟云贩N為受體材料，采用兩兩雜交、回交的方法，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行抗白粉病基因聚合，創(chuàng)制攜帶多個(gè)抗病基因的新種質(zhì)，可為小麥抗病育種提供種質(zhì)資源，對(duì)于減少小麥生產(chǎn)損失，降低農(nóng)藥用量和殘留，以及提升社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 小麥材料

抗白粉病基因Pm21的供體親本為金禾9123，抗白粉病基因Pm35的供體親本為普冰01；受體親本為良星99，攜帶抗白粉病基因Pm52。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 兩兩雜交法聚合抗白粉病基因 以小麥骨干品種良星99為受體親本，分別以金禾9123和普冰01為供體親本，兩兩雜交獲得F1代；F1代之間再進(jìn)行雜交，獲得三親本雜交系；再利用三親本雜交系與良星99進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，創(chuàng)制含有2個(gè)及以上抗病基因的新種質(zhì)材料。

1.2.2 小麥基因組DNA的提取 取小麥葉片0.1 g置于2 mL離心管中，液氮冷凍后磨碎，采用CTAB法[13]提取小麥基因組DNA。

1.2.3 分子標(biāo)記輔助選擇鑒定抗病基因 搜索與抗病基因Pm21、Pm35和Pm52連鎖的分子標(biāo)記[14，9，15]，在供體親本和受體親本之間進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。以小麥葉片基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×Flash Hot Start Master Mix 5 μL、引物0.2 μmol/L、模板DNA 40～60 ng，用dd·H2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57℃（Pm21SCAR1265，Xcfd26）/60℃（Xgwm120）退火40 s，72℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳（Pm21）或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Pm35和Pm52），經(jīng)銀染、顯色步驟，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記有效性鑒定

參照已有與抗病基因Pm21、Pm35和Pm52緊密連鎖的分子標(biāo)記，在供體親本和受體親本之間進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，各篩選到1對(duì)有效的緊密連鎖標(biāo)記，分別為Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120（表1）。其中，Pm21SCAR1265為SCAR標(biāo)記，在金禾9123中能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1 265 bp的特異DNA條帶，在普冰01和良星99均無(wú)特異條帶擴(kuò)增；Xcfd26和Xgwm120為SSR標(biāo)記，分別在普冰01和良星99中擴(kuò)增出特異DNA帶型（圖1）。

圖1 利用不同分子標(biāo)記對(duì)小麥3個(gè)親本的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Polymorphism identification results of three parents of wheat using different molecular markers

表1 分子標(biāo)記及其信息Table 1 Molecular marker and related information

2.2 分子標(biāo)記輔助選擇聚合抗白粉病基因株系

利用篩選到的分子標(biāo)記Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120分別對(duì)3個(gè)親本雜交又回交良星99的BC1F1材料進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，利用標(biāo)記Pm21SCAR1265鑒定出帶型與含有抗病基因Pm21供體親本金禾9123一致的材料3株，分別為3、10和11（圖2）；利用標(biāo)記Xcfd26鑒定出帶型與含有抗病基因Pm35供體親本普冰01一致的材料3株，分別為4、10和13（圖3）；利用標(biāo)記Xgwm120鑒定出與含有抗病基因Pm52供體親本良星99一致的材料14株，分別為1、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16和17（圖4）。綜合3個(gè)分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，獲得聚合3個(gè)抗白粉病基因（Pm21+Pm35+Pm52）的株系1個(gè)（10）；聚合2個(gè)抗白粉病基因的株系4個(gè)，其中聚合基因Pm21+Pm52的株系2個(gè)（3和11），聚合基因Pm35+Pm52的株系2個(gè)（4和13）。

圖2 利用分子標(biāo)記Pm21SCAR1265對(duì)三親本雜交后回交材料BC1F1的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Identification results of molecular marker Pm21SCAR1265 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

圖3 利用分子標(biāo)記Xcfd26對(duì)三親本雜交后回交材料BC1F1的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Identification results of molecular marker Xcfd26 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

圖4 利用分子標(biāo)記Xgwm120對(duì)三親本雜交后回交材料BC1F1的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Identification results of molecular marker Xgwm120 in BC1F1 of three parents hybridation and backcross

3 結(jié)論與討論

雖然已經(jīng)有100多個(gè)白粉病抗性基因（Pm）和等位變異基因被鑒定，但截至目前只有Pm1、Pm2、Pm3、Pm5、Pm8、Pm17、Pm21、Pm24、Pm38、Pm41、Pm46和Pm60這12個(gè)基因被克隆[4]，其中根據(jù)Pm21開發(fā)的SCAR分子標(biāo)記Pm21SCAR1265是檢測(cè)Pm21基因有效的分子標(biāo)記[14，15]，我們的試驗(yàn)結(jié)果也證明了該分子標(biāo)記的有效性。Pm35和Pm52均已被精細(xì)定位[4，16]，并分別開發(fā)了有效的分子標(biāo)記Xcfd26和Xgwm120，在檢測(cè)Pm35和Pm52時(shí)均有特異帶型。由此可見，分子標(biāo)記Pm21SCAR1265、Xcfd26和Xgwm120是有效的分子標(biāo)記，可以用來鑒定小麥雜交后代材料中抗白粉病基因Pm21、Pm35、Pm52是否成功導(dǎo)入。利用有效的分子標(biāo)記檢測(cè)雜交后代，可準(zhǔn)確、高效地檢出目標(biāo)基因，加速多個(gè)抗白粉基因聚合的小麥抗病育種進(jìn)程。

在生產(chǎn)上，為了提高小麥產(chǎn)量，常采用增加種植密度和水肥用量等措施，而這些措施均有利于白粉病的傳播。在大部分麥區(qū)，小麥白粉病已發(fā)展成為一種常見病害。Pm8來源于黑麥，對(duì)小麥白粉病抗性好，早期被廣泛用于小麥抗白粉病育種[17]。其后，Pm2、Pm4、Pm12、Pm13、Pm16、Pm20、Pm21、Pm35和Pm52等抗白粉病基因均被應(yīng)用到小麥抗病育種[17，18]，其中Pm21、Pm35和Pm52是目前在生產(chǎn)實(shí)踐中有效的抗病基因，包含它們?nèi)魏我粋€(gè)基因的小麥品種均對(duì)白粉病高抗甚至免疫[4，8，9，17]。在自然環(huán)境下，小麥白粉病菌變異快，很容易導(dǎo)致含有一個(gè)抗白粉病基因的小麥品種失去抗性。如Pm8過度利用，致使其對(duì)我國(guó)大部分麥區(qū)的小麥白粉病抗性已經(jīng)喪失[17]。因此，創(chuàng)制多個(gè)抗白粉病基因聚合的新種質(zhì)進(jìn)而培育聚合多個(gè)抗病基因的小麥新品種，是增強(qiáng)小麥持久抗病性的有效途徑。攜帶Pm21的金禾9123和攜帶Pm52的良星99是我國(guó)黃淮冬麥區(qū)國(guó)審?fù)茝V品種，不僅高抗白粉病，而且產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀也表現(xiàn)良好[17，19]。本研究通過兩兩雜交、回交的方法，獲得了聚合Pm21、Pm35和Pm52這3個(gè)抗病基因的新種質(zhì)。后續(xù)將在田間對(duì)獲得的材料進(jìn)行抗病鑒定試驗(yàn)，為利用多個(gè)抗白粉病基因進(jìn)行抗病育種提供種質(zhì)資源。

綜上所述，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)創(chuàng)制多基因聚合的抗白粉病新種質(zhì)，不僅可以解決傳統(tǒng)表型鑒定難以快速并準(zhǔn)確選擇2個(gè)及以上抗病基因個(gè)體的問題，還能加速抗病育種進(jìn)程，提高育種效率，為小麥抗病育種提供抗性更廣譜且更持久的種質(zhì)材料。這對(duì)于減少小麥生產(chǎn)損失，降低農(nóng)藥用量，提升社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，以及保障國(guó)家糧食安全均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。