向立剛，李文紅，鄭 蘋，李鳳良，汪漢成，余知和

（1. 長江大學 農(nóng)學院，湖北 荊州 434025；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；3. 貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081；4. 長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025）

小菜蛾[Plutella xylostella（Linnaeus）]是一種以十字花科植物為主要寄主的世界性遷飛害蟲[1]，其幼蟲取食會降低作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，嚴重制約著十字花科作物的生產(chǎn)。全球每年因小菜蛾造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元[2]。目前，對于小菜蛾的防治仍以化學防治為主，但由于殺蟲劑的連續(xù)、大量使用加速了小菜蛾抗藥性的發(fā)展。研究表明，小菜蛾在我國不同地區(qū)對氰戊菊酯[3]、氯蟲苯甲酰胺[4]、阿維菌素[5]和高效氯氰菊酯[6]等藥劑已產(chǎn)生了不同程度的抗性。因此，將高效、低毒殺蟲劑與常用藥劑交替使用有利于降低小菜蛾對各類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的速度和程度，對保證作物生產(chǎn)安全具有重要的現(xiàn)實意義。

殺蟲劑在發(fā)揮其作用的同時必定會影響昆蟲腸道微生物的組成和生理代謝活動[7-9]。研究表明，擬除蟲菊酯類殺蟲劑可降低棉鈴蟲腸道中有益菌相對豐度，增加致病菌相對豐度，并影響腸道菌群代謝能力[10]。在長期氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺選擇壓力下，小菜蛾抗性品系較敏感品系腸道中的變形菌門豐度增加，厚壁菌門豐度降低[11]。LI 等[12]研究表明，溴氰菊酯的長期作用增加了麥芽香肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）在小菜蛾腸道中的相對豐度?；瘜W藥劑可影響宿主昆蟲腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝功能，腸道菌群也可促進宿主降解有害物質(zhì)[13]、產(chǎn)生抗藥性[14]以及抵御病原微生物入侵[15]。如斯氏按蚊（Anopheles stephensi）腸道細菌可參與有機磷殺蟲劑的降解[16]，橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）腸道中檸檬酸桿菌（Citrobacter）在敵百蟲的降解中起著關(guān)鍵作用[17]。

溴氰蟲酰胺為雙酰胺類殺蟲劑，自2012年上市以來便被廣泛應(yīng)用于小菜蛾的防治，且防治效果良好[18]，但目前也有部分地區(qū)的小菜蛾對其產(chǎn)生了抗藥性[19-20]。前人研究表明，腸道微生物在昆蟲抗藥性方面發(fā)揮著重要作用，但目前鮮有關(guān)于小菜蛾腸道微生物群落的研究報道，而溴氰蟲酰胺作用下小菜蛾腸道微生物群落的研究更少。為此，采用分離培養(yǎng)技術(shù)、高通量測序技術(shù)以及Biolog-ECO 碳源代謝表型技術(shù)，探究溴氰蟲酰胺處理對小菜蛾腸道微生物群落結(jié)構(gòu)以及代謝功能的影響，旨在為延緩小菜蛾對溴氰蟲酰胺的抗藥性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試小菜蛾為貴州省植物保護研究所昆蟲研究室室內(nèi)長期不接觸任何藥劑飼養(yǎng)的單一敏感品系。

97%溴氰蟲酰胺（Cyantraniliprole）原藥由美國杜邦公司提供。其余儀器、耗材信息如下：Biolog GEN ⅢOmnilog 全自動微生物鑒定系統(tǒng)（BIOLOG公司）、Biolog-ECO 碳源代謝板（BIOLOG 公司，#1506）、超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientifc公司，NanoDrop 2000）、營養(yǎng)瓊脂（Solarbio 公司，N8290）、PCR 儀（Applied Biosystems 公 司，Veriti 9902）、TGrinder 第3 代 變 速 組 織 研 磨 器 套 裝（TIANGEN 公司，OSE-Y50）、基因組DNA 提取試劑盒（Omega Bio-Tek公司，D5625-01）。

1.2 方法

1.2.1 溴氰蟲酰胺對小菜蛾的毒力測定 采用浸葉法測定小菜蛾對溴氰蟲酰胺的敏感性。先用97 mL 含9.7 mL 10% TritonX-100 的丙酮將0.01 g 97%的溴氰蟲酰胺配制成100 mg/L 的母液，再用無菌水將待測藥劑分別稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/L 待用；用剪刀將甘藍葉剪成直徑9 cm 的圓片狀，分別于不同質(zhì)量濃度藥液中浸泡30 s，取出于陰涼處晾至表面無水痕，放入培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿一片甘藍葉，以浸泡含0.9%丙酮和0.1%TritonX-100無菌水的葉片為對照（CK）。挑取生長狀況一致的三齡小菜蛾幼蟲，放于培養(yǎng)皿中的葉片上，每皿10 頭，每個質(zhì)量濃度重復(fù)4 次。接蟲后，將培養(yǎng)皿置于（25±1）℃、光周期L∶D=16∶8 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后檢查并記錄小菜蛾的死亡數(shù)。采用DPS 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計算溴氰蟲酰胺對小菜蛾的毒力回歸方程及半致死質(zhì)量濃度（LC50）。

1.2.2 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌的影響測定 根據(jù)1.2.1 中敏感性測定結(jié)果，選取1 mg/L溴氰蟲酰胺對小菜蛾進行處理。將新鮮甘藍葉片在溴氰蟲酰胺藥液中浸泡30 s，取出晾干至表面無水痕，放入小菜蛾飼養(yǎng)盒中，并接入生長一致的三齡小菜蛾幼蟲，以浸泡含0.9%丙酮和0.1% Triton-100 無菌水的新鮮甘藍葉片飼喂小菜蛾幼蟲作為對照。12 h 后，分別從溴氰蟲酰胺處理和對照中選取健康且生長一致的個體進行后續(xù)腸道樣品采集。在對照和溴氰蟲酰胺處理中分別隨機挑選健康且大小一致的小菜蛾幼蟲100 頭，稱取其質(zhì)量用于每克小菜蛾細菌群落數(shù)的計算。幼蟲饑餓2 h 后置于75%乙醇中體表消毒90 s，再用0.8%的生理鹽水沖洗3 次，最后在超凈工作臺上解剖挑取腸道。將對照與1 mg/L 溴氰蟲酰胺處理的幼蟲腸道置于2 mL無菌離心管中，加入1 mL 0.8%的生理鹽水，立即用組織研磨器進行勻漿處理。然后用生理鹽水將組織勻漿按照10-4、10-5、10-6進行稀釋涂板，將上述平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后根據(jù)菌落大小、顏色和形態(tài)等分離純化單菌落。

使用基因組DNA 提取試劑盒提取純化菌株基因 組DNA，以 提 取 的 總DNA 為 模 板，27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ ）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）為 引 物 擴 增16S rRNA 基因片段，PCR 反應(yīng)條件及體系參考夏曉峰等[21]的方法。將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn比對分析。

1.2.3 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道細菌群落結(jié)構(gòu)的影響測定 按1.2.2中的方法處理小菜蛾，對照和溴氰蟲酰胺處理分別隨機挑選小菜蛾幼蟲200 頭，收集腸道組織。采用基因組DNA 提取試劑盒提取小菜蛾幼蟲腸道細菌群落DNA，每樣品取50 頭幼蟲腸道，每組重復(fù)4 次（對照：CK1、CK2、CK3、CK4；溴氰蟲酰胺處理：CY12-1、CY12-2、CY12-3、CY12-4）。隨后采用超微量分光光度計檢測其質(zhì)量與濃度。以檢測合格的DNA 為模板，27F 和1492R 通用引物進行PCR 擴增，其擴增體系與程序參考YUAN等[22]的方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海派森諾生物科技有限公司，采用PacBio Sequel 平臺進行三代擴增子測序，測序后的生物信息學分析均在派森諾基因云平臺（https：//www.genescloud.cn/home）進行。

首先，通過QIIME2（2019.4）軟件qiime cutadapt trim-paired 程序切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；利用DADA2 進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體；采用Classify-sklearn 算法[23]將過濾后的序列與Silva 數(shù)據(jù)庫進行物種分類學注釋；使用qiime feature-table rarefy 功能對樣品中的序列進行抽平，用于后續(xù)Alpha、Beta 多樣性分析等；運用R 語言和ggplot2 包計算樣品微生物群落香農(nóng)（Shannon）[24-25]、辛普森（Simpson）[26]、Chao1[27]、物種豐富度（Observed species）、皮 諾（Pielou）[28]和 覆 蓋 度（Good’s coverage）[29]等Alpha 多樣性指數(shù)；通過R 語言和ape包等基于Bray-Curtis 距離[30]進行Beta 多樣性的主坐標分析（PCoA）；最后通過Python LEfSe 包、R 語言和ggtree 包將非參數(shù)的Kruskal-Wallis 以及Wilcoxon 秩和檢驗與線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)量相結(jié)合在LDA 閾值為3的情況下進行LEfSe物種差異分析[31]。

1.2.4 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道微生物代謝功能的影響測定 按1.2.2中的方法處理小菜蛾，對照和溴氰蟲酰胺處理分別隨機挑選小菜蛾幼蟲100 頭，收集腸道組織，加入1 mL 0.8%的生理鹽水，立即用組織研磨器進行勻漿處理，再用0.8%的生理鹽水定容至12 mL。最后，在無菌條件下將懸浮液加入到Biolog-ECO 碳源代謝板中，每孔100 mL，將接種好的ECO 碳源代謝板置于OmniLog 系統(tǒng)中28 ℃孵育并自動讀數(shù)。另取500 頭小菜蛾幼蟲，挑取腸道于15 mL 無菌離心管中，加入少量生理鹽水進行組織勻漿，定容至60 mL。分別取11.8 mL 組織懸浮液分裝至5 個無菌離心管中，并分別與0.2 mL 6 000、600、60、6、0 mg/L 溴氰蟲酰胺溶液混合，配制成最終測試質(zhì)量濃度為100、10、1、0.1、0 mg/L 的溴氰蟲酰胺腸道組織懸浮液。渦旋混勻后將其分別加入到5 塊Biolog-ECO 碳源代謝板中，于OmniLog 系統(tǒng)中28 ℃孵育并自動讀數(shù)，直至讀數(shù)恒定（96 h），讀數(shù)的大小反映微生物群落代謝能力的強弱?；贠mnilLog 讀數(shù)采用HemI 1.0 構(gòu)建腸道微生物代謝功能熱圖。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

溴氰蟲酰胺處理與對照間小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌總數(shù)目、門和屬水平細菌相對豐度、Alpha 多樣性指數(shù)以及腸道微生物群落碳源代謝能力的差異性檢驗均采用Duncan’s 新復(fù)極差法進行；利用Wilcoxon 秩和檢驗進行LEfSe 物種差異分析的顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰蟲酰胺對小菜蛾的毒力

本試驗所用小菜蛾為溴氰蟲酰胺敏感性品系，其毒力回歸方程為y=2.133 1x+6.801 9，LC50為0.143 mg/L。根據(jù)毒力測定結(jié)果及實際生產(chǎn)中往往擴大使用倍數(shù)的現(xiàn)實，后續(xù)將對小菜蛾進行處理的溴氰蟲酰胺質(zhì)量濃度設(shè)為1 mg/L。

2.2 小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌的數(shù)目與種類

腸道可培養(yǎng)細菌分離試驗結(jié)果表明，1 g對照小菜蛾的腸道細菌群落總數(shù)約為4.5×106cfu，1 g 1 mg/L 溴氰蟲酰胺處理小菜蛾的腸道細菌群落數(shù)約為2.4×106cfu，說明溴氰蟲酰胺處理顯著降低了小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌群落數(shù)（P＜0.05）。根據(jù)菌落形態(tài)，分別從溴氰蟲酰胺處理和對照中選取36株代表性純化菌株進行16S rDNA 鑒定分析。結(jié)果表明，對照36 株菌中4 株為血桿菌（Sanguibactersp.），32 株為蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）；溴氰蟲酰胺處理中10 株為血桿菌，26 株為蒙氏腸球菌。72 株菌的序列均上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫（基因登錄號：MZ869106—MZ869177）。

2.3 基于16S rRNA基因測序的小菜蛾腸道細菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 小菜蛾腸道細菌群落組成 原始序列經(jīng)過優(yōu)化處理之后，對照中能同時匹配到正向和反向引物的序列共37 989 條，單一樣本序列數(shù)在8 893～10 327 條，去噪后有效序列共32 049 條。溴氰蟲酰胺處理中能同時匹配到正向和反向引物的序列共38 359條，單一的樣本序列數(shù)在8 713～11 257條，去噪后有效序列共32 394 條。在97%的相似度水平對樣品序列進行OTU 聚類，結(jié)果表明，對照中4 個樣本共鑒定到細菌7 個門，4 個目，6 個科，31 個屬；溴氰蟲酰胺處理中4 個樣本共鑒定到細菌7 個門，4個目，35個科，60個屬。

在門水平，厚壁菌門（Firmicutes）為絕對優(yōu)勢菌，在正常小菜蛾（對照）腸道細菌群落中的相對豐度為94.0%，經(jīng)溴氰蟲酰胺處理后相對豐度顯著降低至74.0%（P＜0.05）；藍細菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）在對照小菜蛾腸道細菌群落中的相對豐度分別為3.4%、0.5%，而在溴氰蟲酰胺處理中二者相對豐度分別顯著增加至8.6%、2.5%（P＜0.05）；變形菌門（Proteobacteria）在對照小菜蛾腸道細菌群落中的相對豐度（0.8%）低于溴氰蟲酰胺處理（13.4%），且溴氰蟲酰胺處理CY12-1 和CY12-4 樣品中的變形菌門相對豐度明顯高于其他樣品（圖1A）。

在屬水平，腸球菌屬（Enterococcus）為絕對優(yōu)勢菌，溴氰蟲酰胺處理中其相對豐度（74.0%）顯著低于未經(jīng)處理的對照（94.0%）（P＜0.05）；對照小菜蛾腸道樣品中血桿菌屬（Sanguibacter，0.5%）和菖蒲屬（Acorus，0.11%）相對豐度顯著低于溴氰蟲酰胺處理（血桿菌屬2.5%，菖蒲屬0.34%）（P＜0.05）；假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、草螺菌屬（Herbaspirillum）、泛菌屬（Pantoea）、寡養(yǎng)單胞菌 屬（Stenotrophomonas）、鞘 氨 醇 桿 菌 屬（Sphingobacterium）、梭菌屬（Clostridium）只存在于溴氰蟲酰胺處理部分樣品中（圖1B）。

圖1 小菜蛾腸道細菌群落組成Fig.1 The composition of intestinal bacterial community of P.xylostella

2.3.2 小菜蛾腸道細菌群落的Alpha 多樣性

Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道細菌群落的多樣性（Shannon、Simpson 指數(shù)）、豐富度（Chao1、Observed species 指數(shù)）和均勻度（Pielou指數(shù)）均增加，而覆蓋度（Good’s coverage 指數(shù)）降低。對照小菜蛾腸道細菌群落Shannon、Simpson 指 數(shù) 分 別 為2.02、0.67，Chao1、Observed species指數(shù)均為12.23，Pielou指數(shù)為0.56，Good’s coverage 指數(shù)為0.999 978；溴氰蟲酰胺處理小菜蛾腸道細菌群落Shannon、Simpson、Chao1 和Observed species 指數(shù)均顯著增加，分別為2.95、0.78、26.98、26.95，Pielou 指數(shù)雖有增加但與對照無顯著差異，Good’s coverage指數(shù)較對照降低，但無顯著差異（圖2）。

圖2 屬水平上小菜蛾腸道細菌群落Alpha多樣性指數(shù)Fig.2 Alpha diversity index of intestinal bacterial community of P.xylostella at genus level

2.3.3 小菜蛾腸道細菌群落的Beta 多樣性 基于Bray-Curtis 距離的細菌群落主坐標分析（PCoA）如圖3 所示，對照組4 個樣品聚集在一起，表明對照組小菜蛾腸道細菌類群組成相似；而溴氰蟲酰胺處理4個樣品間細菌類群組成差異較大，尤其CY12-1與其余3個樣品間差異較大。溴氰蟲酰胺處理組與對照組樣品在圖中被明顯區(qū)分開，表明溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道菌群組成與對照組存在較大差異。

圖3 小菜蛾腸道細菌群落的主坐標分析Fig.3 Principal coordinates analysis of intestinal bacterial community of P.xylostella

2.3.4 小菜蛾腸道細菌群落的物種差異分析

LEfSe 物種差異分析結(jié)果表明，在LDA 閾值為3的情況下，厚壁菌門、腸球菌屬、桿菌綱（Bacilli）、乳桿 菌 目（Lactobacillales） 和 腸 桿 菌 科（Eenterobacteriaceae）的細菌在對照中高于溴氰蟲酰胺處理，為對照的標志菌群。藍細菌門、假單胞菌目（Pseudomonadales）、放線菌門、血桿菌屬、血桿菌科（Sanguibacteraceae）、放線菌綱（Actinobacteria）、放 線 菌 目（Actinomycetales）、伯 克 氏 菌 目（Burkholderiales）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、菖蒲屬、立克次氏體目（Rickettsiales）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）在溴氰蟲酰胺處理中的相對豐度高于對照，為溴氰蟲酰胺處理的標志菌群（圖4）。

圖4 小菜蛾腸道細菌群落的LEFSe物種差異分析Fig.4 LEFSe species difference analysis of intestinal bacterial community of P.xylostella

2.4 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道微生物代謝功能的影響

以1 mg/L 溴氰蟲酰胺處理的甘藍葉飼喂小菜蛾后，小菜蛾腸道菌群對α-環(huán)糊精、D-纖維二糖、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄糖胺、4-羥基苯甲酸、L-絲氨酸和苯基乙胺的代謝能力降低，對葡萄糖-1-磷酸鹽、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、D-蘋果酸和L-精氨酸的代謝能力增加（圖5A）。

在0.1 mg/L和1 mg/L溴氰蟲酰胺的直接脅迫作用下，小菜蛾腸道微生物對ECO 碳源代謝板中31種碳源代謝的能力與對照（0 mg/L）無顯著差異，對衣康酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-蘇氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸的代謝能力略微降低。在10 mg/L 溴氰蟲酰胺直接脅迫下，腸道微生物對吐溫40、吐溫80、糖原、D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D，L-α-甘油磷酸鹽、i-赤蘚糖醇、γ-羥基丁酸、α-丁酮酸、L-絲氨酸和苯基乙胺12種碳源代謝能力與對照無明顯差異，對于剩余19 種碳源的代謝能力均有不同程度的降低。在100 mg/L 溴氰蟲酰胺脅迫下，小菜蛾腸道微生物群落對于31種碳源的代謝能力均降低，且對i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、4-羥基苯甲酸、L-蘇氨酸等多數(shù)碳源的代謝能力降低顯著（圖5B）。

圖5 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道菌群代謝功能的影響Fig.5 The effects of cyantraniliprole on the metabolic function of intestinal microflora in P.xylostella

3 結(jié)論與討論

腸道微生物在小菜蛾的生長發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，腸道菌群的紊亂會導(dǎo)致宿主免疫調(diào)節(jié)能力、取食消化能力以及病原清除能力降低[32]。本研究表明，溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道微生物的群落組成及代謝功能均存在影響。沈金紅等[33]發(fā)現(xiàn)，抗生素處理可清除小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌，而本研究中溴氰蟲酰胺處理只是顯著降低了小菜蛾腸道中部分可培養(yǎng)細菌數(shù)量，未能完全將其清除，可能是因為溴氰蟲酰胺主要是作用于昆蟲本身，對腸道菌群的影響不及抗生素。相關(guān)研究表明，小菜蛾腸道可分離的細菌包括沙雷氏菌屬（Serratia）、腸桿菌屬（Enterobacter）、寡氧單胞菌屬、香味菌屬（Myroides）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）和腸球菌屬等[12，21，34]。而本試驗中只分離出血桿菌和蒙氏腸球菌2 類，這可能是受到了培養(yǎng)基和分離條件的限制，后續(xù)將通過增加培養(yǎng)基類型、優(yōu)化培養(yǎng)條件，從而分離出更多的腸道細菌。蒙氏腸球菌除了在小菜蛾腸道中大量存在外，在家蠶[35]、粉紋夜蛾[36]以及棉鈴蟲[37]等昆蟲腸道中也有分布。推測該細菌可能是昆蟲腸道中普遍存在的菌群，其對宿主的作用和功能有待后續(xù)深入研究。

不同藥劑對不同宿主昆蟲腸道微生物的影響不同，七氟菊酯和溴氰菊酯處理后棉鈴蟲腸道厚壁菌門和藍細菌門相對豐度升高，擬桿菌門相對豐度降低[10]。本研究中，高通量測序結(jié)果表明，對照小菜蛾腸道中厚壁菌門為最優(yōu)勢菌門，其相對豐度大于90%，這與LI 等[12]的研究結(jié)果一致。溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道厚壁菌門相對豐度降低，而變形菌門和藍細菌門相對豐度增加。屬水平上，腸球菌屬為所有樣品的優(yōu)勢菌屬，溴氰蟲酰胺飼喂處理后其相對豐度顯著降低。相關(guān)文獻表明，腸球菌屬可增加小菜蛾對毒死蜱的抗性[38]，而其是否能增加小菜蛾對溴氰蟲酰胺的抗性有待后續(xù)試驗進一步驗證。溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道微生物多樣性顯著提高，這可能是由于溴氰蟲酰胺處理后導(dǎo)致小菜蛾腸道環(huán)境改變，優(yōu)勢菌群數(shù)量降低，非優(yōu)勢菌群數(shù)量增加。

前人研究表明，碳源代謝能力與微生物數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系[39]。小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌分離結(jié)果表明，溴氰蟲酰胺浸葉飼喂后的小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)低于對照，因此，其碳源代謝能力低于未經(jīng)溴氰蟲酰胺處理的小菜蛾腸道微生物。通過Biolog-ECO 碳源代謝表型試驗還發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺浸葉飼喂處理對小菜蛾腸道菌群碳源代謝的影響高于溴氰蟲酰胺直接對腸道菌群的作用。這可能是因為溴氰蟲酰胺是一種內(nèi)吸性殺蟲劑，并未直接作用于微生物群落本身，而是通過降低小菜蛾自身的機能、改變腸道環(huán)境，最終影響腸道微生物的數(shù)量以及代謝能力。據(jù)報道，植物葉際微生物對植食性昆蟲腸道菌群的形成有著重要的作用[40]，GAYATRI PRIYA 等[41]研究表明，棉鈴蟲腸道細菌可能源于其寄主植物葉片。因此，推測溴氰蟲酰胺是通過降低小菜蛾取食量引起腸道菌群數(shù)量下降，從而降低小菜蛾腸道微生物的碳源代謝能力，該假設(shè)將在后續(xù)研究中加以驗證。

本研究通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)、高通量測序技術(shù)以及代謝表型技術(shù)研究了溴氰蟲酰胺作用下小菜蛾腸道細菌群落組成以及微生物代謝能力的變化情況。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)果表明，小菜蛾腸道可培養(yǎng)優(yōu)勢細菌主要為蒙氏腸球菌和血桿菌，經(jīng)1 mg/L溴氰蟲酰胺浸葉飼喂處理后小菜蛾腸道可培養(yǎng)細菌數(shù)目顯著降低。高通量測序結(jié)果表明，厚壁菌門、藍細菌門和變形菌門為小菜蛾腸道優(yōu)勢細菌門，腸球菌屬和血桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。1 mg/L 溴氰蟲酰胺浸葉飼喂處理小菜蛾腸道中細菌群落多樣性、均勻度和豐富度均不同程度的增加。Biolog-ECO 代謝表型試驗結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度溴氰蟲酰胺無論是浸葉飼喂還是直接作用對小菜蛾腸道菌群的代謝能力均無明顯影響，而高質(zhì)量濃度溴氰蟲酰胺直接作用可降低腸道微生物的碳源代謝能力。