郭華陽(yáng) ，劉明鑒 , ，高 杰 ，朱克誠(chéng) ，劉寶鎖 ，郭 梁 ，張 楠 ，孫金輝 ，曾 辰 ，楊靜文 ，劉 波 ，張殿昌 ,

1. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572019

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300

4. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384

骨骼的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征是研究魚類進(jìn)化和分類的重要依據(jù)，其構(gòu)造和功能可為魚類環(huán)境學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。在魚類胚后發(fā)育過(guò)程中，其行為、形態(tài)及代謝等均不斷發(fā)生變化，其中以骨骼發(fā)育最為復(fù)雜。骨骼系統(tǒng)作為魚類支撐身體、協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和保護(hù)內(nèi)臟的重要組織，其形態(tài)、構(gòu)造及發(fā)育時(shí)序在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中均發(fā)生著改變[1]。特別是在魚類早期發(fā)育階段，骨骼發(fā)育與其攝食習(xí)性、游泳模式、外部形態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)，甚至骨骼是否正常發(fā)育直接影響魚類苗種的成活率及畸形率。目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者已對(duì)大瀧六線魚 (Hexagrammos otakii)[2]、金錢魚 (Scatophagus argus)[3]、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)[4]和鞍帶石斑魚 (Epinephelus lanceolatus)[5]等多種海水魚類的骨骼發(fā)育開(kāi)展了系統(tǒng)研究，表明魚類因種屬差異，其骨骼發(fā)育方面存在顯著差異。

尖翅燕魚 (Platax teira) 又稱長(zhǎng)鰭蝙蝠魚，屬鱸形目、刺尾魚亞目、白鯧科，原產(chǎn)于印度-太平洋，廣泛分布于亞熱帶和熱帶沿海地區(qū)；其性情溫順，游動(dòng)緩慢，屬于雜食性魚類，主要食物來(lái)源為藻類和小型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物[6]。幼魚體色黑白相間，背鰭、臀鰭和腹鰭較長(zhǎng)，形態(tài)優(yōu)美，有較高的觀賞價(jià)值；而成魚肌肉蛋白含量高、肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)較快，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7]。隨著人工繁育技術(shù)的發(fā)展，尖翅燕魚在中國(guó)和東南亞等國(guó)成功實(shí)現(xiàn)人工養(yǎng)殖，成為深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖最具發(fā)展?jié)摿Φ聂~類之一。目前關(guān)于尖翅燕魚的研究相對(duì)較少，僅見(jiàn)于消化器官發(fā)育[8]、肌肉成分[9]和幼魚異速生長(zhǎng)[7]等方面，而對(duì)其發(fā)育生物學(xué)相關(guān)研究尚未深入。本研究采用阿利新藍(lán)-茜素紅染色法對(duì)尖翅燕魚仔稚魚的骨骼進(jìn)行染色，研究了不同發(fā)育階段魚體的脊柱及附肢骨骼的系統(tǒng)發(fā)生，旨在為硬骨魚類進(jìn)化與分類等相關(guān)研究提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 親魚培育

實(shí)驗(yàn)親魚選自海南省陵水培育的3齡以上健康無(wú)傷、體表完整、活力好的尖翅燕魚親魚。親魚經(jīng)45 d營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化后，挑選性腺發(fā)育成熟的雌魚和雄魚各 10 尾，利用丁香酚 (30～50 mg·L?1) 麻醉后，注射催產(chǎn)針進(jìn)行人工催產(chǎn)。收集受精卵放入500 L錐形底孵化桶，充分曝氣，篩選出漂浮的優(yōu)質(zhì)受精卵，放入4 m×4 m 孵化袋中孵化。仔魚孵化出膜后，解開(kāi)孵化袋轉(zhuǎn)入室外高位池培育。苗種培育條件：溫度 (28±2) ℃、溶解氧質(zhì)量濃度>6.5 mg·L?1、鹽度和 pH 分別為 34‰～36‰和 7.8±0.5。餌料投喂策略見(jiàn)圖1。

圖1 尖翅燕魚培養(yǎng)過(guò)程中的飼養(yǎng)方案和日齡與全長(zhǎng)回歸方程Fig. 1 Feeding scheme and regression equation of age and full length during P. teira culture

1.2 樣品的采集和處理

每天早上在投喂前從高位池隨機(jī)取仔稚魚50尾，觀察并記錄仔稚魚形態(tài)變化和器官發(fā)育情況；同時(shí)利用丁香酚對(duì)仔稚魚進(jìn)行麻醉處理，待魚體完全麻醉后 (仔稚魚完全沉入燒杯底部) 轉(zhuǎn)入取樣瓶，并加入體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液4 ℃保存?zhèn)溆?。樣品采集持續(xù)至30日齡 (dah)。

1.3 骨骼染色方法

骨骼染色采用阿爾新藍(lán)-茜素紅染色法，在鄭攀龍[10]的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上稍做改進(jìn)，具體染色過(guò)程及方法見(jiàn)表1。骨骼染色后的仔稚幼魚樣品根據(jù)魚體大小選用光學(xué)顯微鏡 (Nikon Eclipse E100) 和體視顯微鏡 (Olympus SZ40) 進(jìn)行拍照觀察。

表1 阿爾新藍(lán)-茜素紅S染色法Table 1 Alcian blue and alizarin red S staining technique

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Photoshop 2020軟件對(duì)尖翅燕魚仔稚魚發(fā)育照片進(jìn)行處理，使用Image View軟件對(duì)其形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量；利用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)”表示；利用Excel 2020軟件對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，推算出尖翅燕魚仔稚魚全長(zhǎng)與日齡的關(guān)系回歸方程(圖 1)：y=2.232 6e0.0954x，R2=0.968 7，式中 x 為生長(zhǎng)天數(shù) (d)，y 為全長(zhǎng) (mm) 。

2 結(jié)果

2.1 尖翅燕魚生長(zhǎng)階段劃分

尖翅燕魚受精卵 [(1.29±0.09) mm] 在溫度為(26±0.3) ℃、鹽度和pH分別為34‰～36‰和7.8±0.5的條件下孵化，歷時(shí)27 h 45 min后仔魚孵化出膜。根據(jù)其胚后發(fā)育卵黃囊、體色、鰭條、骨骼發(fā)育以及其他形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，劃分為仔魚期 (0～17 dah)、稚魚期 (18～29 dah) 和幼魚期3個(gè)時(shí)期。仔魚期和稚魚期的劃分以各鰭條是否形成為依據(jù)。尖翅燕魚30 dah后進(jìn)入幼魚期，其鰭棘和鰭條發(fā)育完成，骨骼數(shù)目穩(wěn)定，形態(tài)與成魚無(wú)異，典型特征為頭部、軀干部和尾部各有3條黑色條帶，受到外界刺激時(shí)體色瞬間變?yōu)楹谏?(圖2)。

圖2 尖翅燕魚不同階段發(fā)育的過(guò)程注：a. 5 日齡仔魚；b. 21 日齡稚魚；c. 30 日齡幼魚；d. 30 日齡幼魚-應(yīng)激后。Fig. 2 Different developmental stages of P. teiraNote: a. 5 dah larva; b. 21 dah larva; c. 30 dah larva; d. 30 dah larva-after stress.

2.2 脊柱骨骼的發(fā)育

2 dah仔魚的脊柱骨骼處于未分化狀態(tài)，僅有1條呈管狀的脊索 (Nc)，此時(shí)身體呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)狀態(tài)(圖3-a)。該階段，仔魚僅依靠脊索來(lái)支撐身體結(jié)構(gòu)。隨著仔魚的生長(zhǎng)，脊索開(kāi)始發(fā)生自然彎曲，頭部與軀干部呈一定角度的彎曲。孵化后7 dah左右(圖3-b)，髓弓 (Na)、脈弓 (Ha) 開(kāi)始出現(xiàn)于表面，臨近頭部的髓弓和靠近泄殖腔的脈弓優(yōu)先發(fā)育，此時(shí)尾下骨的出現(xiàn)也標(biāo)志著脊柱發(fā)育的開(kāi)始。髓弓最初以突起的形式出現(xiàn)，隨著仔魚的生長(zhǎng)，突起逐漸愈合，最后形成椎體背側(cè)方的弓狀結(jié)構(gòu)。仔魚10 dah (圖3-c) 時(shí)尾桿骨已形成，位于尾部脊索上的脈弓、髓弓開(kāi)始以軟骨組織出現(xiàn)，且髓弓比脈弓出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)早一些。隨著魚類的生長(zhǎng)，脈弓和髓弓也隨之延伸，仔魚發(fā)育至15 dah時(shí)尾桿骨末端開(kāi)始上翹，此時(shí)髓棘 (Ns)、背肋 (Dr) 、腹肋 (Pr) 也開(kāi)始以軟骨組織的形式出現(xiàn) (圖3-d)。稚魚在23 dah左右時(shí)，脊柱前后端開(kāi)始出現(xiàn)硬骨環(huán)，此階段的稚魚開(kāi)始骨化，且髓棘、背肋、腹肋、髓弓、脈弓都以基部向末梢方向開(kāi)始硬骨化 (圖3-e)。30 dah尖翅燕魚進(jìn)入幼魚期，胸鰭、背鰭、腹鰭、臀鰭及各附肢鰭條發(fā)育完整，骨骼的發(fā)育過(guò)程基本完成 (圖3-f)。此階段的幼魚外表形態(tài)與成魚無(wú)異。

圖3 尖翅燕魚部分脊柱發(fā)育的過(guò)程注：a. 2 日齡仔魚；b. 7 日齡仔魚；c. 10 日齡仔魚；d. 15 日齡仔魚；e. 23 日齡仔魚；f. 30 日齡稚魚。Fig. 3 Development of partial vertebral column in P. teiraNote: a. 2 dah larvae; b. 7 dah larvae; c. 10 dah larvae; d.15 dah larvae; e. 23 dah larvae; f. 30 dah juvenile.

2.3 尾部骨骼的發(fā)育

尖翅燕魚初孵仔魚 (圖4-a) 到6 dah 仔魚尾部骨骼均未開(kāi)始發(fā)育，此期間尾板未出現(xiàn)且尾桿骨(Us) 也未上翹。7 dah仔魚尾桿骨逐漸上翹且第一批尾下骨 (Hy1) 開(kāi)始出現(xiàn) (圖4-b)。9 dah仔魚的第二批尾下骨 (Hy2) 開(kāi)始出現(xiàn)，同時(shí)尾下骨也開(kāi)始分化 (圖4-c)。13 dah仔魚尾桿骨上翹明顯，出現(xiàn)未骨化的脊髓；尾下骨 (Hy) 數(shù)量開(kāi)始增多，尾下骨及尾旁骨也明顯增大且邊界逐漸模糊，尾下骨之間呈現(xiàn)愈合趨勢(shì)；尾部骨骼被尾索分成上下兩部分，由2枚尾上骨 (Ep)、5枚尾下骨和 1 枚尾桿骨組成；尾索上部的鰭皺演變成鰭條軟骨，尾鰭 (Cf)鰭條數(shù)量逐漸增加至18條；尾部脊索的礦化還未開(kāi)始 (圖4-d)。尖翅燕魚發(fā)育到18 dah 時(shí)，尾部繼續(xù)增大，出現(xiàn)原始的叉尾，尾桿骨繼續(xù)上翹；鰭條數(shù)量由18增加至22條，鰭條附著于尾旁骨、尾上骨和尾下骨的末端 (圖4-e)。25 dah稚魚尾部骨骼發(fā)育基本完全，且尾鰭鰭條數(shù)量基本穩(wěn)定在22條。此階段稚魚的尾骨骨骼除未骨化外，與成魚基本無(wú)異 (圖4-f)。

圖4 尖翅燕魚尾鰭的發(fā)育過(guò)程注：a. 2 日齡仔魚；b. 7 日齡仔魚；c. 9 日齡仔魚；d. 13 日齡仔魚；e. 18 日齡仔魚；f. 25 日齡稚魚。Fig. 4 Development of caudal fin in P. teiraNote: a. 2 dah larva; b. 7 dah larva; c. 9 dah larva; d. 13 dah larva; e. 18 dah larva; f. 25 dah juvenile.

2.4 背鰭和臀鰭的發(fā)育

尖翅燕魚發(fā)育至8 dah時(shí) (圖5-c)，背鰭出現(xiàn)14枚近端橈骨 (Rx)，這標(biāo)志著背鰭開(kāi)始發(fā)育。仔魚發(fā)育至9 dah時(shí) (圖5-d)，遠(yuǎn)端橈骨 (Rd) 清晰可見(jiàn)，此時(shí)近端橈骨達(dá)到29枚并且往背下增長(zhǎng)，遠(yuǎn)端橈骨往上伸長(zhǎng)。13 dah時(shí) (圖5-e)，背鰭的擔(dān)鰭骨 (Pte) 開(kāi)始出現(xiàn)，遠(yuǎn)端橈骨達(dá)到36枚，已初步形成背部鰭條 (Dfr)，鰭棘數(shù)目基本穩(wěn)定。發(fā)育到26 dah時(shí) (圖5-f)，背鰭呈扇形繼續(xù)伸長(zhǎng)，此時(shí)近端橈骨從基部向末梢骨化，遠(yuǎn)端橈骨仍為軟骨。

圖5 尖翅燕魚背鰭、臀鰭、胸鰭和腹鰭的發(fā)育過(guò)程注：a. 2 日齡仔魚；b. 4 日齡仔魚；c. 8 日齡仔魚；d. 9 日齡仔魚；e. 13 日齡仔魚；f. 26 日齡稚魚。Fig. 5 Development of the dorsal, anal, pectoral and pelvic fins of P. teiraNote: a. 2 dah larva; b. 4 dah larva; c. 8 dah larva; d. 9 dah larva; e. 13 dah larva; f. 26 dah juvenile.

尖翅燕魚在8 dah時(shí) (圖5-c)，靠近泄殖孔處出現(xiàn)10枚近端橈骨，這標(biāo)志著臀鰭開(kāi)始發(fā)育。仔魚到9 dah時(shí) (圖5-d)，近端橈骨達(dá)到21枚，從泄殖孔向尾部伸長(zhǎng)，此時(shí)遠(yuǎn)端橈骨開(kāi)始出現(xiàn)，數(shù)量為16枚左右。同樣在13 dah時(shí) (圖5-e)，仔魚臀部出現(xiàn)擔(dān)鰭骨，臀鰭近端橈骨維持在26枚左右，遠(yuǎn)端橈骨往外伸展形成臀鰭 (Afr)。發(fā)育到26 dah時(shí) (圖5-f)，臀鰭近端橈骨從基部向末梢骨化，此階段臀鰭遠(yuǎn)端橈骨仍為軟骨。

2.5 胸鰭和腹鰭的發(fā)育

胸鰭為尖翅燕魚最早發(fā)育的附肢骨骼，初孵仔魚可觀察到胸鰭支鰭骨原基 (Fp)，主要為烏喙骨-肩胛軟骨 (圖5-a)。仔魚在4 dah時(shí)，可清晰看到上匙骨 (Suc)、后匙骨 (Poc) 以及匙骨 (Cl)，支鰭骨原基中間出現(xiàn)一條明顯的裂縫 (圖5-b)。隨著匙骨和支鰭骨原基繼續(xù)發(fā)育，直至13 dah支鰭骨原基出現(xiàn)數(shù)條裂縫，成為最初的胸鰭 (Fr) (圖5-e)。稚魚發(fā)育至26 dah時(shí)，其胸鰭骨骼呈扇形，鰭條形態(tài)和數(shù)量與幼魚相比基本沒(méi)有差異 (圖5-f)，胸鰭發(fā)育直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束尚未完全骨化。

尖翅燕魚腹鰭支鰭骨原基 (Pt) 在4 dah時(shí)開(kāi)始出現(xiàn) (圖5-b)。8 dah仔魚的腹鰭支鰭骨已經(jīng)開(kāi)始著生腹鰭條 (Pfr)，此時(shí)鰭條數(shù)目為4枚，并隨著仔魚的生長(zhǎng)鰭條逐漸增長(zhǎng) (圖5-c)。發(fā)育至26 dah時(shí)，腹鰭變得細(xì)長(zhǎng)，形態(tài)與幼魚相比無(wú)異，但仍未完成骨化 (圖5-f)。

3 討論

魚類的骨骼根據(jù)生長(zhǎng)部位可劃分為兩大類：附肢骨骼和主軸骨骼，其中附肢骨骼根據(jù)奇偶鰭數(shù)分為奇鰭骨骼和偶鰭骨骼，主軸骨骼分為脊柱和頭骨[2]。魚類早期骨骼發(fā)育會(huì)經(jīng)歷一系列的變化，不同類型的骨骼發(fā)育時(shí)序也存在顯著差異。不同種屬間的魚類骨骼發(fā)育差異明顯，大瀧六線魚從27 dah起脊柱骨骼開(kāi)始骨化，50 dah時(shí)骨化完成[11]。卵形鯧鲹脊柱骨骼從9 dah時(shí)開(kāi)始礦化，直至18 dah時(shí)礦化完成[12]。本研究中尖翅燕魚在23 dah時(shí)開(kāi)始骨化，直至發(fā)育至幼魚骨骼礦化還未完成。不同種屬魚類脊椎骨骼的椎骨數(shù)量也不大相同，王永梅等[13]對(duì)157種鯉形目魚類的脊椎骨研究發(fā)現(xiàn)，鯉形目魚類總脊椎骨數(shù)為30～52 。本研究中尖翅燕魚的脊椎骨數(shù)量與王秋榮等[14]報(bào)道的青石斑魚 (E.awoara) 相一致，均為24枚。此外，同科不同屬魚類的脊椎骨骼也存在明顯差異，李仲輝和楊太有[15]發(fā)現(xiàn)尖吻鱸 (Lates calcarifer) 和大口黑鱸 (Micropterus salmoides) 脊椎骨數(shù)目存在較大差異，導(dǎo)致兩者的生物學(xué)特征有很大區(qū)別，這說(shuō)明魚類早期的脊椎骨數(shù)目與其生物學(xué)特性相關(guān)。

研究表明，大多數(shù)魚類的尾部骨骼結(jié)構(gòu)和數(shù)量基本相同，極少數(shù)魚類的尾部骨骼存在差異[16]。大多數(shù)海水魚類尾部骨骼由5 枚尾下骨和 2枚或以上的尾上骨構(gòu)成[17-18]。如卵形鯧鲹[10]和大瀧六線魚[19]尾部骨骼均有5枚尾下骨，金錢魚[5]尾部骨骼由3枚尾上骨和6枚尾下骨構(gòu)成，而塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)[20]尾部骨骼僅有1枚尾上骨，且缺少尾神經(jīng)骨。尖翅燕魚和大部分海水魚類一樣，尾部骨骼由5枚尾下骨和2枚尾上骨構(gòu)成。

不同種類魚的骨骼發(fā)育時(shí)序有所不同[21]。尖翅燕魚與褐點(diǎn)石斑魚 (E. fuscoguttatus)[22]、尖吻鱸[23]和黃姑魚 (Nibea albiflora)[24]等其他海水魚相比，脊柱和胸鰭在出膜前已開(kāi)始發(fā)育，這與其受精卵卵徑和油球較大、孵化時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。魚類受精卵儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和孵化時(shí)間為胚內(nèi)骨骼發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)。魚類早期骨骼發(fā)育時(shí)序性也與生活習(xí)性和環(huán)境相關(guān)。例如，鲹科魚類游速較快、爆發(fā)性游泳能力強(qiáng)，其脊柱和尾部骨骼發(fā)育相對(duì)較早，能較快地適應(yīng)環(huán)境[25]。大菱鲆 (Scophthalmus maximus)在孵化后12～13 dah 脊柱和尾部骨骼開(kāi)始發(fā)育，此時(shí)底棲生活習(xí)性形成[26]。鄧平平等[27]在對(duì)褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus) 的研究中也得到相似的結(jié)果。

尖翅燕魚初孵仔魚已具備間歇性游泳能力，孵化后卵黃囊勉強(qiáng)能支撐仔魚存活5～6 d，所以在內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)消耗完之前，必須具備游泳和捕食能力。胸鰭和尾鰭作為游泳器官，可為魚類攝食提供動(dòng)力，一般優(yōu)先發(fā)育。刀鱭 (Coilia ectenes) 在油球完全消耗完之前具備自主攝食能力，其胸鰭早在卵黃囊階段便開(kāi)始發(fā)育[28]。青鳉 (Oryzias latipes) 的胸鰭發(fā)育也發(fā)生在孵化成仔魚之前[29]。尖翅燕魚初孵仔魚直接存在支鰭骨原基，在4 dah時(shí)已具備在靜水中平衡和左右擺動(dòng)的能力；7 dah仔魚尾部開(kāi)始發(fā)育，游泳能力明顯增強(qiáng)，攝食餌料和逃避天敵的能力也有所提高，生存能力和生長(zhǎng)速度增加；仔魚發(fā)育至13 dah時(shí)，其骨骼數(shù)目基本穩(wěn)定，之后開(kāi)始不同程度的骨化。此外，仔魚骨骼發(fā)育直接影響魚類餌料的轉(zhuǎn)換過(guò)程，早期骨骼發(fā)育有利于增強(qiáng)魚體的游泳和攝食能力，可顯著提高餌料轉(zhuǎn)換期間仔魚的成活率。由此可見(jiàn)，魚類的骨骼發(fā)育除與其生活習(xí)性息息相關(guān)之外，同時(shí)也受養(yǎng)殖環(huán)境的影響，是其生理功能與環(huán)境適應(yīng)的產(chǎn)物。本研究系統(tǒng)地開(kāi)展了尖翅燕魚仔稚魚的骨骼發(fā)育研究，掌握了魚體早期發(fā)育過(guò)程中骨骼的系統(tǒng)發(fā)生，為尖翅燕魚苗種繁育、環(huán)境適應(yīng)和分類鑒定等研究提供了理論基礎(chǔ)。