周 南 ,王亞坤,洪坤浩,魏 捷,于凌云 ,朱新平
1. 浙江海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,浙江 舟山 316000
2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室,廣東 廣州 510380
羅氏沼蝦 (Macrobrachium rosenbergii) 隸屬長臂蝦科、沼蝦屬。原產(chǎn)于東南亞,20世紀(jì)70年代末引進(jìn)國內(nèi),因其生長快、個體大且風(fēng)味鮮美,逐漸成為淡水養(yǎng)殖的主要品種之一[1]。與其他甲殼類動物一樣,羅氏沼蝦也表現(xiàn)性別兩態(tài)性:同齡雌、雄蝦個體的大小、生長速度相差懸殊,在相同養(yǎng)殖條件下雄蝦生長速度較雌蝦快,性成熟后的個體平均體質(zhì)量約是雌蝦的2倍[2-3];此外,筆者發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量僅為6 g的雌蝦和僅2 g的雄蝦也有部分個體達(dá)性成熟,這些性早熟個體提前產(chǎn)生配子、交配繁殖會導(dǎo)致大量的能量損耗,造成個體發(fā)育停滯、大小不一。因此,開展羅氏沼蝦生殖發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理的研究對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。當(dāng)前,在羅氏沼蝦性別發(fā)育方面已有一定的研究基礎(chǔ),如在挖掘生殖發(fā)育相關(guān)基因方面,已獲得了AG、Dmrt、vasa、GnRH、IAG、IAGBP等基因[4-11];在基因功能及其應(yīng)用方面,將IAG基因的dsRNA注射到羅氏沼蝦幼體中,首次成功在甲殼類動物上獲得性逆轉(zhuǎn)的偽雌個體,其與正常雄性個體雜交后能獲得全雄個體[12]。上述研究證實這些基因在羅氏沼蝦性別發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。然而與脊椎動物相比[13-14],羅氏沼蝦生殖發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理的研究仍相對薄弱。
在前期工作中,筆者在羅氏沼蝦性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中快速篩選到一個與脊椎動物生殖發(fā)育高度相關(guān)的候選基因——nanos。Nanos是一種RNA結(jié)合蛋白,具有2個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域 (-CCHC-),其在生殖發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[15]。作為一個具有母源效應(yīng)的基因,nanos基因在不同物種中存在不同的同源物及調(diào)節(jié)功能;如在果蠅 (Drosophila) 中,nanos基因擁有1個同源基因,該基因?qū)ι臣?xì)胞的遷移、體細(xì)胞的抑制以及干細(xì)胞自我修復(fù)的維護(hù)起重要作用[16];而在線蟲 (Caenorhabditis elegans) 中發(fā)現(xiàn)該基因有3種nanos同源物 (nanos1、nanos2、nanos3),其中nanos1和nanos2可維持生殖細(xì)胞的生存能力[17],而nanos3在雌雄同體的線蟲中主要控制著雌雄性別轉(zhuǎn)換[18];在脊椎動物斑馬魚 (Danio rerio) 中,nanos1基因在胚胎發(fā)育時期負(fù)責(zé)原始生殖細(xì)胞的存活,在成體斑馬魚中維持卵母細(xì)胞的生存;而在小鼠 (Mus musculus) 中,nanos2和nanos3在生殖細(xì)胞生長發(fā)育中起作用,敲降nanos2基因會導(dǎo)致雄性小鼠的精原細(xì)胞喪失以及精子質(zhì)量下降,而阻斷nanos3的表達(dá)則可完全導(dǎo)致兩性生殖細(xì)胞的發(fā)育停滯[19-20]。此外,nanos基因家族的表達(dá)模式因物種差異也存在不同;如海葵 (Nematostella vectensis) 的 nanos基因在早期胚胎的多種體細(xì)胞中表達(dá)[21];而在水螅 (Hydra) 中,nanos存在于多功能的間質(zhì)細(xì)胞中,這類細(xì)胞最后分化成不同的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞[22]。在甲殼類動物中nanos家族基因的研究較為薄弱,僅見在河南華溪蟹 (Sinopotamon henanense) 中獲得了nanos1和nanos2基因,并推測其對卵巢發(fā)育起重要調(diào)控作用[23]。其次,在公共數(shù)據(jù)庫中搜索到中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis)、凡納濱對蝦 (Penaeus vannamei)、美洲鉤蝦 (Hyalella actecananos) nanos基因及其同源物的序列。為了解nanos1基因在羅氏沼蝦生殖發(fā)育中的功能,本研究從羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中獲得nanos1基因序列并擴(kuò)增,隨后進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及預(yù)測,并對該基因在羅氏沼蝦不同組織和不同胚胎發(fā)育時期以及幼體時期進(jìn)行表達(dá)模式與表達(dá)水平分析,最后通過原位雜交技術(shù)對該基因的mRNA表達(dá)分布進(jìn)行亞細(xì)胞定位,以期為羅氏沼蝦生殖發(fā)育的機(jī)制研究提供參考。
選取3月齡健康的羅氏沼蝦 (購自佛山三水白金有限公司) 雌、雄各20尾進(jìn)行解剖。分別采集腦、肝胰腺、心臟、肌肉、性腺、鰓、腸和眼等組織,放入液氮中速凍,隨后轉(zhuǎn)入—80 ℃冰箱保存,用于各組織RNA的提取;取部分性腺組織,放入波恩氏液中固定8 h后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中,于4 ℃冰箱保存,用于石蠟切片;采集卵、胚胎發(fā)育和早期發(fā)育不同時期的樣品,放入液氮中速凍,于—80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)實驗。
將采集的組織進(jìn)行裂解,使用Eastep?Super試劑盒 (Promega,中國) 提取總RNA,RNA的濃度和純度由Nano QTM分光光度計進(jìn)行測定 (Thermo,美國),其完整性由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,將合格的RNA保存于—80 ℃冰箱中。隨后使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Invitrogen,美國) 進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)錄和合成。
根據(jù)本實驗室羅氏沼蝦性腺轉(zhuǎn)錄組測序所得的nanos1基因 (Mrnanos1) cDNA序列 (序列未公布),設(shè)計上下游特異引物nanos1 F和nanos1 R(表1)。以性腺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃90 s,38個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用Gel Extraction Kit (Omega,中國) 試劑盒回收。然后將目的片段連接至pMD19-T (TaKaRa,中國) 載體,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞 (TaKaRa,中國) 中克隆篩選,并將陽性克隆菌株送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測序,測序后進(jìn)行比對,將比對一致的陽性菌株擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,于—20 ℃冰箱中保存。
利用Sequence Manipulation Suite (SMS) (http://www.bio-soft.net/sms/) 分析nanos1核苷酸和氨基酸序列,用簡單模塊化體系結(jié)構(gòu)研究工具 (SMART)(http://smart.embl-heidelberg.de/) 預(yù)測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,通過NCBI中的BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對MrNanos1氨基酸序列與其他物種的Nanos蛋白家族氨基酸序列進(jìn)行同源比對,用DNAMAN和BioEdit進(jìn)行多個序列比對分析;采用MEGA 7.0軟件中的最大似然法 (Maximum Likelihood Estimate, MLE) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
根據(jù)Mrnanos1序列,設(shè)計引物nanos1 F和nanos1 R (表1),并以β-actin 為內(nèi)參基因 (Gen-Bank No: AY626840),以腦、肝胰腺、心臟、肌肉、性腺 (雌、雄)、鰓、腸和眼組織的cDNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增 (Labcycle Standard,德國),以確定Mrnanos1在不同組織中的表達(dá)分布。反應(yīng)程序為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,38 個循環(huán);72 ℃ 延伸 10 min。RT-PCR產(chǎn)物由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離,并使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照 (GenoSens2200,中國)。
提取 (卵) 未受精期、(卵) 受精期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、前溞狀幼體期、溞狀幼體期、幼體期的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增以確定Mrnanos1在卵、胚胎和早期發(fā)育時期的表達(dá)模式,每組3個平行,引物見表1。反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40 個循環(huán)。溶解曲線程序為:95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。顯著性分析采用SPSS 13.0軟件的Duncan's法進(jìn)行多重比較,當(dāng)P<0.05時差異顯著。
使用 E.Z.N.A.?Plasmid DNA Mini Kit I試劑盒(OMEGA,中國) 提取羅氏沼蝦nanos1 cDNA片段質(zhì)粒,用回收的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物參照表1;切膠回收,用Eastep?Gel and PCR Cleanup Kit試劑盒 (Eastep,中國) 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,用分光光度計檢測濃度。使用SP6/T7 Enzyme Mix(Roche, Germany)、Digoxigenin (DIG) RNA Labeling 試劑盒 (Roche,德國) 依照說明書合成正、反義探針。將1.1中脫水保存的組織樣品復(fù)水處理后,用石蠟進(jìn)行包埋,使用石蠟切片機(jī) (FECIA徠卡輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)RM2016,中國) 進(jìn)行連續(xù)切片,切片厚度5 μm,用石蠟攤片機(jī)和烘干機(jī) (浙江科迪儀器設(shè)備有限公司) 進(jìn)行展片和鋪片。隨后在二甲苯、乙醇中進(jìn)行脫蠟和脫水。連續(xù)切片后,一張石蠟切片用蘇木精、伊紅進(jìn)行染色 (HE),兩張石蠟切片用地高辛標(biāo)記的RNA探針 (正、反義探針) 進(jìn)行ISH處理。原位雜交具體操作步驟參照Yu等[24],有陽性信號后進(jìn)行封片。使用倒置熒光成像系統(tǒng)(Nikon Ri2,中國) 進(jìn)行觀察和拍照。
表1 本研究所用的全部引物Table 1 All primers used in this study
克隆獲得Mrnanos1基因 (GenBank No:ON155838) cDNA序列長為2 811 bp,5' 端非編碼區(qū) (UTR) 686 bp,3'-UTR 1 396 bp,開放閱讀框(ORF) 729 bp,編碼243個氨基酸。對 MrNanos1氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有兩個保守的-CCHC- (-Cys-Cys-His-Cys-) 鋅指結(jié)構(gòu)域,以及nanos家族特有的結(jié)構(gòu)功能域 (圖1)。
采用MEGA 7.0以最大似然法構(gòu)建nanos系統(tǒng)發(fā)育樹,并對Mrnanos1序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明,nanos基因家族分為了2個大支 (圖2):一個分支為Nanos1蛋白分支聚集,另一個為Nanos2和Nanos3蛋白分支聚集。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,MrNanos1與其他物種的Nanos1蛋白集合聚集在一起,且與中華絨螯蟹聚集在一個分支,本研究獲得的羅氏沼蝦nanos基因?qū)儆趎anos1基因家族。為了進(jìn)一步了解Mrnanos1基因的同源性,將MrNanos1氨基酸序列與魚類、兩棲動物和哺乳動物的氨基酸序列進(jìn)行比對和鑒定 (圖3)。發(fā)現(xiàn)Mrnanos1基因的鋅指序列與其他動物的高度同源。在Nanos1集簇中,Mrnanos1序列與中華絨螯蟹Nanos的同源性最高 (51%),與魚類的同源性較高,與青鳉(Oryzias latipes) nanos1a和大西洋鮭 (Salmo salar)nanos1的同源性分別為40.7%和46%,與非洲爪蟾 (Xenopus laevis)、小鼠和人 (Homo sapiens) 的nanos1分別有40%、22%和23%的相似性;而在Nanos2和Nanos3的聚類中顯示出較低的相似性。
圖2 MrNanos1氨基酸序列與其他物種Nanos家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of MrNanos1 amino acid sequence with Nanos family proteins of other species
圖3 羅氏沼蝦MrNanos1與其他物種鋅指區(qū)域結(jié)構(gòu)的比較Fig. 3 Multiple alignments analysis of zinc finger domain of MrNanos1 in M. rosenbergii and other species
為了解Mrnanos1在不同組織中的表達(dá)模式,以β-actin為內(nèi)參基因,利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測,分析Mrnanos1在正常雌雄個體的肝胰腺、心臟、性腺、肌肉、鰓、腸、腦和眼等不同組織中的表達(dá)分布 (圖4)。結(jié)果顯示,nanos1僅在卵巢中檢測到表達(dá),在雌性其他組織以及雄性的所有組織中均未見表達(dá)。
圖4 Mrnanos1基因在羅氏沼蝦不同組織中的表達(dá)分析Fig. 4 Expression analysis of Mrnanos1 gene in different tissues of M. rosenbergii
為了解Mrnanos1在卵、胚胎和早期發(fā)育過程中的表達(dá)模式,對卵、胚胎等樣品進(jìn)行了qPCR檢測 (圖 5)。結(jié)果顯示,Mrnanso1 mRNA 在 (卵) 未受精期表達(dá)量最高,顯著高于 (卵) 受精期,極顯著高于卵裂期和胚胎發(fā)育其他時期 (囊胚期、原腸期、前溞狀幼體期、溞狀幼體期) 及幼體期;在胚胎發(fā)育期間, (卵) 受精期表達(dá)量最高,顯著高于卵裂期且極顯著高于胚胎發(fā)育后期 (囊胚期、原腸期、前溞狀幼體期、溞狀幼體期);而該基因在卵裂期的表達(dá)水平顯著高于囊胚期、原腸期、前溞狀幼體期和溞狀幼體期;在囊胚期、原腸期、前溞狀幼體期、溞狀幼體期和幼體期表達(dá)水平較低且無顯著差異。
圖5 羅氏沼蝦nanos1在不同胚胎發(fā)育時期及早期幼體中的相對表達(dá)量注:字母不同表示同一時間各實驗組之間存在顯著性差異 (P<0.05)。Fig. 5 Relative expression level of nanos1 in different embryonic develomental stages and larvae of M. rosenbergiiNote: Different letters indicate significant difference among the experimental groups (P<0.05).
利用原位雜交技術(shù)研究Mrnanos1在羅氏沼蝦卵巢中的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,在羅氏沼蝦卵巢中,Mrnanos1 mRNA在卵母細(xì)胞中檢測到陽性信號,在Oc1、Oc2、Oc3、Oc4期的卵母細(xì)胞中陽性信號最強(qiáng) (圖6),在初級卵母細(xì)胞Oc1、Oc2、Oc3、Oc4期的陽性信號主要集中于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
圖6 Mrnanos1 mRNA 在羅氏沼蝦卵巢中的亞細(xì)胞分布注:a. 羅氏沼蝦卵巢切片 (HE 染色) ;b. 羅氏沼蝦卵巢切片 (反義探針結(jié)果);c. 羅氏沼蝦卵巢切片 (正義探針結(jié)果);d、e、f 分別為 a、b、c 中紅色方框內(nèi)的放大視野圖。Fig. 6 Subcellular localization of Mrnanos1 mRNA in ovary of M. rosenbergiiNote: a. Ovarian sections of M. rosenbergii (HE staining); b. Ovarian sections of M. rosenbergii (Antisense probe results); c. Ovarian sections of M. rosenbergii (Results of sense probe); d, e and f. The enlarged view in the red box of Fig. a, b and c, respectively.
本研究系統(tǒng)揭示了nanos1在甲殼類動物羅氏沼蝦中的表達(dá)模式,并對該基因的核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行了分析。羅氏沼蝦Mrnanos1 cDNA序列全長2 811 bp,共編碼243個氨基酸。對于大部分物種來說,Nanos1家族蛋白編碼的氨基酸個數(shù)在200~300之間,如在海葵中nanos1基因共編碼216個氨基酸[21],中華鱘 (Acipenser sinensis)nanos1共編碼228個氨基酸[25],小鼠[26]和人類[27]的nanos1基因分別編碼267和292個氨基酸;而在果蠅[28]中nanos基因編碼的氨基酸個數(shù) (401) 遠(yuǎn)大于上述物種;相反,在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)nanos1基因僅編碼128個氨基酸[29],上述研究表明Nanos蛋白家族的氨基酸長度會因物種不同而有所差異。此外,氨基酸序列的遺傳進(jìn)化分析顯示羅氏沼蝦的MrNanos1蛋白與其他物種的Nanos1家族蛋白聚為一類,并與其他物種的Nanos1氨基酸序列具有較高的相似性,其中與中華絨螯蟹的親緣性較高,以上結(jié)果說明本研究獲得的羅氏沼蝦nanos1基因?qū)儆趎anos1家族。此外,本研究也嘗試探討羅氏沼蝦是否含有其他不同的nanos家族,設(shè)計了不同方案并進(jìn)行了一系列嘗試,結(jié)果在羅氏沼蝦中并未獲得nanos2和nanos3家族相關(guān)基因,因此推測羅氏沼蝦nanos家族中僅有nanos1一種家族基因,且該基因在羅氏沼蝦的生殖發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。
在組織表達(dá)分析中,本研究發(fā)現(xiàn)Mrnanos1基因除在雌性性腺表達(dá)外,其他組織均未檢測到表達(dá),這種表達(dá)模式與以前報道的并不一致,如中華鱘的nanos1 基因除在肌肉和腸中未見表達(dá)外,廣泛表達(dá)于肝臟、性腺、脾臟、心臟、腎臟等組織中[24];同樣在無脊椎動物家蠶 (Bombyx mori) 中發(fā)現(xiàn)nanos基因也廣泛表達(dá)于性腺、血液、中腸等組織[30]。本研究的結(jié)果證明Mrnanos1基因是一個雌性性腺特異表達(dá)的基因,可以作為與羅氏沼蝦雌性生殖發(fā)育相關(guān)的一個特異性標(biāo)記基因。此外,在分析Mrnanos1在羅氏沼蝦未受精卵和不同胚胎發(fā)育時期以及幼體期的表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn),從未受精卵至所有的胚胎發(fā)育時期Mrnanos1均有表達(dá),且在未受精卵時期表達(dá)量最高,提示Mrnanos1基因是羅氏沼蝦的一個母源效應(yīng)基因,這與在文昌魚 (Branchiostoma floridae) 中的結(jié)果基本一致,nanos1作為一個母源基因均勻分布于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[31]。在不同的胚胎發(fā)育過程中Mrnanos1表達(dá)量在受精后逐漸降低,這與在家蠶中的表達(dá)模式幾乎相同,nanos在幾乎所有不同發(fā)育階段的胚胎中都有表達(dá),且在早期胚胎時期高表達(dá)[32]。而蜜蜂 (Apis mellifera) 早期胚胎的表達(dá)模式有所不同,其早期胚胎發(fā)育過程中有nanos1存在,但其降解較快,在第二階段之后未見有細(xì)胞表達(dá)這種生殖細(xì)胞標(biāo)記物,而在3—7期胚胎中未檢測到Amnanos1 RNA[33],這意味著nanos可能具有不同的功能。實驗結(jié)果表明Mrnanos1的轉(zhuǎn)錄本由母體提供,并在早期胚胎發(fā)生中發(fā)揮重要作用。作為一個母源效應(yīng)基因,nanos在生殖發(fā)育中的具體功能目前仍不明確。如在小鼠中nanos基因的缺失會造成性腺發(fā)育不良,無法產(chǎn)生生殖細(xì)胞[19];同樣在線蟲中,該基因的缺失會影響生殖細(xì)胞的活力[18]。研究還發(fā)現(xiàn),在斑馬魚中,若抑制nanos基因表達(dá)或?qū)⒃摶蚯贸?,PGCs(Primordial germ cells) 無法正常遷移入性腺中,從而導(dǎo)致PGCs凋亡[34]。因此,nanos基因在羅氏沼蝦生殖發(fā)育中的具體功能仍有待進(jìn)一步研究。
亞細(xì)胞定位是確認(rèn)目標(biāo)基因在組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具體位置的有效途徑。原位雜交結(jié)果顯示,Mrnanos1的mRNA并未在羅氏沼蝦的雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)(結(jié)果略),而僅僅表達(dá)于卵巢的生殖細(xì)胞中,且主要分布在Oc1、Oc2、Oc3、Oc4期的初級卵母細(xì)胞質(zhì)中,隨著卵母細(xì)胞發(fā)育成熟,細(xì)胞增大,目的信號逐漸分布在核周區(qū)域。然而,在人類中卻發(fā)現(xiàn)nanos基因在男性生殖系維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[35]。這表明nanos1基因的具體功能因物種差異有所不同。在日本血吸蟲 (Schistosoma japonicum) 中,nanos1促進(jìn)卵母細(xì)胞的形成和產(chǎn)生,對維護(hù)胚胎發(fā)育過程中原始生殖細(xì)胞的生存發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[36];而在線蟲中,nanos1能促進(jìn)原始生殖細(xì)胞遷移至胚胎性腺,并維持生殖細(xì)胞正常的生長發(fā)育[18]。此外,在非洲爪蟾中nanos1 mRNA主要富含于卵母細(xì)胞中,對卵母細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要,若卵母細(xì)胞nanos1不表達(dá)將會導(dǎo)致生殖系統(tǒng)發(fā)育不正常[29]。因此,Mrnanos1基因?qū)α_氏沼蝦雌性生殖細(xì)胞的發(fā)育具有重要功能,并可作為羅氏沼蝦卵母細(xì)胞的一個生殖發(fā)育標(biāo)記基因。