馬騰飛，溫 彬, ，劉 鑫，繆 琳，高建忠, ，陳再忠,

1. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306

2. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306

七彩神仙魚(yú) (Symphysodon aequifasciatus) 隸屬于鱸形目、慈鯛科、盤(pán)麗魚(yú)屬，原產(chǎn)于南美洲的亞馬遜河流域，是觀(guān)賞魚(yú)中的名貴品種[1-3]。該物種具有獨(dú)特的親代撫育行為，即仔魚(yú)在孵化后的一個(gè)月內(nèi)以親本體表分泌的黏液為食[4-5]。盡管受到子代長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月的咬食刺激，但親魚(yú)體表并未被感染和病害，暗示親代體表可能具有較強(qiáng)的免疫防御。Chong等[6]研究發(fā)現(xiàn)，為了適應(yīng)子代免疫需要，C型凝集素 (C-Type lectins, CTLs) 在育幼親本體表黏液中特異表達(dá)，可能在親子抗菌防御方面發(fā)揮重要作用。

CTLs作為一種重要的模式識(shí)別受體，對(duì)魚(yú)類(lèi)抵御病原微生物入侵有著重要的作用。CTLs通常含有一個(gè)或多個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域 (Carbonhydrate-recognition domain, CRD) 或稱(chēng)C型凝集素結(jié)構(gòu)域 (C-Type lectin domain, CTLD)[7-8]。CTLs研究在脊椎動(dòng)物中較為廣泛深入，目前已有1 000多個(gè)CTLs被鑒定出[9]。魚(yú)類(lèi)CTLs研究主要集中于其對(duì)病原相關(guān)分子模式的識(shí)別與結(jié)合、引發(fā)致病微生物的凝集、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)致病菌的吞噬能力以及激活補(bǔ)體系統(tǒng)等方面[10-11]。CD302 (Cluster of differentiation 302)，又稱(chēng)DCL-1 (DEC-205-associated C-type lectin-1)，被劃分在CTLs家族X(qián)V組 (Bimlec)，屬于I型跨膜蛋白[12-13]；CD302作為一種凝集素受體，參與免疫細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，香魚(yú) (Plecoglossus altivelis) 肝、頭腎和脾中PaCD302在鰻弧菌 (Vibrio anguillarum) 感染下表達(dá)顯著上調(diào)，且可能通過(guò)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞來(lái)參與對(duì)細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)。甘露糖結(jié)合凝集素 (Mannan-binding lectins, MBL) 廣泛存在于動(dòng)物中，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有防御功能的CTLs[15]；它可以特異性識(shí)別細(xì)菌、真菌和病毒等病原體，還可以與微生物表面的糖類(lèi)結(jié)合，起到免疫調(diào)節(jié)以及抵御外界病原微生物入侵的作用[16-17]。筆者前期對(duì)七彩神仙魚(yú)育幼期皮膚轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)，CD302在親代撫育期間持續(xù)高表達(dá)，而MBL基因在育幼結(jié)束后表達(dá)顯著上調(diào)，暗示著二者可能參與了親子的先天免疫反應(yīng)，且扮演不同角色。

氣單胞菌屬 (Aeromonas) 是一種在觀(guān)賞魚(yú)類(lèi)中引起疾病的常見(jiàn)細(xì)菌[18-19]，也是造成七彩神仙魚(yú)發(fā)病的主要病原之一[20]。El-Ghany等[21]在患病的七彩神仙魚(yú)中分離出嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila)。本研究從七彩神仙魚(yú)皮膚中克隆獲得2個(gè)新的CTLs家族成員，命名為SaCD302和SaMBL，并通過(guò)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, qRTPCR) 分析它們?cè)诓煌M織中的表達(dá)，以及在嗜水氣單胞菌刺激下相關(guān)組織中的表達(dá)變化，以期了解CD302和MBL在七彩神仙魚(yú)免疫系統(tǒng)中可能的作用，豐富魚(yú)類(lèi)CTLs功能研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

健康的七彩神仙魚(yú) (體長(zhǎng)10～13 cm，體質(zhì)量80～100 g) 取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地，于(28±0.5) ℃，pH 7.8±0.5，持續(xù)充氧條件下暫養(yǎng)，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。嗜水氣單胞菌菌株來(lái)自上海海洋大學(xué)病原庫(kù)。

TRIzol (Invitrogen，美國(guó))、PrimeScript? RT Master Mix (TaKaRa，日本)購(gòu)自上海生工生物公司。2×T5 Fast qPCR Mix (TsingKe，中國(guó))、金牌Mix green (TsingKe，中國(guó)) 購(gòu)自北京擎科生物公司。所有引物運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

選取3條雄性七彩神仙魚(yú)進(jìn)行解剖，取腦、鰓、心臟、頭腎、脾臟、皮膚、肝臟、腸道、肌肉和性腺共10種組織，每個(gè)組織3個(gè)重復(fù)。使用TRIzol試劑提取各組織中的RNA。經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% MOPs瓊脂糖凝膠電泳與微量核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。根據(jù)PrimeScript? RT Master Mix 說(shuō)明書(shū)，以1 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，?20 ℃ 保存。

1.3 基因克隆

從前期測(cè)定七彩神仙魚(yú)皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中選取SaCD302和SaMBL的CDS區(qū)來(lái)分別設(shè)計(jì)引物(表1)。以七彩神仙魚(yú)皮膚組織的cDNA為模版，利用PCR及上述引物對(duì)SaCD302和SaMBL進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μL：皮膚cDNA 1 μL，正反向引物各 1 μL，金牌 Mix green (TsingKe) 22 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸1 min；4 ℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物置于10 g·L?1瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測(cè)，使用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察電泳結(jié)果，目的片段回收送上海生工生物公司測(cè)序。

表1 七彩神仙魚(yú) SaCD302 和 SaMBL 基因克隆及熒光定量PCR引物Table 1 Cloning and fluorescence quantitative primers of SaCD302 and SaMBL gene in S. aequifasciatus

1.4 生物信息學(xué)分析

使用NCBI上的ORF Finder查找SaCD302和SaMBL基因的開(kāi)放閱讀框，并推導(dǎo)出基因的氨基酸序列。使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 進(jìn)行序列同源性分析；采用ExPASy在線(xiàn)工具 (http://web.expasy.org/compute_pi/) 預(yù)測(cè)等電點(diǎn)及蛋白分子量，利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使用SWISSMODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用Clustal X和MEGA 5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和聚類(lèi)分析，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 組織表達(dá)分析

根據(jù)克隆驗(yàn)證得到的SaCD302和SaMBL序列來(lái)分別設(shè)計(jì)qRT-PCR的特異性引物(表1)。采用前期驗(yàn)證的內(nèi)參基因β-actin來(lái)設(shè)計(jì)引物β-actinqPCR-F和β-actin-qPCR-R[22]。以上述10個(gè)組織的cDNA為模版，利用qRT-PCR分別分析SaCD302和SaMBL在各組織中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系 20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix (TsingKe) 10 μL，cDNA 模板 1.6 μL，正反向引物各 0.8 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min (預(yù)變性，1個(gè)循環(huán))；95° C 10 s，56 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s (擴(kuò)增段，共40 個(gè)循環(huán))；95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s (熔解段，1個(gè)循環(huán))。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，包括目的基因 (SaCD302和SaMBL) 和內(nèi)參基因 (βactin)。采用 2?ΔΔCt計(jì)算 SaCD302 和 SaMBL 在各組織的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 嗜水氣單胞菌免疫刺激后的表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取36尾健康的七彩神仙魚(yú)，養(yǎng)殖于6個(gè)水族箱，使用1×107CFU·mL?1嗜水氣單胞菌菌液對(duì)其進(jìn)行腹腔注射 (200 μL·尾?1)，對(duì)照組于另外36尾魚(yú)中注射等量的PBS緩沖液。兩組分別在注射后第0、第6、第12、第24、第48和第72小時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均隨機(jī)選取6尾存活的七彩神仙魚(yú)，提取皮膚、頭腎、肝臟和腸道4個(gè)組織的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)嗜水氣單胞菌刺激SaCD302和SaMBL的應(yīng)答模式，反應(yīng)條件和體系同上。使用2???Ct(??Ct =?Ct實(shí)驗(yàn)??Ct對(duì)照)法計(jì)算所得數(shù)據(jù)，分析SaCD302和SaMBL的相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及生物信息學(xué)分析

SaCD302和SaMBL的cDNA序列ORF區(qū)序列長(zhǎng)度分別為741和795 bp，分別編碼246和264個(gè)氨基酸 (圖1-a、1-b)。蛋白序列預(yù)測(cè)蛋白分子量(MW) 分別為27 614.17和27 912.51 D，理論等電點(diǎn) (PI) 分別為4.89和5.97。SaCD302結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在N端29個(gè)氨基酸 (Amino acid, aa) 殘基為信號(hào)肽序列 (aa 1—29)，隨后是長(zhǎng)度為138個(gè)氨基酸的CTL結(jié)構(gòu)域 (aa 32—169)，C末端有跨膜區(qū)共23個(gè)氨基酸 (aa 184—206，圖2-a)。SaMBL結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，其含有2個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域 (aa 32—92和aa 104—121) 和1個(gè)典型的CTL結(jié)構(gòu)域(aa 137—263，圖 2-b)。

圖1 SaCD302 (a) 和SaMBL (b)基因的核酸序列及氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

圖2 SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 結(jié)構(gòu)域示意圖Fig. 2 Domain of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

2.2 多重序列對(duì)比與進(jìn)化分析

BLAST同源性對(duì)比結(jié)果顯示，SaCD302 與10種魚(yú)的CD302氨基酸序列具有較高的同源性(51.93%～94.72%)。與尼加拉瓜湖始麗魚(yú) (Archocentrus centrarchus) 同源性最高 (94.72%)，其次與斑馬擬麗魚(yú) (Maylandia zebra) CD302同源性較高(82.93%)，與斑馬魚(yú) (Danio rerio) 的同源性最低(51.93%，圖3-a)。SaMBL與8種魚(yú)的MBL氨基酸序列的同源性介于28.64%～90.73%，與尼加拉瓜湖始麗魚(yú)同源性最高 (90.73%)，與斑馬魚(yú)的同源性最低 (28.64%，圖3-b)。使用MEGA軟件對(duì)各物種CD302和MBL氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果顯示，所有魚(yú)類(lèi)的CD302聚為一簇，其他哺乳動(dòng)物聚為一簇 (圖4-a)；斑馬魚(yú)的MBL與其他哺乳動(dòng)物聚為一簇，其余魚(yú)類(lèi)聚為一簇 (圖4-b)；SaCD302和SaMBL均與同為慈鯛科的尼加拉瓜湖始麗魚(yú)關(guān)系最近，符合自然物種的進(jìn)化規(guī)律。

圖3 SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 氨基酸的多重序列比對(duì)Fig. 3 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

圖4 基于NJ法構(gòu)建的SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic analysis of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

2.3 組織表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR對(duì)SaCD302基因在不同組織中表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，SaCD302廣泛表達(dá)于七彩神仙魚(yú)各組織中，但存在一定的組織差異性。其中在頭腎中表達(dá)量最高，而后依次為肝臟、鰓、腦、脾臟等，在肌肉中表達(dá)量最低 (圖5-a)。SaMBL在皮膚中顯著表達(dá)，而在腸道、肝臟、脾臟和性腺中表達(dá)量卻非常低 (圖5-b)。

圖5 SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 在七彩神仙魚(yú)不同組織中的表達(dá)特征注：圖中不同字母表示在不同組織中存在差異性顯著 (P<0.05)；后圖同此。Fig. 5 Relative expression of SaCD302 (a) and SaMBL (b) in different tissues of S. aequifasciatusNote: Different letters indicate significant difference in expression of different tissues (P<0.05). The same case in following figures.

2.4 病原刺激的表達(dá)變化

利用qPCR方法分析嗜水氣單胞菌刺激后不同時(shí)間七彩神仙魚(yú)各組織中SaCD302和SaMBL的表達(dá)變化特征。結(jié)果表明SaCD302 mRNA在脾臟中的表達(dá)在第6小時(shí)增加并達(dá)到頂峰，為對(duì)照組的2倍；在第12小時(shí)開(kāi)始降低，第24—第72小時(shí)有輕微起伏，最終降低到正常水平 (圖6-a)。在頭腎中的表達(dá)第6小時(shí)開(kāi)始增加，在第12小時(shí)達(dá)到頂峰，分別為對(duì)照組的3.6和4.1倍；在第24小時(shí)開(kāi)始降低，在第48和第72 小時(shí)回升，分別為對(duì)照組的1.3、3.0和2.2倍 (圖6-b)。SaCD302 mRNA在腸道中的表達(dá)量第6小時(shí)開(kāi)始增加，為對(duì)照組的1.8倍；第12小時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的6.4倍；第24小時(shí)出現(xiàn)降低，第48小時(shí)達(dá)到最低值，為對(duì)照組的0.03倍，第72小時(shí)回調(diào)至正常水平 (圖6-c)。在皮膚中的表達(dá)量第6小時(shí)開(kāi)始增加，第12小時(shí)達(dá)到頂峰，分別為對(duì)照組的3.7和8.0倍；第24小時(shí)開(kāi)始下降，在第48小時(shí)降到最低，為對(duì)照組的0.15倍；第72小時(shí)回調(diào)至正常水平 (圖6-d)。

SaMBL在感染后脾臟中的表達(dá)量均低于對(duì)照組(圖7-a)。在頭腎中的表達(dá)量在第6小時(shí)增加并達(dá)到頂峰，為對(duì)照組的1.95倍；第12小時(shí)開(kāi)始下調(diào)，第72小時(shí)回升到對(duì)照組的1.78倍 (圖7-b)。SaMBL在腸道中的表達(dá)量第6小時(shí)開(kāi)始增加，第12小時(shí)達(dá)到頂峰，為對(duì)照組的1.2倍 (圖7-c)。在皮膚中，第6小時(shí)表達(dá)量開(kāi)始增加并達(dá)到頂峰，為對(duì)照組的9.04倍；從第12小時(shí)開(kāi)始下降，第48小時(shí)回調(diào)到正常水平 (圖7-d)。

圖7 嗜水氣單胞菌感染后SaMBL在七彩神仙魚(yú)不同組織中的表達(dá)分析Fig. 7 Expression analysis of SaMBL in different tissues from S. aequifasciatus infected by A. hydrophila

3 討論

C型凝集素是一種依賴(lài)鈣離子 (Ca2+) 選擇性結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)家族，在免疫中發(fā)揮重要作用[23]。本研究克隆得到SaCD302和SaMBL。SaCD302推導(dǎo)的氨基酸序列包含一個(gè)29個(gè)aa的信號(hào)肽，可以指引蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，目前為止，大多數(shù)CTLs基因均包含信號(hào)肽[24]，但是SaMBL卻不含信號(hào)肽，表明該基因在七彩神仙魚(yú)CTLs家族中可能有一定的特殊性。另外，兩個(gè)基因均包含一個(gè)CTLs結(jié)構(gòu)域，這也是證明其為CTLs基因的重要依據(jù)。同源性對(duì)比結(jié)果表明，SaCD302和SaMBL均與同為慈鯛科的尼加拉瓜湖始麗魚(yú)同源性最高。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，SaCD302和SaMBL均與魚(yú)類(lèi)聚為一簇，暗示著SaCD302和SaMBL進(jìn)化的保守性。

SaCD302和SaMBL在組織表達(dá)分布上存在顯著差異。SaCD302在七彩神仙魚(yú)各組織中均有表達(dá)，其中在頭腎中表達(dá)量最高，其后依次為肝臟、鰓、腦、脾臟等。研究表明CD302在魚(yú)類(lèi)各組織中廣泛分布，且在大多免疫相關(guān)組織中表達(dá)豐富[25-26]，這與本研究結(jié)果一致，表明CD302在魚(yú)類(lèi)先天免疫中發(fā)揮著重要作用。松江鱸 (Trachidermus fasciatus) CD302在頭腎中表達(dá)最高，這與本研究結(jié)果相似[25]。SaCD302在七彩神仙魚(yú)頭腎中高表達(dá)，原因可能是頭腎為魚(yú)類(lèi)的重要免疫器官，含有淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞[27]。在虹鱒 (Oncorhynchus mykiss) 和草魚(yú) (Ctenopharyngodon idellus) 的研究中，MBL在肝臟和脾臟表達(dá)較高[28-29]。本研究中，SaMBL在皮膚中顯著表達(dá)，而在腸道、肝臟、脾臟和性腺中的表達(dá)量卻非常低，表明與其他魚(yú)類(lèi)相比，MBL在七彩神仙魚(yú)的皮膚中可能扮演更加重要的角色。魚(yú)類(lèi)皮膚上分泌的黏液幾乎覆蓋在魚(yú)體所有表面，構(gòu)成其與外界直接接觸的第一層免疫防御，保護(hù)魚(yú)體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒侵襲[30-31]。SaMBL在皮膚中的高表達(dá)暗示著其可能在魚(yú)類(lèi)黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。

松江鱸的TfCD302廣泛存在于各組織中，且頭腎中的表達(dá)量最高，在鰻弧菌的刺激下，松江鱸的鰓、皮膚、頭腎、肝臟中的CD302均上調(diào)表達(dá)[25]。哈維氏弧菌 (V. harveyi) 刺激花鱸 (Lateolabrax japonicus) 后，LjCD302在頭腎、腸、鰓、脾和肝中的表達(dá)量顯著上調(diào)[26]。CD302可能在魚(yú)類(lèi)抵抗病原入侵的先天免疫應(yīng)答中具有重要作用。本研究在嗜水氣單胞菌的刺激下，檢測(cè)了七彩神仙魚(yú)免疫組織中SaCD302 mRNA的時(shí)序表達(dá)。SaCD302的表達(dá)水平在皮膚和腸道中總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而在頭腎和脾臟中均出現(xiàn)了在第48小時(shí)回升，第72小時(shí)下降，推測(cè)SaCD302在頭腎和脾臟中的免疫反應(yīng)更加持久。脾臟中第6小時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，腸道、皮膚和頭腎在第12小時(shí)達(dá)到峰值，推測(cè)可能與嗜水氣單胞菌刺激后免疫組織發(fā)揮的時(shí)效和作用原理有關(guān)。而各組織表達(dá)量在每個(gè)階段均顯著高于對(duì)照組，表明SaCD302在嗜水氣單胞菌感染時(shí)發(fā)揮了重要的免疫防御作用。

SaMBL在嗜水氣單胞菌刺激后，腸道和脾臟的表達(dá)變化低于其他組織，可能是因?yàn)槠湓诮M織中的表達(dá)本身較低。草魚(yú)MBL在嗜水氣單胞菌感染后，在頭腎中的表達(dá)在第4小時(shí)達(dá)到最大值，然后開(kāi)始逐漸降低至正常水平[29]。這與本研究結(jié)果相似，七彩神仙魚(yú)在病原感染后，頭腎在第6小時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.95倍，之后開(kāi)始降低。而皮膚中同樣在第6小時(shí)達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的9.04倍，表明七彩神仙魚(yú)MBL在皮膚里抗菌免疫中可能發(fā)揮更顯著的作用?？傊?，SaCD302和SaMBL在病原感染后的大多組織中均有表達(dá)上調(diào)，在感染24 h后均下降到對(duì)照組水平，表明嗜水氣單胞菌引起的感染可能在第24小時(shí)結(jié)束第一輪感染。但SaCD302和SaMBL不論是組織表達(dá)，或是病原刺激下的免疫應(yīng)答模式，均有不同程度的差異，這暗示在七彩神仙魚(yú)親代撫育階段，兩個(gè)基因可能都對(duì)親魚(yú)先天免疫反應(yīng)發(fā)揮作用，但作用機(jī)制不同。

本研究從七彩神仙魚(yú)皮膚中克隆得到SaCD302和SaMBL 基因，對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹(shù)分析，并測(cè)定了SaCD302和SaMBL在不同組織以及嗜水氣單胞菌感染后的免疫應(yīng)答。結(jié)果表明，在病原菌的刺激下，SaCD302和SaMBL均可以迅速作出應(yīng)答，但應(yīng)答模式不同，表明兩個(gè)CTLs基因可能在七彩神仙魚(yú)抗病原入侵時(shí)發(fā)揮不同作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。