劉 芳，王 英，楊 陶，黃大野

(湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢 430064)

黃瓜是我國日常消費(fèi)的主要蔬菜品種，位居保護(hù)地栽培面積第一位，在保障蔬菜周年供應(yīng)中占有舉足輕重的地位。2015年我國黃瓜種植面積 125.8萬hm2，產(chǎn)量5 938 萬t，均居世界首位[1-2]。猝倒病是黃瓜育苗及移栽期間的主要病害，是世界著名的毀滅性病害，可造成爛種、爛芽及幼苗猝倒。特別是在氣溫低、土壤濕度較大時發(fā)病嚴(yán)重，在溫室及大田均可造成嚴(yán)重的危害[3-4]。一般發(fā)病率20%～50%，嚴(yán)重地塊可達(dá) 80%以上，近年來猝倒病已成為影響黃瓜生產(chǎn)的首要問題。猝倒病的病原菌主要為卵菌綱瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，生產(chǎn)上還沒有針對猝倒病的高抗品種，化學(xué)藥劑仍是猝倒病防治的主要手段。但隨著藥劑的使用抗藥性迅速出現(xiàn)，導(dǎo)致藥劑失效[5]。同時，化學(xué)殺菌劑的使用會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，危害人畜健康。因此，開發(fā)生物活性高、對非靶標(biāo)生物安全和環(huán)境相容性好的新型殺菌劑具有重要意義。

植物根際促生細(xì)菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是一類在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價值的微生物[6]。帕勒隆尼氏假單孢菌(Pseudomonaspalleroniana)最早從水稻中分離并鑒定[7]，具有較為廣譜的農(nóng)用生物活性，包括促進(jìn)蘑菇生長[8]、促進(jìn)植物生長[8-9]，但也有報道P.palleroniana菌株可抑制擬南芥的生長[10]。針對黃瓜苗期猝倒病，筆者從黃瓜苗期根際土壤中分離到P.palleronianaHG-258菌株，其對黃瓜苗期猝倒病有明顯的防控效果，具有開發(fā)潛力。對該菌株的生長特性、發(fā)酵條件及培養(yǎng)基優(yōu)化等方面的研究，有助于提高該菌株的發(fā)酵水平，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試菌株帕勒隆尼氏假單孢菌(Pseudomonaspalleroniana)HG-258菌株由湖北省生物農(nóng)藥工程中心從黃瓜苗期根際土壤樣品中分離得到并保存。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，蛋白胨15 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)需要具體配制，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子液制備。將斜面菌種接種1環(huán)至LB液體種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 12 h。

1.2.2菌數(shù)測定。采用稀釋涂布平板計數(shù)法。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。①碳源。分別用 10 g/L葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米粉和玉米淀粉5種碳源作為唯一碳源，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的其他組分蛋白胨含量不變，pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min培養(yǎng) 32 h 后測定發(fā)酵液的菌數(shù)，確定最佳碳源。②氮源。固定碳源葡萄糖10 g/L，分別以15 g/L 魚粉、豆粕、蛋白胨、酵母膏、花生粕、芝麻粕和玉米漿7 種氮源作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，玉米漿用量按干物質(zhì)含量折算。pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min培養(yǎng) 32 h 后測定發(fā)酵液的菌數(shù)，確定最佳氮源。③正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甘油和蔗糖為碳源，豆粕、酵母膏為氮源，無機(jī)鹽固定為硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L，設(shè)計4因素3水平正交試驗(yàn)(表 1)，pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min培養(yǎng) 32 h 后測定發(fā)酵液的菌數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4發(fā)酵條件的優(yōu)化。在選用最適培養(yǎng)基條件下，分別考察不同溫度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速對HG-258菌體生長的影響。

1.2.5生長曲線。在最適培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng) 48 h。培養(yǎng)期間每隔 4 h 取液態(tài)樣品測定菌數(shù)并涂片鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1碳源。從圖1可以看出，不同碳源對HG-258菌株菌體生長有不同的影響，其中甘油和蔗糖作為碳源的效果較好，發(fā)酵結(jié)束后菌數(shù)為 1.574×1010和1.682×1010CFU/mL，因此選擇甘油和蔗糖為HG-258菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖1 不同碳源對HG-258菌株生長的影響

2.1.2氮源。由圖 2 可知，HG-258菌株在含有豆粕和酵母膏的培養(yǎng)基中菌數(shù)較高，發(fā)酵結(jié)束后菌數(shù)為 1.762×1010和1.886×1010CFU/mL，因此選擇豆粕、酵母膏作為HG-258菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖2 不同氮源對HG-258菌株生長的影響

2.1.3正交試驗(yàn)結(jié)果。由表2和表3可知，影響HG-258菌株發(fā)酵水平主次因素關(guān)系為蔗糖>甘油>酵母膏>豆粕，蔗糖的F為2.718，對發(fā)酵的影響最大，而豆粕對發(fā)酵的影響較小。HG-258菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 10.0 g/L，甘油 10.0 g/L，酵母膏 30.0 g/L，豆粕 10.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L，此配方在pH 7.0，接種量5%，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng) 32 h，HG-258菌株的發(fā)酵菌數(shù)可達(dá) 2.544×1010CFU/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1溫度。由圖3可知，HG-258菌株在28 ℃培養(yǎng)條件下菌數(shù)最高，可達(dá)2.544×1010CFU/mL。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對HG-258菌株生長的影響

2.2.2起始pH。由圖4可知，HG-258菌株在培養(yǎng)基起始pH 7.0條件下菌數(shù)最高，可達(dá)2.526×1010CFU/mL。

圖4 不同起始pH對HG-258菌株生長的影響

2.2.3接種量。由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，HG-258菌株發(fā)酵液中的菌數(shù)隨接種量的增加而增加，但當(dāng)接種量> 5% 時，菌數(shù)呈下降趨勢。因?yàn)?3% 接種量和 5% 接種量菌數(shù)差別不大，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇3%的接種量為佳。

圖5 不同接種量對HG-258菌株生長的影響

2.2.4轉(zhuǎn)速。由圖6可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，HG-258菌株的菌數(shù)也隨之增加，但200和220 r/min條件下菌數(shù)差別不大。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，將HG-258菌株的培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速確定為 200 r/min。

2.3 生長曲線由圖7和鏡檢情況可知，HG-258菌株的生長規(guī)律：0～4 h 延滯期，菌數(shù)很少；4～24 h 對數(shù)生長期，菌體呈桿狀，數(shù)量迅速增加，24～36 h 穩(wěn)定期，32和36 h菌數(shù)相差不大，桿狀菌體大量脫落形成球狀菌體，32 h時98%的菌體形成整齊的球狀菌體，因此32 h左右是最佳培養(yǎng)結(jié)束時間，36 h以后進(jìn)入衰亡期。

圖7 HG-258菌株的生長曲線

3 結(jié)論與討論

對具有防病促生活性的生防微生物發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化可推動生防微生物的深入評價及生防產(chǎn)品的開發(fā)。不同微生物菌株的營養(yǎng)需求不同，可通過不同的試驗(yàn)設(shè)計對其發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。在假單孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基篩選中，多采用蛋白胨、甘油、葡萄糖等作為發(fā)酵的碳源及氮源[11-14]。從該研究結(jié)果看，帕勒隆尼氏假單孢菌(P.palleroniana)HG-258菌株對緩效碳源，如玉米粉及玉米淀粉的利用不好，而蔗糖、葡萄糖及甘油有利于菌體的生長，這與其他的研究結(jié)果一致。在氮源利用上，HG-258菌株對花生粕、芝麻粕及玉米漿等氮源利用不好，但豆粕、酵母膏及蛋白胨等有利于菌體的生長，特別是在以豆粕為氮源的培養(yǎng)基中生長與在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中生長相當(dāng)，這為降低HG-258菌株發(fā)酵成本提供了可能。HG-258菌株發(fā)酵的最適溫度范圍較廣，有利于發(fā)酵過程中溫度的控制。從發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對菌體生長的影響來看，pH對生長的影響較大，最適pH為7.0。接種量從1%～5%，菌數(shù)與接種量呈正相關(guān)，而隨著接種量進(jìn)一步上升，發(fā)酵液菌數(shù)則下降。發(fā)酵轉(zhuǎn)速反映了發(fā)酵過程中的溶氧量，作為一種好氣性細(xì)菌，HG-258菌株需要較高的溶氧，要采用較高的轉(zhuǎn)速200～220 r/min。HG-258菌株生長較快，發(fā)酵36 h就達(dá)到了生長高峰。該研究確定了帕勒隆尼氏假單孢菌(P.palleroniana)HG-258菌株的最適培養(yǎng)基：蔗糖 10.0 g/L，甘油 10.0 g/L，酵母膏 30.0 g/L，豆粕 10.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L。對發(fā)酵條件優(yōu)化確定了HG-258菌株的最佳發(fā)酵條件是初始 pH 7.0，培養(yǎng)溫度 28 ℃，接種量 3%，轉(zhuǎn)速 200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。在最佳發(fā)酵條件下，搖瓶發(fā)酵液菌數(shù)可達(dá) 2.826×1010CFU/mL，相比初始培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下的發(fā)酵水平提高了約1倍。所采用的培養(yǎng)基原料來源廣泛，價格低廉易獲取，為該菌株的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。