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        癢螨病患兔下丘腦室旁核組織結(jié)構(gòu)及其內(nèi)5-HT的表達(dá)量變化研究

        2022-12-20 06:28:00連俊琪余興邦田宗民格根塔娜賈長生王志剛古小彬周洪旭鄧樺林
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年22期
        關(guān)鍵詞:光密度下丘腦病患

        連俊琪,余興邦,王 巍,田宗民,格根塔娜,李 穎,賈長生,王志剛,古小彬,周洪旭,鄧樺林,唐 麗*

        (1.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市動物疫病預(yù)防控制中心,內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021000;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川成都 611130)

        兔癢螨病主要由兔癢螨(Psoroptescuniculi)寄生于家兔的外耳道,導(dǎo)致患病動物發(fā)生劇烈的瘙癢、厭食、消瘦等臨床癥狀,且伴有局部炎癥并繼發(fā)細(xì)菌感染,同時引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng);病變嚴(yán)重時,可蔓延至腦部,引起患兔癲癇,直至死亡[1-2]。下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是下丘腦重要的核團(tuán)之一,由靠近外側(cè)的一群大細(xì)胞和靠近內(nèi)側(cè)的一群小細(xì)胞組成,參與機(jī)體體溫、攝食、水平衡等重要的生理功能,并在神經(jīng)免疫內(nèi)分泌的調(diào)控中起整合中心的作用。PVN組織結(jié)構(gòu)的變化必然伴隨著相應(yīng)生理功能的變化,進(jìn)而引發(fā)一系列臨床癥狀。研究表明,當(dāng)發(fā)生疾病時PVN內(nèi)神經(jīng)元電位活動增強(qiáng),其合成和分泌的催產(chǎn)素(oxytocin,OT)、加壓素(vasopressin,AVP)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、神經(jīng)肽Y(NPY)、5-羥色胺(5-HT)等物質(zhì)不同程度參與了攝食調(diào)節(jié)、炎性疼痛的調(diào)控、機(jī)體的免疫反應(yīng)及癲癇的發(fā)生與發(fā)展[3-7]。5-HT在哺乳動物的腦及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高,是重要的神經(jīng)遞質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子。此外,PVN上也有5-HT受體,其可被5-HT激活,且5-HT纖維末端在PVN區(qū)域非常密集,PVN中5-HT受體也可上調(diào)CRH等信號系統(tǒng),參與機(jī)體內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)[5,8]。

        鑒于PVN及其內(nèi)5-HT對鎮(zhèn)痛、癲癇、攝食及免疫反應(yīng)的調(diào)控作用,關(guān)于PVN及其內(nèi)5-HT在兔癢螨病的發(fā)生與發(fā)展中的作用研究未見報道。筆者采用HE染色以及免疫組化(SABC)法,觀察癢螨病患兔下丘腦PVN的組織結(jié)構(gòu)及PVN內(nèi)5-HT的表達(dá)量變化,以期探索下丘腦PVN的組織結(jié)構(gòu)及其內(nèi)5-HT在兔癢螨病的發(fā)生、發(fā)展中的作用,為兔癢螨病的防治提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗動物及其分組選取4—7月齡健康及患癢螨病的新西蘭兔20只,體重2.5~3.5 kg,適應(yīng)性飼喂7 d后宰殺。常規(guī)管理,自由采食和飲水。

        參照癢螨病變評分系統(tǒng)[9]進(jìn)行評分,選擇耳部病變分別達(dá)到不同評分級別(1分、2分、3分組)的患癢螨病新西蘭兔各5只,另選健康兔5只(0分組)。家兔靜脈麻醉后,頸動脈放血處死;取腦組織固定于4%多聚甲醛-0.1%磷酸鹽緩沖固定液,待用。

        1.2 試驗方法

        1.2.1樣本制作。取下丘腦(矢狀切)用石蠟包埋,連續(xù)切片(厚度為4~6 μm)后分別進(jìn)行常規(guī)HE法染色和SABC法染色(一抗5-HT由北京博奧森生物有限公司提供),最后使用OLYMPS CH2OBIMF200光學(xué)顯微鏡觀察。

        1.2.2結(jié)果判定及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色,根據(jù)顯色程度分為3級,并結(jié)合Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)中的平均積分光密度對結(jié)果進(jìn)行判定:+++表示深棕色,強(qiáng)陽性;++表示中等著色,棕色,陽性;+表示著色淺,淡黃色,弱陽性。

        光鏡觀察下丘腦PVN大、小細(xì)胞部的組織結(jié)構(gòu)變化,描述病變特征。在10×40光鏡下,使用Image Pro Plus 圖像分析系統(tǒng),每張切片按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)截取10個視野,測定其陽性產(chǎn)物的平均光密度(OD)和積分光密度(IOD);利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用t檢驗分析差異顯著性,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 組織病理學(xué)變化通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn),0分組下丘腦PVN核團(tuán)清晰,細(xì)胞排列有序,神經(jīng)元纖維突起明顯;外側(cè)大細(xì)胞部細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞體較大,核質(zhì)清晰;內(nèi)側(cè)小細(xì)胞部細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞體較小,核質(zhì)清晰;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,數(shù)量較多,胞質(zhì)著色較深(圖1)。

        與0分組相比,患病組(1分、2分、3分組)患兔下丘腦PVN大、小細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量及組織結(jié)構(gòu)等均有不同程度的變化,且損傷程度隨病變評分的增加而增加(雙耳病變分?jǐn)?shù)越高,患兔下丘腦PVN組織結(jié)構(gòu)損傷越嚴(yán)重)。1分組:下丘腦PVN核團(tuán)清晰,細(xì)胞排列有序,神經(jīng)元纖維突起輕微減少,部分大細(xì)胞出現(xiàn)固縮;部分小細(xì)胞輪廓不清晰;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,數(shù)量增加,胞質(zhì)著色較深。2分組:下丘腦PVN核團(tuán)不清晰,細(xì)胞排列混亂,部分大細(xì)胞輪廓不清晰,邊緣模糊,部分細(xì)胞發(fā)生腫脹,胞體呈橢圓形;小細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢,部分胞質(zhì)消失;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞著色變淺,部分細(xì)胞變形、呈多極狀,胞體部分溶解,細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢。3分組:下丘腦PVN核團(tuán)不清晰,細(xì)胞排列紊亂,大細(xì)胞部胞體呈不規(guī)則形狀,輪廓模糊不清晰,部分細(xì)胞核仁崩解消失,胞質(zhì)染色變淺;小細(xì)胞數(shù)量減少,分布稀疏,部分胞核不明顯,胞質(zhì)消失,周邊組織有充血現(xiàn)象;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)形成空泡,胞核崩解甚至消失,染色變淺,細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖1)。

        注:A.健康組(0 分);B.1分組;C.2分組;D.3分組;“→”表示室旁核小細(xì)胞部;“△”表示室旁核大細(xì)胞部;“▲”表示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

        2.2 癢螨病患兔下丘腦PVN內(nèi)5-HT的表達(dá)量變化免疫組化結(jié)果(圖2)顯示,5-HT陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色,健康及患兔下丘腦PVN內(nèi)均可檢測到5-HT陽性產(chǎn)物分布于神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。與0分組相比,各患病組下丘腦PVN大細(xì)胞部內(nèi)5-HT的表達(dá)量極顯著增加(P<0.01),且1分組和2分組兔下丘腦PVN大、小細(xì)胞部內(nèi)5-HT的表達(dá)量隨雙耳病變評分的增加而增加;與2分組相比,3分組下丘腦PVN大、小細(xì)胞部內(nèi)5-HT的表達(dá)量減少(表1)。

        2.2.1PVN大細(xì)胞部內(nèi)5-HT的表達(dá)量變化。與0分組相比,患病組(1分、2分和3分組)下丘腦PVN大細(xì)胞部內(nèi)5-HT的陽性信號增強(qiáng)(++),平均積分光密度均極顯著升高(P<0.01),5-HT表達(dá)量增加;1分組和2分組的5-HT表達(dá)量均隨雙耳病變評分的增加而增加;與2分組相比,3分組5-HT表達(dá)量減少(P>0.05)。與1分組相比,2分組和3分組下丘腦PVN大細(xì)胞部內(nèi)5-HT 的平均積分光密度均升高,5-HT表達(dá)量增加(表1,圖2)。

        2.2.2PVN小細(xì)胞部內(nèi)5-HT的表達(dá)量變化。與0分組相比,患病組(1分、2分和3分組)下丘腦PVN小細(xì)胞部內(nèi)5-HT陽性信號減弱,平均積分光密度均升高,5-HT表達(dá)量均增加;與0分組相比,2分組和3分組5-HT表達(dá)量極顯著增加(P<0.01);與2分組相比,3分組5-HT表達(dá)量極顯著減少(P<0.01)。與1分組相比,2分組和3分組5-HT陽性信號增強(qiáng)(++),平均積分光密度升高,5-HT表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)。與2分組相比,3分組下丘腦PVN小細(xì)胞部內(nèi)5-HT的陽性信號強(qiáng)度差異不大,平均積分光密度極顯著降低(P<0.01),5-HT表達(dá)量減少(表1,圖2)。

        注:A.健康組(0 分);B.1分組;C.2分組;D.3分組;棕黃色或褐色表示陽性信號;“▲”表示室旁核小細(xì)胞部,“△”表示室旁核大細(xì)胞部

        3 討論

        3.1 癢螨病患兔下丘腦PVN組織結(jié)構(gòu)的變化兔患癢螨病后出現(xiàn)厭食、消瘦、局部發(fā)炎及癲癇等臨床癥狀[1-2],而下丘腦PVN參與調(diào)節(jié)機(jī)體攝食活動、調(diào)控癲癇的發(fā)生和擴(kuò)散、調(diào)節(jié)鎮(zhèn)痛以及影響神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動[4-6],而臨床現(xiàn)象與組織結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)。該試驗結(jié)果表明,癢螨病患兔出現(xiàn)上述臨床癥狀,且與健康組相比,患病組患兔PVN大、小細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)受損程度隨雙耳病變評分的增加而增加。

        研究顯示,下丘腦PVN受到損傷后,分泌多種厭食神經(jīng)肽,包括促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、CRH和OT,且OT分泌量與抑制進(jìn)食的效應(yīng)呈正相關(guān)[10-11]。CRH與UCNS肽在中樞和外周均可引起厭食反應(yīng)[12]。此外,唐亞杰[4]研究表明PVN通過釋放激素、神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)等物質(zhì)控制機(jī)體炎癥的過度暴發(fā),并對系統(tǒng)性炎癥起到一定的控制作用。同時,PVN在應(yīng)激及疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[13]。Eliava等[14]研究表明下丘腦PVN投射到腦干和脊髓的OT神經(jīng)元誘發(fā)的OT釋放可抑制炎性疼痛,并起到鎮(zhèn)痛作用。張玉芹等[15]認(rèn)為,腦細(xì)胞癇樣放電時,可能是通過某種途徑激活了下丘腦PVN小細(xì)胞內(nèi)CRH的分泌,促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和糖皮質(zhì)激素的分泌,從而抑制了細(xì)胞的免疫功能。

        該試驗結(jié)果表明,PVN組織結(jié)構(gòu)受損后,可能導(dǎo)致CRH、OT等激素分泌增加,引起厭食行為的發(fā)生;當(dāng)雙耳病變程度較輕時,PVN部分細(xì)胞發(fā)生病變,可能引起OT表達(dá)量的增加,對蟲咬引起的疼痛以及局部發(fā)炎引發(fā)的炎性疼痛可起到一定的鎮(zhèn)痛或調(diào)節(jié)作用,但在雙耳病變程度加重時PVN組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,使得PVN的神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào),可能導(dǎo)致OT分泌量減少,使得中樞神經(jīng)對鎮(zhèn)痛的調(diào)節(jié)作用減弱;此外,當(dāng)雙耳病變程度較輕時,兔下丘腦PVN小細(xì)胞內(nèi)CRH分泌量增加,抑制了細(xì)胞免疫功能和癲癇痙攣等神經(jīng)癥狀;隨著病變程度的加劇,兔下丘腦PVN組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,導(dǎo)致細(xì)胞功能異常,可能導(dǎo)致CRH分泌量減少,對癲癇痙攣的抑制作用減弱,故患兔出現(xiàn)癲癇等神經(jīng)癥狀;PVN結(jié)構(gòu)受損導(dǎo)致的細(xì)胞免疫功能下降及癲癇的發(fā)作可能是導(dǎo)致兔死亡的主要原因,但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

        綜上所述,癢螨病患兔下丘腦PVN大、小細(xì)胞部損傷程度隨雙耳病變評分的增加而增加。由此可見,兔癢螨不僅可直接引發(fā)兔耳部的病理損傷,而且可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理損傷,但具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

        3.2 癢螨病患兔下丘腦PVN內(nèi)5-HT表達(dá)量的變化5-HT是下丘腦PVN內(nèi)最主要的神經(jīng)遞質(zhì),參與跟疾病有關(guān)的攝食、癲癇、痛覺、鎮(zhèn)靜等臨床反應(yīng)以及炎癥引發(fā)的免疫反應(yīng)[5-7]。

        研究表明,5-HT作為一種重要的瘙癢介質(zhì),廣泛存在于腦中,其可通過5-HT1A、5-HT2A、5-HT3、5-HT7等受體參與癢覺調(diào)控[16]。5-HT受體廣泛分布于PVN中[8],PVN中5-HT1A和5-HT1B受體的激活構(gòu)成了重要的飽腹感信號[5],可通過刺激PVN中CB1受體抑制5-HT的釋放,發(fā)揮一定的抑制攝食作用。Hasler等[17]研究發(fā)現(xiàn)5-HT1A受體與癲癇的發(fā)生存在著密切的聯(lián)系,且可降低腦內(nèi)5-HT水平,加劇癲癇的發(fā)作。

        該試驗結(jié)果表明,與健康組(0分組)相比,癢螨病患兔PVN大、小細(xì)胞部內(nèi)5-HT的表達(dá)量均增加,且患兔出現(xiàn)上述厭食、消瘦、瘙癢、癲癇等臨床表現(xiàn)。雖然與2分組相比,3分組PVN內(nèi)5-HT表達(dá)量減少,但其PVN大、小細(xì)胞內(nèi)5-HT的表達(dá)量均高于健康組,推測其原因在于當(dāng)感染程度較輕時PVN組織結(jié)構(gòu)的損傷亦較輕,機(jī)體尚具備自我修復(fù)的功能,且通過提高5-HT的表達(dá)量來促進(jìn)機(jī)體的自我修復(fù),但病變程度加重時PVN組織結(jié)構(gòu)受損亦嚴(yán)重,直接導(dǎo)致5-HT的表達(dá)量下降。

        下丘腦PVN內(nèi)5-HT表達(dá)量的增加對癲癇有抑制作用;下丘腦PVN內(nèi)5-HT表達(dá)量的減少對攝食具有促進(jìn)作用。林毅等[18]研究表明色氨酸是5-HT在體內(nèi)生物合成的前體物質(zhì),膳食中添加色氨酸可增加血液和下丘腦內(nèi)5-HT的表達(dá)量。因此,在癢螨病患兔病變較輕時,建議使用5-HT拮抗劑或減少飼料中5-HT合成前體物質(zhì)色氨酸的添加量,以輔助治療出現(xiàn)的厭食和消瘦等臨床癥狀;當(dāng)病變較重時,在飼料中適量添加色氨酸,以緩解兔在感染后期出現(xiàn)的癲癇等神經(jīng)癥狀,但此建議是否可行還需要進(jìn)一步驗證。

        綜上所述,癢螨病可導(dǎo)致兔下丘腦PVN的組織結(jié)構(gòu)受損、5-HT表達(dá)量增加,提示下丘腦亦是癢螨病的靶器官之一;同時,5-HT可能參與了癢螨病的發(fā)生與發(fā)展。

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