張鵬飛，孟會(huì)生，井國雁，陳澤坤，馬曉楠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太谷 030801)

我國秸稈資源種類豐富、分布廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年可以產(chǎn)生10.4億t的秸稈，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[1]。目前我國處理秸稈多采用秸稈還田的方式。秸稈還田雖然能釋放有機(jī)物質(zhì)改善土壤結(jié)構(gòu)[2]，但秸稈中有大量的纖維素、半纖維素等，在自然狀態(tài)下降解比較長，在此期間有可能會(huì)影響種子的正常生長。如何合理利用秸稈，緩解農(nóng)村能源物資缺乏嚴(yán)重的現(xiàn)象已經(jīng)成為我國一個(gè)難題[3]。自2000年，我國就頒布了關(guān)于秸稈一系列如何利用和解決秸稈禁燒的政策[4]。但秸稈焚燒的現(xiàn)象還是隨處可見，因此如何合理使用秸稈并且提高秸稈的利用率仍然是社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。

相比較使用化學(xué)方式處理秸稈的方法，低成本、無污染的微生物降解方法更具有研究價(jià)值。微生物降解法是快速降解纖維素的一種快速有效的方法，主要利用土壤中原有的微生物，增加微生物酶的活性對(duì)秸稈進(jìn)行降解。研究表明，正確合理使用微生物降解菌劑可以降低水稻秸稈的強(qiáng)度，明顯促進(jìn)土壤中的養(yǎng)分、微生物多樣性等，從而使作物在一定程度上增產(chǎn)增收[5]，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

在自然環(huán)境中，纖維素降解菌的種類豐富且數(shù)量龐大，主要包括纖維黏菌和纖維桿菌等細(xì)菌，纖維放線菌、諾卡氏菌屬和霉菌屬等放線菌，木霉屬、曲霉屬、青霉素等真菌[6]。生存環(huán)境也各式各樣，如動(dòng)物腸胃、土壤、森林等。研究表明，纖維素降解菌可增強(qiáng)土壤降解秸稈能力，對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物有重要的作用。如纖維素轉(zhuǎn)化商用酶作用于玉米秸稈等不同種類的木質(zhì)素原料[7]；從臧牛胃中分離出來2株纖維素降解菌作用于青貯飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素菌落可改善飼料品質(zhì)。雖然菌類資源豐富，但目前發(fā)現(xiàn)的可實(shí)際應(yīng)用于農(nóng)田并降解秸稈的較少。該研究主要是通過試驗(yàn)篩選與構(gòu)建高效纖維素微生物菌群，加快玉米秸稈還田速度，對(duì)合理利用秸稈資源、減少環(huán)境污染具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集。土壤樣品采自山西省晉中市太谷區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院試驗(yàn)田(含枯枝落葉、腐敗秸稈、動(dòng)物糞便等的土壤)。

1.1.2培養(yǎng)基。菌株的篩選和分離采用羧甲基纖維素培養(yǎng)基和赫奇遜液體培養(yǎng)基[8]；保存菌株采用液體LB培養(yǎng)基[9]；初篩菌株纖維素能力采用濾紙條培養(yǎng)基[10]。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離、篩選。稱取采集的樣品土10.00 g,并在無菌條件下放于裝有90.00 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻并靜置，稀釋成10-5、10-62個(gè)濃度菌液。用移液槍取0.1 mL 10-5稀釋液涂布于好氧性纖維素分解培養(yǎng)基平板上，同樣的方法取10-6稀釋液并涂布。每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d左右。每個(gè)菌落挑選單個(gè)菌株置于好氧性纖維素分解培養(yǎng)基,每皿2個(gè)，然后1 mol/L剛果紅染色15 min，然后用1 mol/L NaCl浸洗，在12、24、36 h測定每個(gè)菌落直徑(d)和其產(chǎn)生水解圈直徑(D)，并計(jì)算水解圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)。水解圈與菌落直徑比值可以簡單判斷該菌株的纖維素降解能力。

1.2.2菌株的鑒定。對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行生理生化鑒定[11]，同時(shí)利用16S rDNA測得基因通用引物(S10:5′-AAGTCGAACGATGAACCA-3′、S20:5′-GCAGTCGAACGATGAAGC-3′、S30：5′-AAGTCGAACGATGAAGCC-3′)擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因片段。運(yùn)用NCBI Blast分析工具對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定菌株。

1.2.3玉米秸稈降解試驗(yàn)。將粉末狀500 g的玉米秸稈放在花盆里，置于30 ℃的環(huán)境中，試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，分別為CK(不加菌劑，加等量清水)、S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S10S20S30，每盆加入10 mL菌劑，每隔2 d觀察玉米秸稈干物質(zhì)降解率，培養(yǎng)20 d后，測定總碳、纖維素、半纖維素含量。干物質(zhì)降解率=(發(fā)酵前的干物質(zhì)量-發(fā)酵后的干物質(zhì)量)/發(fā)酵前干物質(zhì)量×100%。

1.2.4測定方法。采用水解圈和菌落直徑比值、濾紙條的降解效果2種方法進(jìn)行初篩菌株。菌株纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、濾紙酶(FPA)活力參照劉東陽等[12]的方法進(jìn)行測定。

纖維素采用范氏法-重量法[13]進(jìn)行測定；半纖維素采用2 mol/L鹽酸水解法和DNS法相結(jié)合[14]進(jìn)行測定；總有機(jī)碳采用TOC分析儀法[15]進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel 2019對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SAS對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，并用 Duncan′s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與篩選纖維素降解菌分解纖維素能力以水解圈與菌落直徑的比值來判定。從分離的10株菌株初步篩選3株纖維素降解能力較強(qiáng)的S10、S20、S30。由表1可知，S10、S20、S30這3個(gè)菌株水解圈與菌落直徑的比值(D/d)隨著時(shí)間的增加而增加。菌株S10和S20的水解圈和菌落直徑的比值較大，培養(yǎng)36 h比值分別為6.12和6.02，而S30的比值為4.52，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于S10和S20。

表1 纖維素降解菌的水解圈直徑(D)、菌落直徑(d)及其比值

2.2 不同菌株的濾紙降解效果與纖維素酶活性以定性濾紙為底物初步研究纖維素降解菌的分解能力，結(jié)果如表2所示。纖維素分解菌S10菌株和S20菌株具有較強(qiáng)的濾紙分解性能，靜置3 d后可以清晰地觀察到濾紙有明顯的降解，5 d 后培養(yǎng)基開始變黃，到第7天濾紙條明顯開始崩解。S30菌株在第3天沒有明顯的變化，到第5天開始濾紙條降解，到第7天培養(yǎng)基才開始變黃。由此可見，S10、S20菌株纖維素降解能力強(qiáng)于S30菌株。

對(duì)S10、S20、S30纖維素降解菌進(jìn)行復(fù)篩，將3株纖維素降解菌發(fā)酵培養(yǎng)72 h后，測其纖維素酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株纖維素降解菌中S10的纖維素酶活性最大，為65.38 U/mL，其次為S20菌株，纖維素酶活性為59.29 U/mL，S30菌株纖維素酶活性最小，為45.74 U/mL。S10菌株比S20、S30菌株纖維素酶活性分別高6.09、19.64 U/mL。綜上所述，S10單菌株纖維素酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于S20和S30，因此可選擇S10單菌株進(jìn)行后期試驗(yàn)。

2.3 分子生物學(xué)鑒定對(duì)S10、S20、S30菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，結(jié)果顯示(圖1)，S10、S30與栗褐鏈霉菌多個(gè)菌株具有高度的同源性，S20與枯草芽孢桿菌多個(gè)菌株具有高度的同源性。因此鑒定S10、S30為栗褐鏈霉菌，S20為枯草芽孢桿菌。

圖1 基于16S rDNA纖維素分解菌S10(A)、S20(B)、S30(C)的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 不同菌株組合對(duì)玉米秸稈降解效果的影響從不同菌株及其組合對(duì)玉米秸稈干物質(zhì)降解的影響(圖2)可以看出，不同單菌株和1∶1混合雙菌株以及1∶1∶1混合三菌株作用玉米秸稈，與對(duì)照相比，均有明顯的降解效果，玉米秸稈的干物質(zhì)降解率隨時(shí)間的延長而增長。在前期，各處理玉米秸稈干物質(zhì)降解率增長較快，在4～6 d時(shí)，不同菌株及其混合菌株組合對(duì)玉米秸稈干物質(zhì)降解率均較快，S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30分別增長49.89%、48.42%、47.47%、51.06%、57.00%、55.11%、53.69%，混合菌株處理玉米秸稈干物質(zhì)降解率均高于單菌株的，增長最快的是1∶1混合雙菌株S10S30；在后期，各處理玉米秸稈干物質(zhì)降解增長趨勢開始減緩，在6～8 d時(shí)，不同處理間的降解增長趨勢均較慢，S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30分別增長1.44%、1.26%、3.66%、9.59%、5.43%、6.82%、9.17%，增長最緩慢的是單菌株S20；在8～10 d，玉米干物質(zhì)降解率雖有增長，但增長趨勢不明顯。如圖2所示，混合三菌株S10S20S30對(duì)玉米秸稈干物質(zhì)降解率均為最高，可用于后期試驗(yàn)。

圖2 不同菌株組合對(duì)玉米秸稈干物質(zhì)降解率的影響

2.6 不同菌株組合對(duì)玉米秸稈的纖維素、半纖維素和總有機(jī)碳含量的影響測定玉米秸稈中纖維素、半纖維素、有機(jī)碳含量可以清晰反映菌株對(duì)玉米秸稈的降解作用，進(jìn)而挑選優(yōu)質(zhì)菌株應(yīng)用農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，解決秸稈堆肥的問題。從不同菌株對(duì)玉米秸稈中纖維素、半纖維素、總有機(jī)碳含量的影響(表3)可以看出，S10、S20、S30不同單菌株和1∶1混合雙菌株以及1∶1∶1混合三菌株S10S20S30處理后，與對(duì)照相比均差異顯著，玉米秸稈的纖維素、半纖維素、總有機(jī)碳的含量均有明顯的下降趨勢；S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30處理玉米秸稈，其纖維素含量與對(duì)照相比分別下降了14.74%、11.54%、7.80%、26.79%、23.27%、19.83%、27.21%，半纖維素含量分別下降了14.46%、9.42%、7.82%、19.36%、17.80%、14.23%、20.02%，總有機(jī)碳含量與對(duì)照相比分別下降了4.65%、3.50%、1.85%、7.59%、8.68%、9.68%、11.55%。綜上所述，混合三菌株S10S20S30對(duì)玉米秸稈的纖維素、半纖維素、總有機(jī)碳含量影響最大，單菌株S30為最弱，可選擇S10S20S30用于后期的試驗(yàn)。

表3 不同菌株組合對(duì)玉米秸稈的纖維素、半纖維素和總有機(jī)碳含量的影響

3 討論與結(jié)論

秸稈還田過程中使用纖維素降解菌劑可提高農(nóng)作物秸稈的降解速度，可以有效解決秸稈還田和堆肥問題[16]。耿麗平[17]研究發(fā)現(xiàn)在農(nóng)田施加纖維素降解菌培養(yǎng)30 d時(shí)使小麥植株生物量增加16.8%，常勇等[18]研究表明水稻中后期秸稈還田不僅增加水稻產(chǎn)量，還改善土壤理化性質(zhì)。多數(shù)研究表明秸稈降解改善土壤理化性質(zhì)，為植株根系正常生長發(fā)育提供良好的環(huán)境和所需的營養(yǎng)成分，從而增加作物產(chǎn)量[19-21]。該試驗(yàn)采用赫奇遜培養(yǎng)基分離纖維素降解菌，利用剛果紅平板法和濾紙崩析程度來篩選纖維素降解菌，這樣不僅可以保證篩選的菌株具有高效的纖維素分解能力，而且還能保證菌株的純化度；最后篩選出3株纖維素降解能力較強(qiáng)的單一菌株，根據(jù)16S rDNA基因序列分析結(jié)果，并且結(jié)合菌株的形狀、大小、顏色等確定S10為栗褐鏈霉菌、S20為枯草芽孢桿菌、S30為栗褐鏈霉菌。

秸稈中纖維素結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，降解纖維素是多種酶共同作用的效果。該試驗(yàn)通過不同菌株作用玉米秸稈，測其纖維素、半纖維素、總有機(jī)碳含量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然單菌株S10、S20、S30與對(duì)照相比有很好地降解玉米秸稈纖維素的效果，但混合菌株比單菌株有更好的作用效果，尤其是1∶1∶1混合三菌株效果最好；這可能是3種菌株有協(xié)同作用，增強(qiáng)了降解纖維素的能力。這與宮玉勝等[22]研究發(fā)現(xiàn)的混合菌株纖維素能力增強(qiáng)是高度相似的。該試驗(yàn)僅1∶1∶1混合三菌株作用于玉米秸稈，其他配比或者加入其他種菌株和其他降解纖維素物質(zhì)，其降解纖維素能力增強(qiáng)還是減弱仍然還需要后期試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；并且該菌株作用于實(shí)際田間，是否對(duì)土壤的理化性質(zhì)發(fā)生改變?nèi)匀恍枰M(jìn)一步證明。

綜上所述，混合菌株作用玉米秸稈的纖維素降解能力顯著高于單菌株；其中混合三菌株S10S20S30的降解纖維素能力最強(qiáng)，可作為高效纖維素降解菌，加快秸稈還田，減少環(huán)境污染，在降解玉米秸稈方面也有較大的開發(fā)前景。