陳帆，潘玉英,2*，徐青霞，劉銘華，楊金生，楊燦燦，牟成彬，藍(lán)青萍

1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022

2.浙江省海洋漁業(yè)裝備技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022

3.浙江海洋大學(xué)石油化工與環(huán)境學(xué)院，浙江舟山 316022

近年來，隨著海洋石油勘探開發(fā)項(xiàng)目的不斷涌現(xiàn)，溢油事件時(shí)有發(fā)生，必然會影響潮間帶生態(tài)環(huán)境.石油的主要成分是烴類，在200~300種之間，組分復(fù)雜[1].海洋溢油擴(kuò)散形成的油膜會影響海氣交換與光合作用，導(dǎo)致水體缺氧；同時(shí)，石油中含有的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)為溢油的主要致毒組分[2]，能夠?qū)е潞Ｑ笊顳NA被破壞甚至中毒死亡[3-4].潮間帶是海洋與陸地交匯的過渡地帶，其生態(tài)體系受到陸地和海洋的共同影響.當(dāng)潮間帶受到溢油污染后，石油會在潮汐作用下持續(xù)釋放，擴(kuò)散至沉積物深層或近岸，危害周圍生態(tài)環(huán)境[5].因此，探究潮間帶底棲生物能否作為石油污染評估的哨兵物種，并且尋找合適的生物標(biāo)志物來反映環(huán)境變化對生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要意義.

隨著環(huán)境監(jiān)測技術(shù)的不斷進(jìn)步，國內(nèi)外學(xué)者逐漸將目光聚焦于尋找合適的生物標(biāo)志物指示污染及評估其生物毒性效應(yīng).Turja等[6]通過抗氧化防御系統(tǒng)(antioxidant defense system，ADS)等一系列生物標(biāo)志物，探究油黑殼菜蛤(Mytilustrossulus)等生物暴露于原油中的變化，發(fā)現(xiàn)在2種高暴露濃度(0.120和0.750 mg/L)下，試驗(yàn)生物PAHs的累積呈在暴露前期增加、后期減少的特征，且不同類型PAHs在生物體的累積率存在顯著差異.蔣鳳華等[7]利用櫛孔扇貝(Chlamys farreri)鰓和消化腺組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性的變化來反映原油水溶性組分(water soluble fraction of crude oil，WSF)的生物毒性，結(jié)果表明，櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中SOD和CAT活性在時(shí)間-效應(yīng)上隨暴露時(shí)間的增加一般表現(xiàn)為降低?升高?降低的趨勢.Shirani等[8]分析經(jīng)長期石油污染的彈涂魚(Periophthalmuswaltoni)中5種生物標(biāo)志物的變化，發(fā)現(xiàn)7-乙氧基-3-異吩惡唑酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufin O-deethylase，EROD)、膽汁熒光芳香化合物(fluorescent aromatic compounds，F(xiàn)ACs)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione s-transferase，GST)對PAHs敏感，三者可能成為檢測石油污染的生物標(biāo)志物.王重剛等[9]研究發(fā)現(xiàn)，梭魚(Mugil so-iuy)暴露于低濃度苯并(a)芘(benzopyrene,BaP)和芘(Pyrene)后，其肝臟中SOD活性表現(xiàn)為被抑制，暴露于高濃度BaP和芘后SOD活性先被抑制后被誘導(dǎo).林芳等[10]發(fā)現(xiàn)，翡翠貽貝(Pernaviridis)暴露于BaP和滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane,DDT)污染24和48 h后，隨暴露濃度的升高SOD、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性均表現(xiàn)為先被抑制后被誘導(dǎo).

生物標(biāo)志物中的抗氧化酶系統(tǒng)對環(huán)境污染響應(yīng)靈敏，且具備早期預(yù)警功能[11-12].SOD、CAT、GST、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)等在協(xié)同、互補(bǔ)、代償、保護(hù)等作用下，能夠幫助生物體在污染暴露時(shí)清除活性氧自由基(reactive oxygene species，ROS)，從而降低細(xì)胞損傷程度，保護(hù)機(jī)體[13-14].根據(jù)污染物對生物的毒性效應(yīng)，可選取幾種在特定生物中對污染有顯著響應(yīng)的生物標(biāo)志物來檢測污染[15].綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(integrated biomarker response，IBR)作為一種更全面可靠的指標(biāo)，目前已被應(yīng)用于生物毒性效應(yīng)評估[16-17]，該指標(biāo)通過整合量化多個(gè)不同生物標(biāo)志物進(jìn)行綜合分析，判斷綜合生物毒性響應(yīng).

海洋生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜且生物種類繁多，少量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)樣本不足以滿足污染評估的實(shí)際需求，國內(nèi)外開展了許多關(guān)于石油烴對海水中魚類、貝類中生物酶活性的研究，但有關(guān)潮間帶沉積物原油污染對底棲生物酶活性影響及IBR綜合評價(jià)的研究較少，尤其是對潮間帶典型濾食性生物—泥蚶(Tegillarca granosa)的毒性效應(yīng)研究更為鮮見.因此，該研究以泥蚶作為受試生物，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬受不同濃度原油污染的潮間帶生境，以SOD、CAT、GST和GPx活性為測定指標(biāo)，探究原油污染下泥蚶鰓和消化腺中抗氧化酶活性的變化，并通過IBR指標(biāo)評估原油污染對泥蚶的綜合生物毒性效應(yīng)，以期為潮間帶生物及環(huán)境保護(hù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器選用紫外可見分光光度計(jì)(UV-1100B型，上海美譜達(dá)儀器有限公司)、高速離心機(jī)12Pro(寧波群安電子科技有限公司)、XH-C旋渦混合器(常州越新儀器制造有限公司)、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)等.試驗(yàn)試劑以SOD、CAT、GST和GPx試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)及無水乙醇和冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等分析純?yōu)橹?

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用泥蚶購自浙江省舟山市老街菜市場.原油取自舟山市岙山島，為流動相輕質(zhì)原油.海水為實(shí)驗(yàn)室自配海水，鹽度為19.00±1.00.沉積物取自舟山市長峙島馬鞍村附近潮間帶，晾干后篩至粒徑小于1 mm備用.室內(nèi)模擬泥蚶實(shí)際生存環(huán)境，沉積物本身含有鹽分導(dǎo)致上層海水鹽度最終升至24.50±1.00，介于泥蚶最適生存鹽度20.0~26.2之間[18].

1.3 試驗(yàn)方法

參照GB 18668?2002《海洋沉積物質(zhì)量》(石油類含量一類、二類和三類標(biāo)準(zhǔn)分別為500、1 000和1 500 mg/kg)，并結(jié)合實(shí)際溢油后高濃度污染情況，設(shè)置對照組和5個(gè)原油濃度處理組，各試驗(yàn)組原油濃度分別為0、500、1 000、1 500、10 000和15 000 mg/kg，每組設(shè)3個(gè)平行.基于原油濃度差異，規(guī)定1 500 mg/kg及以下的濃度組為低濃度處理組，高于1 500 mg/kg的濃度組為高濃度處理組.按照不同設(shè)置組別，分別選用體積為44 cm×30 cm×26 cm的聚乙烯養(yǎng)殖槽，先加入與原油混合均勻的5 kg沉積物，后加入5 kg實(shí)驗(yàn)室自配海水靜置24 h.選取暫養(yǎng)一周后平均殼質(zhì)量為(10.36±1.13)g的泥蚶，隨機(jī)分成18組，每組50只，平均安置于室內(nèi)模擬環(huán)境中.試驗(yàn)期間連續(xù)充氧，控制溶解氧濃度為(9.40±0.50)μmol/L，水溫為17.50~18.50℃，每隔72 h換水50%.不同處理組及對照組沉積物和上層海水原油濃度的理論值和試驗(yàn)期間的實(shí)測平均值如表1所示，結(jié)果顯示實(shí)測環(huán)境原油濃度較理論值普遍偏高.上述結(jié)果可能是由于沉積物本身含有部分石油；除此之外，供試沉積物有機(jī)質(zhì)含量較高(委托浙江省海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心測定沉積物中有機(jī)質(zhì)含量為6 920 mg/kg)，處理組添加的石油可能會溶解部分有機(jī)質(zhì)，導(dǎo)致實(shí)測原油濃度偏高.由于沉積物中部分原油會釋放至上層海水，故隨著暴露濃度的升高，上覆水中原油含量增加.

表1 不同試驗(yàn)組沉積物和上層海水中原油濃度的理論值和實(shí)測平均值Table 1 Theoretical and average measured values of oil concentration in sediment and upper seawater at different test groups

試驗(yàn)中分別于第1、3、6、9、12天采樣，每次隨機(jī)選取2只泥蚶.為方便分析，規(guī)定第1、3天為污染前期，第6天為污染中期，第9、12天為污染后期.采樣時(shí)仔細(xì)分離出鰓與消化腺，用預(yù)冷的超純水沖洗并用濾紙吸干水分，稱量并轉(zhuǎn)移至凍存管中用液氮冷凍，?20℃保存.

1.4 樣品預(yù)處理

取于冰浴條件下研磨后的鰓與消化腺，按體積比為1∶3添加86%的生理鹽水，制成25%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min.根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，鰓中SOD、CAT、GST、GPx、蛋白質(zhì)測定所需最佳取樣濃度分別為2.5%、2%、5%、20%、2%，而消化腺中最佳取樣濃度分別為2.5%、2.5%、2.5%、20%、2%.依據(jù)不同組織中各指標(biāo)最佳取樣濃度，取適量25%組織勻漿離心后的上清液，用生理鹽水稀釋，用于酶活性以及蛋白含量的測定.

1.5 酶活性與蛋白含量測定

抗氧化酶(SOD、CAT、GST和GPx)活性和總蛋白含量測定均嚴(yán)格按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行.根據(jù)試劑盒說明并參照文獻(xiàn)[19]，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性(U/mg，以每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量計(jì))；參照鉬酸銨法測定CAT活性(U/mg，以每mg組織蛋白每s分解1μmol H2O2的量計(jì))；依據(jù)分光光度法測定GST和GPx活性〔U/mg，以每mg組織蛋白每min扣除非酶促反應(yīng)使反應(yīng)體系中谷胱甘肽(GSH)濃度降低1μmol/L的量計(jì)〕；蛋白含量參考考馬斯亮藍(lán)法測定.

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 差異顯著性分析

采用SPSS軟件進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，以單因素(ANOVA)方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，其中，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著.通過比較4種酶活性的最大誘導(dǎo)率及最大抑制率〔見式(1)〕，可進(jìn)一步分析泥蚶鰓和消化腺在不同時(shí)間點(diǎn)對不同濃度原油的敏感性.

式中：I為誘導(dǎo)率或抑制率；Ni為試驗(yàn)組受誘導(dǎo)后的酶活性，U/mg；N0為相應(yīng)對照組的酶活性，U/mg.I值>0，表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用；I值<0，表現(xiàn)為抑制作用.

1.6.2 IBR分析

將SOD、CAT、GST和GPx作為4種目標(biāo)生物標(biāo)志物，進(jìn)行IBR計(jì)算.將每種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)按濃度、時(shí)間均一化處理，然后與所有取樣時(shí)間點(diǎn)中該標(biāo)志物均一化數(shù)據(jù)最小值的絕對值相加計(jì)算得到各時(shí)間點(diǎn)單個(gè)生物標(biāo)志物的得分(Bi值)，并轉(zhuǎn)化為星狀圖中輻射線的長度，最后計(jì)算星狀圖三角形面積之和可得IBR值[19].

2 結(jié)果與分析

2.1 原油污染對泥蚶鰓中SOD、CAT、GST、GPx活性變化的影響

受原油污染后，泥蚶鰓4種酶活性變化如圖1所示，在不同原油污染濃度和暴露時(shí)間下4種酶活性存在差異.由圖1(a)可見，時(shí)間-效應(yīng)上，隨著污染暴露時(shí)間的延長，泥蚶鰓各試驗(yàn)組的SOD活性均呈升高?降低?升高的變化特征，在污染第3天處理組1的SOD活性達(dá)到峰值(210.220 U/mg).劑量-效應(yīng)上，隨原油濃度的上升，除第1天處理組2和第9天處理組3外，第1、6、9天各試驗(yàn)組SOD活性總體呈先降低后升高的趨勢；第12天除處理組4外，其余試驗(yàn)組的SOD活性總體呈先升高后降低的趨勢，與第3天變化趨勢一致.總體上，高濃度處理組泥蚶鰓中的SOD活性在第1、3、9天表現(xiàn)為被抑制，在低濃度處理組SOD活性隨時(shí)間能夠逐漸恢復(fù)至接近對照組的水平.

圖1 不同濃度原油污染對泥蚶鰓中4種酶活性的影響Fig.1 Effectsof crude oil on four enzyme activities in gills of Tegillarca granosa

由圖1(b)可見，隨處理時(shí)間的增加，各試驗(yàn)組CAT活性總體呈先降低后升高的趨勢.在暴露于原油第6天后，泥蚶鰓的CAT活性降至最低點(diǎn).隨原油濃度的上升，CAT活性在第1天表現(xiàn)為先被抑制后被誘導(dǎo)的特征，在第6天原油對CAT活性的抑制效果增強(qiáng).第12天，處理組1鰓中CAT活性升至試驗(yàn)期峰值(242.08 U/mg)，且此時(shí)CAT活性顯著高于對照組(P<0.05).各試驗(yàn)組CAT活性在第6天均降至最低.

由圖1(c)可見，隨處理時(shí)間的增加，各處理組GST活性隨時(shí)間總體呈先降低后升高的趨勢，且在第6或第9天達(dá)最低值，而對照組GST活性則持續(xù)下降.隨原油濃度的上升，各處理組GST活性在試驗(yàn)前期(第1、3天)總體呈被抑制趨勢，活性逐漸降低，而試驗(yàn)后期(第12天)呈先強(qiáng)后弱的被誘導(dǎo)趨勢.第3天，處理組3、4的GST活性均顯著低于對照組(P均小于0.05)，分別為159.63、203.11 U/mg；第12天，處理組2的GST活性為158.89 U/mg，顯著高于對照組(P<0.05).總體而言，第3天是泥蚶鰓GST活性大幅下降的一個(gè)時(shí)間分界點(diǎn)，且各處理組GST活性在污染前期被抑制，在污染后期被誘導(dǎo).

由圖1(d)可見，隨處理時(shí)間的增加，除處理組3外，其他試驗(yàn)組泥蚶GPx活性均呈先降低后升高的趨勢，處理組3的GPx活性在第12天出現(xiàn)下降.在受原油污染的第6天，各處理組GPx活性均降至試驗(yàn)期最低值.隨原油濃度的上升，第3天各處理組GPx活性整體表現(xiàn)為被誘導(dǎo)，第12天則表現(xiàn)為被抑制，其中第3天處理組1的GPx活性(85.29 U/mg)極顯著高于對照組(P<0.01)，處理組4的GPx活性(78.12 U/mg)顯著高于對照組(P<0.05).總體上，隨處理時(shí)間的變化各試驗(yàn)組鰓中GPx活性總體變化規(guī)律較明顯.

2.2 原油污染對泥蚶消化腺中SOD、CAT、GST、GPx活性變化的影響

暴露于原油后，泥蚶消化腺4種酶活性變化如圖2所示.由圖2(a)可見，時(shí)間-效應(yīng)上，隨處理時(shí)間的增加，除處理組1外，其余處理組消化腺中SOD活性總體呈先降低后升高的趨勢，且均在第9天出現(xiàn)最低值.劑量-效應(yīng)上，受低濃度原油污染時(shí)泥蚶消化腺中SOD活性被誘導(dǎo)，受高濃度原油污染時(shí)被抑制，其中第12天各處理組的SOD活性差異最明顯.第1天處理組3、4和第12天處理組3、5的SOD活性均顯著低于對照組(P均小于0.05)；而第12天處理組1的SOD活性(56.47 U/mg)極顯著低于對照組(P<0.01).受原油污染后，各處理組泥蚶消化腺中SOD活性在試驗(yàn)前期和后期的變化與對照組差異較大.

圖2 不同濃度原油污染對泥蚶消化腺中4種酶活性的影響Fig.2 Effects of crude oil on four enzyme activities in digestive gland of Tegillarca granosa

由圖2(b)可見，隨處理時(shí)間的增加，各試驗(yàn)組CAT活性總體呈先降低后升高的趨勢.隨原油濃度的上升，第3、6天各處理組泥蚶消化腺中CAT活性較穩(wěn)定，第1、9天呈先被誘導(dǎo)后被抑制的趨勢，而第12天總體被抑制，且第12天處理組1、3、5的CAT活性均顯著低于對照組(P均小于0.05).總體上，在污染后期，泥蚶消化腺中CAT活性開始與對照組出現(xiàn)顯著差異.

由圖2(c)可見，隨處理時(shí)間的增加，除2個(gè)高濃度處理組GST活性呈“W”型變化特征外，其余各試驗(yàn)組GST活性總體呈先降低后升高的趨勢，各處理組GST活性均在第3天降至最低值.受低濃度原油污染時(shí)，泥蚶消化腺GST活性于第1、9天總體表現(xiàn)為被誘導(dǎo)；受高濃度原油污染時(shí)被抑制，而第3、12天總體表現(xiàn)為被抑制.其中，第3天處理組4的原油濃度(10 000 mg/kg)對泥蚶消化腺中GST活性抑制效果最強(qiáng)，其活性(46.14 U/mg)極顯著低于對照組(P<0.01)；另外，第3天處理組1、5的GST活性均顯著低于對照組(P均小于0.5)，分別為145.32、136.73 U/mg.總體上，第3天泥蚶消化腺中GST對原油污染最敏感，具體表現(xiàn)為GST活性與對照組相比被顯著抑制.

由圖2(d)可見，隨處理時(shí)間的增加，試驗(yàn)組GPx活性總體呈升高?降低?升高的趨勢，高濃度處理組的GPx活性均在第9天降至最低值后回升.隨原油濃度的上升，污染前期(第1、3天)各試驗(yàn)組GPx活性均被不同程度的抑制，而污染后期(第9、12天)則呈低濃度污染時(shí)被誘導(dǎo)、高濃度污染時(shí)被抑制的特征. 另外，第1天處理組1的GPx活性(19.67 U/mg)顯著低于對照組(P<0.05).總體上，各處理組消化腺中GPx活性在第6天與對照組最接近.

結(jié)合圖1、2發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組鰓和消化腺中4種酶活性隨處理時(shí)間的增加均存在不同程度的降低后回升的現(xiàn)象，其中鰓中SOD和消化腺中GPx活性在第3天還出現(xiàn)短暫升高現(xiàn)象.另外，低濃度處理組酶活性回升時(shí)間早于高濃度處理組，可能是泥蚶鰓和消化腺對低濃度原油有較好的適應(yīng)能力或在此環(huán)境中仍有較好的自我調(diào)節(jié)能力.

2.3 鰓和消化腺中4種酶活性的最大誘導(dǎo)率及最大抑制率

原油對泥蚶鰓和消化腺中4種酶活性的最大誘導(dǎo)率、最大抑制率及其對應(yīng)原油濃度和出現(xiàn)時(shí)間如表2所示.由表2可見：除鰓中GPx外，2種組織中4種酶活性的最大誘導(dǎo)率均出現(xiàn)在低濃度處理組的污染后期(第9、12天)；除鰓中GST、GPx以及消化腺中GPx外，2種組織中4種酶活性最大抑制率均出現(xiàn)在高濃度處理組，出現(xiàn)時(shí)間均在9天前.此外，原油對鰓中4種酶活性的最大誘導(dǎo)率均大于最大抑制率.與SOD和CAT相比，2種組織中GST和GPx的最大抑制率出現(xiàn)時(shí)間更早.

表2 泥蚶鰓和消化腺中4種酶活性的最大誘導(dǎo)率及最大抑制率Table2 Maximum induction rates/inhibition rates of four enzyme activitiesin gills and digestive gland of Tegillarca granosa

2.4 鰓和消化腺中4種酶活性的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBR)變化

根據(jù)取樣時(shí)間，不同原油濃度脅迫下泥蚶鰓和消化腺中4種抗氧化酶活性均一化處理后得分(Bi)的星狀圖如圖3、4所示.由圖3、4可見：在污染前期(第1、3天)鰓中SOD和GST的Bi值分別激增和驟降，到污染中期(第6天)GPx的Bi值驟降，而在污染后期(第9、12天)CAT和GPx的Bi值較高；消化腺中SOD、CAT和GST的Bi值在污染前期(第1、3天)驟降，在污染中期(第6天)4種酶的Bi值均較低，而在污染后期(第9、12天)SOD和GPx的Bi值均隨原油濃度變化較大.

圖3 泥蚶鰓中4種酶活性的Bi值星狀圖Fig.3 Bi value star plots of four enzyme activitiesin gill of Tegillarca granosa

圖4 泥蚶消化腺中4種酶活性的Bi值星狀圖Fig.4 Bi value star plotsof four enzymeactivities in digestive gland of Tegillarca granosa

通過計(jì)算上述星狀圖面積，得到泥蚶鰓和消化腺中4種酶的IBR值.由圖5可見，各試驗(yàn)組泥蚶2種組織的IBR值均隨處理時(shí)間的增加呈先降低后升高的趨勢.鰓和消化腺中4種酶的IBR值分別于第6天、第9天降至最低值后回升，但消化腺中回升幅度遠(yuǎn)大于鰓.鰓中4種酶的IBR最高值出現(xiàn)在第1天，而消化腺中出現(xiàn)在第12天.2種組織中各處理組的IBR值均在第6天與對照組最接近，而在污染后期(第9、12天)，與鰓相比，消化腺中高濃度處理組的IBR值與對照組差異更大.

圖5 不同試驗(yàn)組泥蚶鰓和消化腺中4種酶的IBR值隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of IBR values in gills and digestive gland of Tegillarca granosa with time in different experimental groups

3 討論

3.1 原油暴露后泥蚶鰓和消化腺中4種抗氧化酶活性的變化

抗氧化酶活性變化是一個(gè)動態(tài)過程，能指示生物氧化脅迫和氧化損傷程度[20].當(dāng)生物抗氧化和解毒能力下降及污染物脅迫超出防御系統(tǒng)自我修復(fù)能力時(shí)，可能出現(xiàn)中毒反應(yīng)[21].石油烴進(jìn)入水生生物體后，可通過自身或中間代謝產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基、H2O2等，使機(jī)體無法維持低水平、穩(wěn)定平衡的生理性自由基含量而造成機(jī)體細(xì)胞非特異性氧化損傷[22].

SOD作為抵抗ROS的第一道防線，是以氧自由基連鎖反應(yīng)前體物超氧陰離子自由基為唯一底物的天然酶類清除劑，當(dāng)受到外界污染脅迫時(shí)，其活性變化較其他幾種抗氧化酶更靈敏[19].筆者研究發(fā)現(xiàn)，消化腺中SOD平均活性(132.29 U/mg)約為鰓(69.34 U/mg)的2倍.尚泰宇等[23]在生物脅迫試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在高濃度氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)污染環(huán)境下，生物體內(nèi)SOD活性隨污染物濃度的升高呈先被誘導(dǎo)后被抑制的趨勢，與筆者試驗(yàn)中SOD活性的劑量-效應(yīng)結(jié)果基本相符.針對處理組5中SOD活性基本都小于對照組的現(xiàn)象，可能是高濃度(15 000 mg/kg)原油對泥蚶鰓和消化腺造成了一定的不可逆損傷，故處理組SOD活性無法回升至對照組水平[9-10].

CAT能催化H2O2生成水和氧氣，避免過多的ROS堆積，從而保護(hù)機(jī)體[24-25].在解毒作用上，SOD與CAT具有協(xié)同作用，但活性變化存在時(shí)間差.隨著污染物濃度的增加，鰓和消化腺中CAT與SOD的活性變化趨勢相同或部分相同[26].在原油暴露第1天，鰓中CAT活性隨原油濃度的升高先被抑制后被誘導(dǎo)，與黃海膽(Glyptocidariscrenularis)在低濃度180號燃料油污染暴露試驗(yàn)中CAT活性被抑制[27]的結(jié)果相同.參照最大誘導(dǎo)率及最大抑制率的結(jié)果(見表2)，在高濃度原油污染暴露下，泥蚶CAT總體比SOD更敏感，因此與SOD相比，CAT更適合作為高濃度石油污染監(jiān)測的生物標(biāo)志物.

GST是一種具有多種生理功能的同工酶，是生物體內(nèi)重要的解毒酶，發(fā)揮解毒與清除體內(nèi)活性氧自由基的雙重功能[8,28].在時(shí)間-效應(yīng)上，鰓中GST活性總體表現(xiàn)為先被抑制后被誘導(dǎo)；劑量-效應(yīng)上，處理組GST活性在試驗(yàn)后期(第9、12天)總體呈先升高后降低的特征，此規(guī)律與已有研究結(jié)果[29]相符.對比最大誘導(dǎo)率和最大抑制率發(fā)現(xiàn)，在高濃度原油暴露環(huán)境(處理組4)中，消化腺中GST活性能在短時(shí)間內(nèi)(第3天)被顯著抑制.結(jié)合筆者研究及已有研究成果[30-31]，GST有望成為短期高濃度石油污染監(jiān)測的高效生物標(biāo)志物.

GPx利用GSH作為底物，能與抗氧化防御系統(tǒng)中的SOD和CAT一起將超氧陰離子自由基和H2O2還原為H2O，從而保護(hù)生物體[19,32].時(shí)間-效應(yīng)上，泥蚶鰓中GPx活性總體表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，消化腺中則相反.劑量-效應(yīng)上，消化腺中GPx活性在原油污染前期被抑制；在后期，低濃度原油污染時(shí)被誘導(dǎo)，在高濃度原油污染時(shí)被抑制，與大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)原油污染暴露試驗(yàn)結(jié)果[33]相同.筆者研究顯示，泥蚶鰓和消化腺中GPx活性的最大抑制率在原油濃度較低、污染時(shí)間較短時(shí)出現(xiàn)，表明泥蚶鰓和消化腺中GPx活性都能在短時(shí)間內(nèi)對外界污染脅迫作出反應(yīng).比較泥蚶鰓和消化腺中GPx對原油污染脅迫時(shí)的活性變化發(fā)現(xiàn)，鰓中GPx對原油更敏感，表明受原油污染脅迫時(shí)鰓中GPx活性的激發(fā)程度更高或鰓是GPx發(fā)揮作用的主要器官.

在抗氧化酶發(fā)揮其防御作用時(shí)，SOD最先參與反應(yīng)，而其中間產(chǎn)物H2O2可作為CAT的催化底物，也能作為GPx的部分底物.上述3種酶與作為Ⅱ相解毒酶的GST形成一個(gè)整體，最終對生物起到保護(hù)作用.結(jié)合時(shí)間-效應(yīng)與劑量-效應(yīng)，受原油污染后，泥蚶鰓中SOD與CAT活性能較快恢復(fù)至對照組水平，而GST與GPx活性均能在污染前期做出較強(qiáng)烈的反應(yīng)；消化腺中CAT活性變化晚于SOD，而GST活性較GPx更早表現(xiàn)出受原油污染的特征.綜上，生物作為有機(jī)整體，其抗氧化酶活性的變化是一個(gè)連鎖反應(yīng)，各種酶對于清除ROS具有協(xié)同作用.

3.2 原油暴露對泥蚶毒性效應(yīng)的IBR評價(jià)

將各生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果以星狀圖的形式呈現(xiàn)，有助于深入挖掘綜合生物毒性效應(yīng)[34].通過觀察星狀圖面積的變化，可更直觀地展現(xiàn)出泥蚶受原油污染脅迫的時(shí)間-效應(yīng)與劑量-效應(yīng).筆者研究發(fā)現(xiàn)，鰓中4種酶IBR最低值出現(xiàn)的時(shí)間早于消化腺；在污染后期，與鰓相比，泥蚶消化腺中4種酶的IBR值與對照組差異更大.總體而言，鰓和消化腺中4種酶的IBR值變化與4種酶的活性變化趨勢基本吻合，表明IBR可作為評估原油污染對潮間帶生物綜合生物毒性效應(yīng)的有效指標(biāo)[35].

4 結(jié)論

a)泥蚶受原油污染后，鰓和消化腺中SOD、CAT、GST和GPx的活性均表現(xiàn)出不同程度的被誘導(dǎo)或被抑制的效應(yīng)，通過比較2種組織的抗氧化酶活性大小、最大誘導(dǎo)率及最大抑制率對應(yīng)的濃度和出現(xiàn)時(shí)間發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶活性變化是一個(gè)受多種因素影響制約的動態(tài)過程.

b)根據(jù)生物體代謝機(jī)制，4種酶存在相互作用.SOD和CAT協(xié)同解毒作用在鰓和消化腺中均有體現(xiàn)，SOD活性總體表現(xiàn)為受低濃度原油污染時(shí)被誘導(dǎo)，受高濃度原油污染時(shí)被抑制的特征.CAT活性在時(shí)間-效應(yīng)上與SOD活性變化規(guī)律相似，但其響應(yīng)時(shí)間具有滯后性，GST與GPx活性的時(shí)間-效應(yīng)總體相似.

c)從原油污染對4種抗氧化酶活性影響的角度分析，泥蚶消化腺中酶活性的變化較腮中更具規(guī)律性和顯著性.GST和GPx作用機(jī)理相似，且對高濃度原油污染的生物響應(yīng)更高效和顯著.因此，對比其他抗氧化酶與組織，該研究中泥蚶消化腺中GST更適于作為短期高濃度石油污染監(jiān)測的有效生物標(biāo)志物.

d)通過計(jì)算IBR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，泥蚶鰓和消化腺的IBR值均隨暴露時(shí)間的增加呈先降低后升高的趨勢.星狀圖和IBR值能更直觀且全面深入地探討綜合生物毒性效應(yīng)，因此IBR可作為綜合生物毒性評價(jià)的指標(biāo).