張 肖，楊鴻林，蔡 輝，沈 昊，顧 兵

1.蘇州市第九醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 215200；2.江蘇盛澤醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 215200；3.廣東省人民醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510080

尿路感染是臨床常見的感染性疾病。近年來，細菌耐藥情況日趨嚴重，泌尿系統(tǒng)病原菌的耐藥機制各不相同。為了解住院患者尿路感染病原菌的耐藥情況，更好地實現尿培養(yǎng)標本的快速報告，快速提供抗菌藥物選擇依據，本研究利用VITEK 2 XL對住院患者中段尿培養(yǎng)陽性標本進行常規(guī)鑒定與藥敏試驗，并對同一標本進行尿流式細胞術菌量計數、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術直接鑒定。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2021年1-10月蘇州市第九醫(yī)院住院的296例泌尿系統(tǒng)感染患者送檢的清潔中段尿培養(yǎng)陽性標本。

1.2儀器與試劑 全自動接種儀(法國生物梅里埃公司);VITEK 2 XL全自動微生物鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)；MALDI-TOF MS儀及配套試劑(德國布魯克道爾頓公司)；UF-1000i尿流式細胞儀及配套試劑(希森美康有限公司)；血瓊脂平板(鄭州安圖生物技術公司)。

1.3方法

1.3.1尿液標本采集、保存及處理 標本采集按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準[1]留取尿液。采集方法包括：清潔中段尿采集、恥骨上膀胱穿刺采集、留置導尿管采集、膀胱導尿采集、嬰幼兒尿液采集袋采集及其他不常用的尿液采集方法(如回腸導管導尿采集、間歇性導尿管采集、腎盂造瘺術、輸尿管造口術、膀胱鏡檢查術采集等)。中段尿標本2 h內進行接種，否則應置于4～8 ℃冰箱保存，時間不得超過8 h。

1.3.2常規(guī)鑒定與藥敏試驗 使用全自動接種儀定量(10 μL)清潔中段尿接種于血平板，于35 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育18～24 h。經次代培養(yǎng)后取平板上的菌落(一種病原菌)，根據革蘭染色情況，用0.45%無菌氯化鈉溶液調節(jié)菌懸液至0.50～0.63麥氏濁度(MCF)。革蘭陽性菌采用移液器吸取280 μL菌懸液加入3.0 mL 0.45%無菌氯化鈉溶液中做藥敏試驗，分別在兩試管放鑒定卡(GP)和藥敏卡(GP-67)；革蘭陰性桿菌采用移液器吸取145 μL菌懸液加入3.0 mL 0.45%無菌氯化鈉溶液中做藥敏試驗，分別于3試管放鑒定卡(GN)、藥敏卡(GN-67和XN-04)，放入VITEK 2 XL全自動鑒定藥敏儀充液和上機，6～8 h后記錄儀器檢測結果。

1.3.3直接鑒定(MALDI-TOF MS直接鑒定法)[2]采用UF-1000i尿流式細胞儀計數尿液中的菌量，選擇中段尿菌量計數>105個/毫升的標本(一種病原菌)。取收集的清潔中段尿標本1.0 mL于1.5 mL EP管中，2 000×g離心30 s去除細胞，取上清液于15 500×g離心5 min收集細菌，取沉渣用無菌生理鹽水500 μL清洗1次，自然干燥，加5 μL 70%甲酸及5 μL 100%乙腈，混勻，取沉淀物1 μL點靶，室溫干燥后加1 μL基質[α-氰基4-羥基肉桂酸(HCCA)]覆蓋，待干燥后用MALDI-TOF MS技術進行鑒定。由MALDI-TOF MS鑒定分值來確定結果的可靠性。

1.3.4鑒定結果評定 MALDI-TOF MS的鑒定分值≥2.0時，表示鑒定到種，結果可信；鑒定分值在1.7～<2.0時，表示鑒定到屬；鑒定分值<1.7時，表示鑒定結果不可信。

1.3.5直接藥敏試驗 使用UF-1000i尿流式細胞儀計數尿液中的菌量，將中段尿菌量計數>105個/毫升的標本按100～300、500～1 100、500～1 500、1 300～1 900、1 700～1 900個/微升進行稀釋，采用VITEK 2 XL全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行直接藥敏試驗，分析結果。

1.3.6常規(guī)藥敏試驗 尿培養(yǎng)陽性標本轉種培養(yǎng)獲得純菌落后，根據細菌的菌落形態(tài)及革蘭染色情況，分別將革蘭陽性球菌懸液稀釋后加入至GP-67藥敏卡，將革蘭陰性桿菌懸液稀釋后加入至GN-67和XN-04，并使用VITEK 2 XL系統(tǒng)進行藥敏試驗[最低抑菌濃度(MIC)法]，具體方法見廠家提供的藥敏試驗操作程序。藥敏試驗最終以美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯藥敏手工法進行藥敏試驗準確性評估。

1.3.7判斷標準及質控菌株 按照CLSI 《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》規(guī)則進行判斷，符合率為實驗方法與常規(guī)方法的結果一致性。非常重大錯誤：直接藥敏為敏感(S)而常規(guī)藥敏為耐藥(R)。重大錯誤：直接藥敏為R而常規(guī)藥敏為S。微小錯誤：直接藥敏為R或S而常規(guī)藥敏為中介(I)，直接藥敏為I而常規(guī)藥敏為R或S。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC13883、銅綠假單胞ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212。

1.4統(tǒng)計學處理 采用世界衛(wèi)生組織細菌耐藥性監(jiān)測網推薦的WHONET5.6軟件及SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計數資料以例數或率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1VITEK 2 XL鑒定法與MALDI-TOF MS技術直接鑒定法結果對比 在MALDI-TOF MS直接法鑒定結果中，鑒定到種水平的有278例(93.9%)，鑒定到屬水平的289例(97.6%)，沒有提供可靠鑒定結果的7例(2.3%)。次代培養(yǎng)后VITEK 2 XL鑒定結果符合率為100.0%。兩種鑒定法的鑒定結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 VITEK 2 XL鑒定法與MALDI-TOF MS鑒定法結果對比

2.2直接藥敏實驗結果與常規(guī)藥敏結果對比

2.2.1革蘭陰性菌 菌量計數100～300個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率、非常重大誤差率、重大誤差率和微小誤差率分別為99.1%(2 650/2 674)、0.3%(8/2 674)、0.2%(6/2 674)和0.4%(10/2 674)；菌量計數500～1 100個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率99.9%(2 670/2 674)，微小誤差0.1%(4/2 674)，未發(fā)生非常重大誤差和重大誤差；菌量計數1 300～1 900個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率98.9%(2 644/2 674)，1例無結果[0.03%(1/2 674)]，重大誤差0.4%(12/2 674)，微小誤差0.6%(17/2 674)。由于CLSI關于腸桿菌科、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌的藥物種類判斷標準不一致，所以不同抗菌藥物細菌藥敏總數不完全一致。分析不同種屬革蘭陰性菌的藥敏結果，腸桿菌目和非發(fā)酵菌屬直接藥敏試驗結果中亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和左旋氧氟沙星在3種菌量計數區(qū)間未出現誤差，其藥敏結果非常可靠。

2.2.2革蘭陽性菌 菌量計數100～300個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率、非常重大誤差率、重大誤差率和微小誤差率分別為98.7%(1 174/1 190)、0.3%(3/1 190)、0.9%(11/1 190)和0.2%(2/1 190)；菌量計數500～1 500個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率99.7%(1 187/1 190)，微小誤差0.3%(3/1 190)，未發(fā)生非常重大誤差和重大誤差；菌量計數1 300～1 900個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率99.2%(1 180/1 190)，重大誤差0.08%(1/1 190)，微小誤差0.7%(8/1 190)。由于CLSI關于葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬的藥物種類判斷標準不一致，所以不同抗菌藥物細菌藥敏總數不是完全一致。葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬直接藥敏試驗結果中克林霉素、高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素和四環(huán)素在3種菌量計數區(qū)間未出現誤差，結果可靠。

3 討 論

常規(guī)方法對尿培養(yǎng)陽性標本進行細菌鑒定及藥敏實驗通常需要2～3 d才能出具報告，歷時較長。本研究評估了UF-1000i與MALDI-TOF MS技術的聯合直接分析中段尿培養(yǎng)標本中病原菌的效果，該方法減少了病原菌鑒定的時間，再加上直接藥敏試驗，將結果報告時間至少可提前24 h，有利于臨床及時選擇有效的抗菌藥物，避免經驗用藥。

目前，尿培養(yǎng)陽性的MALDI-TOF MS技術直接鑒定與儀器法直接藥敏試驗的研究并不多。2018年本課題組研究發(fā)現，UF-1000i進行尿菌量計數>105個/毫升采用MALDI-TOF MS直接鑒定結果可靠[2]。在此次試驗鑒定結果中，MALDI-TOF MS沒有提供可靠鑒定結果的占2.3%，原因可能是存在一些影響因素，差速離心法并不能完全保證病原菌與細胞和雜蛋白等徹底分離，帶有雜質的標本懸液可能造成質譜分值降低，鑒定不出或菌種錯判[3]。目前臨床引起尿路感染的病原菌相對比較單一，以大腸埃希菌為主，而采用MALDI-TOF MS技術快速鑒定尿標本中病原菌時大腸埃希菌鑒定率高達92.0%，體現了較高的臨床應用價值[4]。此外，可通過增加差速離心次數和甲酸乙腈萃取步驟，結合尿流式細胞術(有形成分中亞硝酸鹽、白細胞酯酶、細菌)等其他輔助手段來提高鑒定率，以實現MALDI-TOF MS技術快速鑒定。

本研究結果顯示，革蘭陰性菌的MALDI-TOF MS技術快速鑒定中，鑒定到屬的檢出率為100.0%，鑒定到種的檢出率為95.3%；革蘭陽性菌鑒定到屬的檢出率為95.2%，鑒定到種的檢出率為89.5%。根據革蘭陰性菌繁殖速度的生長特點，雖然基本條件是尿菌量計數>105個/毫升，但研究發(fā)現革蘭陰性菌的菌量計數顯著高于革蘭陽性菌，鑒定效果較革蘭陽性菌為好[5]。本研究中，兩種鑒定方法的鑒定結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但直接鑒定在時間上較傳統(tǒng)鑒定法快至少24 h，有明顯優(yōu)勢。另外，隨著MALDI-TOF MS的快速鑒定應用越來越廣泛，有學者提出“短期培養(yǎng)法”，4～6 h后采集菌膜并用MALDI-TOF MS直接檢測，準確率可得到明顯提高[6]。早期研究有學者報道可通過紙片法(K-B)做直接藥敏試驗，但近年研究顯示，可以通過MALDI-TOF MS技術檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌及其表型，以及快速檢測泛耐藥鮑氏不動桿菌等[7-8]。

本研究在MALDI-TOF MS鑒定結果基礎上，對296例泌尿系統(tǒng)感染患者尿培養(yǎng)常見細菌直接進行藥敏試驗。革蘭陰性桿菌菌量計數500～1 100個/微升時有4株出現微小誤差，此革蘭陰性桿菌計數水平的尿液最合適做直接藥敏試驗。分析不同種屬細菌的藥敏結果顯示，腸桿菌目和非發(fā)酵菌屬直接藥敏試驗結果中亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和左旋氧氟沙星在3種菌量計數區(qū)間未出現誤差，其藥敏結果非?？煽俊Ｔ诰坑嫈?00～300個/微升出現8株非常重大誤差，原因可能為尿液菌量計數較少，并未達到儀器檢測的菌懸液濃度，也有可能為尿中的蛋白細胞等影響了儀器的檢測，導致結果出現誤差。而在菌量計數1 300～1 900個/微升中出現12株重大錯誤，可能由于尿液菌量計數量較多，尿液中雜質和細胞較多，過于渾濁，導致結果不可靠。革蘭陽性球菌菌量計數100～300個/微升出現11株非常重大誤差，原因為儀器法藥敏試驗中革蘭陽性菌較革蘭陰性菌需要的菌量計數量更大，當菌量計數量少時，革蘭陽性菌的誤差更大。革蘭陽性菌的菌量計數500～1 500個/微升與常規(guī)藥敏試驗結果的總符合率為99.7%，微小誤差為0.3%，未發(fā)生非常重大誤差和重大誤差，為革蘭陽性球菌最合適的尿液直接藥敏試驗的菌量計數。葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬直接藥敏試驗結果中克林霉素、高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素和四環(huán)素在3種菌量計數區(qū)間未出現誤差，結果可靠。本研究發(fā)現，直接藥敏試驗中的菌量計數會影響直接藥敏試驗結果，其改進措施為可以對中段尿進行差速離心，去除雜質和細胞，并稀釋至相應的濃度。

本研究結合尿流式細胞術和MALDI-TOF MS的鑒定結果對尿培養(yǎng)陽性標本中常見細菌直接進行藥敏試驗，其結果與常規(guī)藥敏試驗高度相符。本研究發(fā)現，革蘭陰性桿菌為泌尿系統(tǒng)感染的主要病原菌，當菌量計數500～1 100個/微升可以進行直接藥敏試驗，這對提高泌尿系統(tǒng)感染患者減少細菌耐藥的產生和減輕醫(yī)療費用有重要意義；而革蘭陽性菌雖然有最適計數，但革蘭陽性菌的菌量計數普遍偏小，所以為了減少誤差，必須進行培養(yǎng)后再做藥敏試驗，以免造成錯誤結果，誤導臨床治療。