鄭緒香，施紹瑞，汪順偉，余 燕，楊學(xué)強，廖 婧，解學(xué)龍，聶 濱

宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗科，四川宜賓 644000

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的以呼吸道感染為主的重大慢性傳染性疾病,分為肺內(nèi)結(jié)核和肺外結(jié)核，肺結(jié)核根據(jù)痰涂片是否能檢出結(jié)核分枝桿菌，分為活動性肺結(jié)核和非活動性肺結(jié)核。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告，在全球范圍內(nèi)，結(jié)核病是導(dǎo)致死亡的十大原因之一，也是傳染病致死的主要原因。2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約996萬，其中我國2019年新發(fā)結(jié)核病患者約為83.3萬，結(jié)核病發(fā)病率約為58/10萬(2018年約為61/10萬)[1]。結(jié)核病確診依賴病原學(xué)診斷，培養(yǎng)是病原學(xué)診斷的金標準，但該方法由于培養(yǎng)時間長，通常為5～8周，以至于很難及時診斷及治療[2]。因此，探索一種高靈敏度、高特異度，且可廣泛使用的診斷方法及標志物具有重要臨床意義。

長鏈非編碼 RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)、長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，占非編碼RNA的80%～90%，并廣泛參與機體內(nèi)幾乎所有的生理、病理過程，能夠在表觀遺傳、基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后，以及基因翻譯等多個層面上發(fā)揮調(diào)控作用[3]，并參與機體相關(guān)免疫調(diào)控[4]。有研究顯示，lncRNA可穩(wěn)定存在機體外周血中，其表達水平可用于疾病的早期診斷和預(yù)后評價，其中循環(huán)lncRNA與結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，可作為診斷結(jié)核病的潛在生物標志物[5-6]。但目前對lncRNA診斷的準確性尚無統(tǒng)一結(jié)論。因此，本文采用 Meta 分析方法系統(tǒng)評價lncRNA 對結(jié)核病的診斷效能。

1 資料與方法

1.1資料來源 檢索 PubMed、Web of Science、Embase、SinoMed、The Cochrane Library、中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，搜索關(guān)于lncRNA在肺結(jié)核研究中的相關(guān)文獻，檢索時間從建庫至2021年1月。中文檢索詞包括：肺結(jié)核、結(jié)核、結(jié)核病、結(jié)核分支桿菌、長鏈非編碼RNA、長鏈非編碼rna等。英文檢索詞包括：tuberculosis、Tuberculoses、Kochs Disease、Mycobacterium tuberculosis Infection、Long Noncoding RNA、lncRNA、Long ncRNA等。

1.2文獻納入及排除標準 納入標準：(1)公開發(fā)表的有關(guān)lncRNA方法診斷肺結(jié)核的準確性的橫斷面研究、隊列研究、隨機對照試驗等，不限定研究類型，發(fā)表時間為建庫至2021年1月，語言為英文和中文；(2)研究對象為臨床確診的肺結(jié)核患者；(3)標本來源為外周血或血清；(5)文獻明確闡明是研究循環(huán)lncRNA與結(jié)核病診斷的關(guān)系，并能完整提取四格表數(shù)據(jù)，包括真陽性、假陽性、真陰性、假陰性。排除標準：(1)重復(fù)發(fā)表文獻；(2)研究對象為細胞系基礎(chǔ)研究或動物實驗等；(3)標本來源為組織或其他體液的lncRNA；(4)綜述、病例報告、會議記錄、評論性文獻等；(5)無法獲取全文、缺乏原始數(shù)據(jù)或其他關(guān)鍵信息。

1.3文獻篩選和資料提取 由2名研究人員通過閱讀文獻摘要、文獻全文，根據(jù)納入和排除標準，確定納入研究文獻，然后進行數(shù)據(jù)提取。如有異議，通過討論或與第3位研究者討論共同確定。根據(jù)文獻研究，需要提取內(nèi)容包括：第一作者、發(fā)表年限、國家、標本類型、研究人群、病例組及對照組數(shù)量、lncRNA類型、靈敏度、特異度、受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)。

1.4文獻質(zhì)量評價 納入研究文獻后，使用Revman5.0診斷試驗質(zhì)量評價工具(QUADAS)-2[7]進行質(zhì)量評價，包括病例選擇、待評價診斷試驗、金標準試驗、研究流程和進展情況4個項目。偏移風(fēng)險評價中對每項研究中的問題判斷為“是、否或不清楚”；“是”表示偏倚風(fēng)險低，“否”表示偏倚風(fēng)險高，“不清楚”表示信息不足[8]。對文獻臨床適用性采用“低風(fēng)險、高風(fēng)險、不清楚”進行評價。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 通過Meta-disc軟件計算納入研究之間的Spearman相關(guān)系數(shù)(r)，判斷是否存在閾值效應(yīng)，P>0.05說明不存在閾值效應(yīng)。若無閾值效應(yīng)則通過對診斷數(shù)據(jù)的進行合并分析，判斷其診斷價值；若存在閾值效應(yīng)，僅通過繪制集成ROC(SROC)曲線并計算AUC來判斷診斷價值。使用Stata15.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用雙變量混合效應(yīng)模型[9](“midas”程序包)對靈敏度、特異度等進行合并統(tǒng)計分析。所有結(jié)果均以合并值和95%CI表示。通過Q檢驗結(jié)合I2判斷統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性大小，當(dāng)P<0.05或I2≤50%，說明納入研究間異質(zhì)性較小；當(dāng)P>0.05或I2>50%，說明納入研究間異質(zhì)性較顯著，需進一步分析異質(zhì)性來源[10]?？筛鶕?jù)標本類型、病例組樣本量大小、發(fā)表年限等進行Meta回歸和亞組分析,當(dāng)P<0.05證明是導(dǎo)致異質(zhì)性來源。使用Stata15.0制作Deeks漏斗圖評價文獻發(fā)表偏移，當(dāng)P>0.1表示無發(fā)表偏移，P<0.1提示存在發(fā)表偏移。

2 結(jié) 果

2.1文獻篩選流程及結(jié)果 初篩共納入329篇，最終納入12篇文獻[11-22]。其中包括4篇英文文獻，8篇中文文獻。

2.2納入研究的基本特征及質(zhì)量學(xué)評價 本研究共計納入12篇文獻累計1 145例患者和1 585例對照者。文獻發(fā)表年限為2017-2020年，其中關(guān)于活動性肺結(jié)核研究為7篇[11,13-15,20-22](共計有活動性肺結(jié)核16個比較組)；6篇為肺結(jié)核研究組[12,15-19](共計7個比較組)，患者為符合肺結(jié)核診斷標準患者，未標明進一步結(jié)核感染分類。納入文獻基本特征見表1。利用QUADAS-2對文獻進行質(zhì)量評價,由于研究中文獻均采用病例-對照研究，因此導(dǎo)致病例選擇均為“高風(fēng)險”，但仍屬于研究范疇。在活動性肺結(jié)核及肺結(jié)核未分類組中的診斷標準各異，未設(shè)定閾值，所以在待評價診斷試驗中多數(shù)為“不清楚”。在診斷標準，研究流程及進展情況中多數(shù)為“低風(fēng)險”。臨床適用性方面，兩組納入文獻在均為“低風(fēng)險”較多。

表1 納入研究基本特征

2.3Meta分析結(jié)果

2.3.1lncRNA診斷肺結(jié)核的準確性及靈敏度分析 lncRNA合并診斷活動性肺結(jié)核中，Spearman相關(guān)系數(shù)r=-0.087(P=0.749>0.05)，結(jié)果顯示活動性肺結(jié)核組無閾值效應(yīng)。采用雙變量混合效應(yīng)模型進行合并計算，結(jié)果顯示lncRNA合并診斷靈敏度為0.75(95%CI：0.67～0.82)，特異度為0.87(95%CI：0.80～0.91)，陽性似然比為5.61(95%CI：3.62～8.70)，陰性似然比為0.28(95%CI：0.21～0.39)，見表2。SROC 曲線 AUC 為0.88(95%CI：0.85～0.91)。僅診斷為肺結(jié)核組中，Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.918(P=0.004<0.05)，表明肺結(jié)核(未分類)存在閾值效應(yīng)，lncRNA診斷結(jié)果使用SROC曲線的AUC表示，AUC為0.80(95%CI：0.76～0.83)。將肺結(jié)核組(未分類)與活動性肺結(jié)核組結(jié)果使用Stata15.0進行靈敏度分析，剔除可能導(dǎo)致異質(zhì)性文獻后，重新進行Meta分析，結(jié)果顯示靈敏度和特異度均未見明顯變化，表明本研究結(jié)果較穩(wěn)定，結(jié)果可信度高。

表2 lncRNA合并診斷活動性肺結(jié)核靈敏度、特異度及似然比

2.3.2Meta回歸分析及亞組分析 活動性肺結(jié)核組I2檢驗結(jié)果顯示：靈敏度、特異度中I2檢驗結(jié)果分別為90.54%、94.87%(均>50%)，Q檢驗結(jié)果顯示P<0.05,因此活動性肺結(jié)核組異質(zhì)性較大，需進一步探討其非閾值效應(yīng)的異質(zhì)性來源。對標本類型、病例組樣本量大小、發(fā)表年限及標本類型進行Meta回歸分析，通過單變量Meta回歸分析結(jié)果顯示，納入異質(zhì)性可能來源于病例組納入樣本量大小、標本類型、RNA提取方法(P<0.05)；亞組分析結(jié)果顯示，小樣本量組的AUC高于大樣本量組，RNA提取方法亦可能是造成異質(zhì)性的原因，對文獻結(jié)果有一定的影響。見表3。

2.3.3發(fā)表偏移 使用Stata15.0制作Deeks漏斗圖，結(jié)果顯示活動性肺結(jié)核組存在發(fā)表偏移(P<0.1)，而未分類肺結(jié)核組不存在發(fā)表偏移(P>0.1)。見圖1。

表3 lncRNA診斷活動性肺結(jié)核亞組分析

續(xù)表3 lncRNA診斷活動性肺結(jié)核亞組分析

注：A為活動性肺結(jié)核組發(fā)表偏移，研究點1～16分別為陳敏等-1[11]、陳敏等-2[11]、羅杰-1[13]、羅杰-2[13]、羅杰-3[13]、羅杰-4[13]、楊曉帆-1[14]、楊曉帆-2[14]、楊曉帆-3[14]、趙繼利-4[15]、羅清[22]、宋佳佳等-1[21]、房雅倫-1[20]、房雅倫-2[20]、房雅倫-3[20]、房雅倫-4[20]的研究；B為肺結(jié)核組發(fā)表偏移，1～7分別為SUN等[16]、HU等[17]、CHEN等[18]、SUN等[19]、胡玉婷-4[12]、趙繼利-1[15]、趙繼利-3[15]的研究。

3 討 論

目前結(jié)核病篩查及診斷的方法有涂片染色、培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗(TST)、T細胞酶聯(lián)免疫斑點法(T-SPOT)、γ干擾素釋放試驗(IGRA)等。在活動性肺結(jié)核階段，痰涂片及痰培養(yǎng)能較好發(fā)現(xiàn)病原菌，但陽性率均較低[24]，且該階段患者已屬結(jié)核病的中晚期。這些常用方法在早期診斷中作用甚微。結(jié)核的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有利于降低患者感染率、病死率。因此尋找一種操作簡潔，靈敏度、特異度高的快速檢測方法及標志物顯得尤為重要。

lncRNA占所有非編碼RNA的80%，其特點之一是其細胞水平低于編碼蛋白質(zhì)的RNA，且具有較高的組織特異性[25]。歐葉青等[26]發(fā)現(xiàn)，lncRNA在潛伏性結(jié)核感染患者血漿中有1 485個lncRNA差異表達，其中上調(diào)819個，下調(diào)666個。而羅杰等[13]研究表明，lnc-FAM110B、lnc-GUCY2C-1、NEAT1、MALAT1 4個標志物聯(lián)合應(yīng)用區(qū)分健康對照組和活動性肺結(jié)核組的AUC達0.87。lncRNA在活動性肺結(jié)核、潛伏性肺結(jié)核及耐多藥肺結(jié)核中均有差異表達，并有較高診斷價值，然而目前尚無統(tǒng)一標準。

本文回顧目前發(fā)表的關(guān)于lncRNA在肺結(jié)核方面的臨床研究，探討lncRNA在活動性肺結(jié)核及肺結(jié)核未分類患者中的診斷價值。通過Spearman相關(guān)系數(shù)判斷在活動性肺結(jié)核組中不存在閾值效應(yīng)(P>0.05)，使用Stata15.0合并靈敏度等結(jié)果顯示，lncRNA在活動性肺結(jié)核中有較高的靈敏度和特異度，合并陽性似然比為5.61(95%CI：3.62～8.70)，說明活動性肺結(jié)核患者檢出陽性結(jié)果是非患者的5.61倍。合并陰性似然比為0.28(95%CI：0.21～0.39)，說明活動性肺結(jié)核患者陰性結(jié)果是非結(jié)核患者的0.28倍。SROC 曲線的AUC 為0.88(95%CI：0.85～0.91)，該結(jié)果顯示lncRNA對于活動性肺結(jié)核診斷具有較好的診斷價值。I2檢驗結(jié)果顯示，在活動性肺結(jié)核組納入的文獻中有較高的異質(zhì)性，進行回歸和亞組分析后，亞組分析結(jié)果顯示異質(zhì)性來源為標本量大小及l(fā)ncRNA提取方法，Meta分析結(jié)果顯示當(dāng)病例數(shù)<40時，診斷價值更高，因此在未來研究中，應(yīng)提高病例組人數(shù)，并且根據(jù)研究要求選擇合適的RNA提取方法，避免過低或過高的估計lncRNA在活動性肺結(jié)核中的診斷價值。Meta分析結(jié)果顯示，因診斷為肺結(jié)核組中Spearman系數(shù)結(jié)果顯示存在閾值效應(yīng)(P<0.05)，通過SROC 曲線計算 AUC 為0.80(95%CI：0.76～0.83),結(jié)果顯示lncRNA在肺結(jié)核未分類組中，具有較好的診斷價值。活動性肺結(jié)核組漏斗圖提示具有一定的偏移性，分析原因可能有：(1)文獻中大多為小樣本研究；(2)文獻異質(zhì)性太大可能對發(fā)表偏移有一定的影響。肺結(jié)核組中不存在文獻發(fā)表偏移。

本篇文獻存在一定局限性：文獻中主要檢索了中文和英文文獻，可能存在語言偏移；文獻的研究地區(qū)均為中國地區(qū)，可能代表性不高；在篩選出的文獻中，均為病例-對照研究，未能遵循盲法試驗，可能對文獻質(zhì)量評價以及對研究結(jié)果造成偏移。

綜上所述，lncRNA用于活動性肺結(jié)核及肺結(jié)核患者的診斷具有較好診斷價值，且lncRNA在活動性肺結(jié)核中有較高的靈敏度和特異度，但其臨床價值仍需大量的高質(zhì)量研究來驗證。