魏金輝，譚誼萌，吳麗君，楊 丹，薄彧坤，安 明

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040)

蒙藥三黃膏是由黃連、苦參、黃柏、黃芩4味藥制成的棕褐色膏狀制劑，在蒙藥中歷史悠久。黃連[1-2]、黃柏[3]均具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用；黃芩的功效為清熱燥濕、抗菌止血[4]；苦參則具有清熱解毒、抗炎鎮(zhèn)痛的藥理活性[5]。其中黃連、黃柏所含的鹽酸小檗堿對(duì)炎癥具有抑制作用，可以緩解疼痛，與藥效密切相關(guān)。全方清熱解毒、消腫止痛，具有抗菌和增強(qiáng)免疫作用[6-7]，在臨床上對(duì)皮炎、濕疹、癤癰治療效果顯著。該制劑制備簡(jiǎn)單、便于臨床調(diào)配和使用。但由于提取工藝的不同，其質(zhì)量差別較大，療效也受到了影響[8-9]。為提高三黃膏的內(nèi)在質(zhì)量，本研究以與藥效密切相關(guān)的鹽酸小檗堿為指標(biāo)成分，擬建立三黃膏中黃連、黃柏的薄層色譜(TLC)鑒別標(biāo)準(zhǔn)，并使用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，制定含量測(cè)定限度，從而加強(qiáng)其質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1儀器 GenPure UV-TOC/UF超純水機(jī)、Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；BSA224S-CW萬(wàn)分之一電子天平、SQP型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AS10200(40/60HZ)超聲波清洗儀(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2試劑藥品 鹽酸小檗堿對(duì)照品(AF20060151)、鹽酸黃柏堿對(duì)照品(AF21020861)、黃連對(duì)照藥材(AF20060108)、黃柏對(duì)照藥材(AF21020512)購(gòu)于成都埃爾法生物科技有限公司；黃連藥材(181226)、黃柏藥材(190501)、三黃膏(2012111、2012112、2012114)由包頭市蒙醫(yī)中醫(yī)院提供；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1TLC鑒別 黃連TLC鑒別：取黃連藥材0.25 g、三黃膏1.0 g、黃連對(duì)照藥材0.25 g、陰性1(不含黃連的處方其余藥材)0.75 g、陰性2(不含黃柏的處方其余藥材)0.75 g、陰性3(不含黃連、黃柏的處方其余藥材)0.50 g，加入甲醇25 mL后，超聲處理30 min，靜置，離心，取上清液即得。取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，配制成0.5 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC(2020版《中國(guó)藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，配制環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶1∶1)混合溶液作為展開(kāi)劑，置于提前用氨蒸氣飽和20 min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出后晾干，放置于紫外光燈365 nm下檢視。

黃柏TLC鑒別：取黃柏藥材0.25 g、三黃膏0.8 g、黃柏對(duì)照藥材0.1 g、陰性(不含黃柏的處方其余藥材)0.6 g。加入1 %醋酸甲醇溶液40 mL，在60 ℃溫度下超聲20 min，放置至常溫，濾過(guò)，濃縮濾液至2 mL即得。取鹽酸黃柏堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每0.5 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC(2020版《中國(guó)藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，分別吸取5 μL上述溶液,點(diǎn)于同一個(gè)硅膠 G 薄層板上，先將層析缸用氨蒸氣預(yù)先飽和20min，再將三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)配置好，搖勻倒入分液漏斗中，靜置進(jìn)行分液，取下層溶液作為展開(kāi)劑，倒入飽和好的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出并晾干。

1.3.2含量測(cè)定

1.3.2.1色譜條件 色譜柱SinoChrom ODS-BP C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液(29∶10∶61)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品9.12 mg至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密吸取1 mL置另一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，制成91.2 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2.3供試品溶液的制備 取本品約0.13 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲20 min，放冷，補(bǔ)重，5 000 r/min離心10min，取續(xù)濾液即得。

2 結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1黃連TLC鑒別 在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，供試品顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液1、2中均有鹽酸小檗堿的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液3無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.1.2黃柏TLC鑒別 在與對(duì)照品、對(duì)照藥材薄層色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色、大小的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 三黃膏中黃柏的TLC圖譜

2.2含量測(cè)定

2.2.1專屬性 精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下配制的溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果表明，陰性對(duì)照色譜圖中，在與鹽酸小檗堿對(duì)照品以及供試品色譜圖相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，專屬性好。見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 陰性對(duì)照溶液色譜圖

圖4 鹽酸小檗堿對(duì)照品色譜圖

圖5 供試品溶液色譜圖

2.2.2取樣量考察 照“1.3.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，以甲醇作為提取溶劑，超聲20 min即得，進(jìn)行鹽酸小檗堿含量測(cè)定。三份樣品中0.1357 g測(cè)定的鹽酸小檗堿含量高于0.2036 g，故取樣量選擇0.1357 g。見(jiàn)表1。

表1 鹽酸小檗堿含量測(cè)定取樣量考察

2.2.3提取時(shí)間考察 以甲醇為提取溶劑，考察不同超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響。三份樣品中超聲時(shí)間為50 min的溶液中鹽酸小檗堿的含量最高，故選擇超聲50 min為提取時(shí)間。見(jiàn)表2。

表2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定提取時(shí)間考察

2.2.4提取溫度考察 以甲醇為提取溶劑，考察不同提取溫度對(duì)提取效率的影響。隨著提取時(shí)間的增加，鹽酸小檗堿的含量有所降低，故選擇40 ℃為提取溫度。見(jiàn)表3。

表3 鹽酸小檗堿含量測(cè)定提取溫度考察

2.2.5線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.046、0.095、0.140、0.185、0.230和0.276 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，采用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。取上述溶液10 μL進(jìn)樣，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果在45.72 μg/mL～274.34 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，y=0.1643x+6.7144，r2=0.9992,n=6。見(jiàn)表4。

表4 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表

2.2.6精密度試驗(yàn) 取“1.3.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按照“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，其峰面積的平均值為60.6893，RSD為0.87 %，說(shuō)明精密度良好。見(jiàn)表5。

表5 鹽酸小檗堿含量測(cè)定的精密度結(jié)果

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，精密吸取10 μL，按色譜條件，分別在0、2、4、6、12、24 h下進(jìn)樣10 μL，根據(jù)色譜圖中鹽酸小檗堿的色譜峰面積的數(shù)值對(duì)RSD值進(jìn)行計(jì)算，RSD為0.49 %(按外標(biāo)峰面積計(jì)算)，表明此方法下鹽酸小檗堿的穩(wěn)定性良好，該方法準(zhǔn)確可行。見(jiàn)表6。

表6 不同時(shí)間測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿的峰面積

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(2012111)供試品6份，每份約0.13 g，精密稱定，照“1.3.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2020版四部通則(0512))，在345 nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，按外標(biāo)峰面積計(jì)算。見(jiàn)表7。

表7 鹽酸小檗堿含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9加樣回收率試驗(yàn) 取批號(hào)2012111樣品9份，每份約0.06 g，精密稱定，照“1.3.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2020版四部通則(0512))，在345 nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，按外標(biāo)峰面積計(jì)算。見(jiàn)表8。

表8 鹽酸小檗堿含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10耐用性試驗(yàn) 換不同廠家、不同型號(hào)色譜柱，取供試品約 0.13 g，精密稱定，照“1.3.2”項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)樣，按外標(biāo)峰面積計(jì)算，測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果為：RSD<2.0 %。見(jiàn)表9。

表9 不同色譜柱的耐用性試驗(yàn)

2.2.11樣品含量測(cè)定 取三個(gè)批號(hào)的樣品(生產(chǎn)批號(hào)為2012111、2012112、2012114)，每批2份，另取模擬樣品2份，照“1.3.2”項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)樣，分析測(cè)定，含量均在3.4 mg/g以上；采用同法，對(duì)模擬樣品用黃連藥材進(jìn)行含量測(cè)定。見(jiàn)表10。

表10 樣品中鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1展開(kāi)劑的選擇 依照《中國(guó)藥典》2020版一部“黃連”項(xiàng)下TLC鑒別方法，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑，分離程度小，展開(kāi)斑點(diǎn)不清晰。采用加大極性的方法將展開(kāi)劑中水的比例擴(kuò)大1和1.5倍。結(jié)果表明，當(dāng)水的比例擴(kuò)大1倍時(shí)，展開(kāi)劑展開(kāi)效果好，斑點(diǎn)相互分離且清晰無(wú)干擾。故以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶1∶1)作為展開(kāi)劑。

3.2流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液的流動(dòng)相體系，當(dāng)甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液比例為25∶10∶65時(shí)峰形較差、基線波動(dòng)較大。加大流動(dòng)相中甲醇的比例，當(dāng)甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液比例為29∶10∶61時(shí)色譜峰分離度好，峰形良好。故最終確定色譜條件為甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液(29∶10∶61)。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)全波長(zhǎng)掃描，供試品在229、265和346 nm波長(zhǎng)處有吸收，結(jié)果顯示346 nm波長(zhǎng)處基線較為平穩(wěn)。查閱《中國(guó)藥典》2020版一部“黃連”項(xiàng)下鹽酸小檗堿含量測(cè)定的波長(zhǎng)，最終以345 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究以鹽酸小檗堿為指標(biāo)成分建立的蒙藥三黃膏中黃連[10-11]、黃柏[12-13]的TLC定性鑒別方法，在與對(duì)照藥材或?qū)φ掌飞V的相應(yīng)位置上，樣品顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾；同時(shí)測(cè)定了鹽酸小檗堿的含量[6,14-15]，并考察了提取時(shí)間、提取溫度對(duì)提取效率的影響[16]，以節(jié)約成本、全面反映制劑內(nèi)在質(zhì)量為目的[17]，選擇了50 min、40 ℃作為樣品的提取條件；鹽酸小檗堿在45 ～274 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；平均回收率為94.16 %。建立的鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，分離度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，本研究提升了蒙藥三黃膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了依據(jù)。