張玉萍 宋蕾 李春艷 程曉磊 孫國(guó)鋒

肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)通過表觀遺傳發(fā)揮基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，其異常表達(dá)與癌癥發(fā)展中多種病理過程密切相關(guān)[2]。長(zhǎng)間隔非編碼RNA 00221(long intergenic non-coding RNA 00221，LINC00221)是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其表達(dá)上調(diào)與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌進(jìn)展相關(guān)，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥性，影響治療和預(yù)后[3]。有學(xué)者通過整合分析發(fā)現(xiàn),LINC00221與HCC病人生存期密切相關(guān)，是HCC的預(yù)后生物標(biāo)志物[4]。本研究探討干擾LINC00221表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲生物學(xué)行為的影響。

材料與方法

一、試驗(yàn)試劑

肝上皮細(xì)胞LO2和HCC細(xì)胞株HCCLM6、Hep3B、MHCC-97H、Huh-7、MHCC-LM3均由本院實(shí)驗(yàn)中心凍存。干擾片段siRNA-LINC00221和陰性對(duì)照siRNA-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine? 3000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；RPIM1640培養(yǎng)基、PBS和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ERK信號(hào)激動(dòng)劑C16-PAF購(gòu)自美國(guó)MCE公司。LINC00221干擾序列1：F：AGAAUCAUAUGCAAACAGCCU；R：GCUGUUUGCAUAUGAUUCUUC。LINC00221干擾序列2：F：AGAAGAAUCAUAUGCAAACAG；R：GUUUGCAUAUGAUUCUUCUAA。

二、方法

1.細(xì)胞處理：向細(xì)胞中加入含有10%胎牛血清及1%雙抗的RPIM1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。使用Lipofectamine? 3000分別將siRNA-LINC00221和siRNA-NC轉(zhuǎn)染到MHCC-LM3細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、LINC00221干擾組(轉(zhuǎn)染siRNA-LINC00221)、LINC00221干擾+ERK激動(dòng)劑組(轉(zhuǎn)染siRNA-LINC00221+C16-PAF)。

2.CCK-8實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染處理的第0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，向細(xì)胞中加入5 μl的CCK-8溶液孵育4小時(shí)，通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下OD值，計(jì)算MHCC-LM3細(xì)胞活力。

3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞長(zhǎng)滿后，使用10 μl槍頭向單層細(xì)胞劃線，寬度控制在500 μm左右，顯微鏡拍照并記為0小時(shí)結(jié)果。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后用顯微鏡拍照，計(jì)算MHCC-LM3細(xì)胞24 h內(nèi)劃痕愈合率。

4.Transwell實(shí)驗(yàn)：Transwell小室底部基底膜加入100 μl基質(zhì)膠稀釋液，風(fēng)干后加入100 μl的培養(yǎng)基。小室外加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液900 μl，重懸MHCC-LM3細(xì)胞至濃度1×105/ml，接種細(xì)胞到小室內(nèi)并孵育24小時(shí)。取出小室，用4%濃度多聚甲醛固定30分鐘以上；結(jié)晶紫工作染液染色30分鐘以上，光學(xué)顯微鏡照相，統(tǒng)計(jì)分析MHCC-LM3細(xì)胞穿膜數(shù)量。

5.qRT-PCR實(shí)驗(yàn)：去除培養(yǎng)基后，加入800 μl的Trizol試劑充分裂解細(xì)胞，加入200 μl氯仿4 ℃離心提取細(xì)胞總RNA。取1 μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板定量PCR檢測(cè)。GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00221的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

6.Western blot檢測(cè)：轉(zhuǎn)染處理48小時(shí)后向細(xì)胞中加入200 μl蛋白裂解液冰上裂解30分鐘，12 000 g冷凍離心提取細(xì)胞總蛋白。取蛋白樣本加入4 SDS上樣緩沖液，混勻后煮沸變性10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜后置于5%的BSA封閉1～2小時(shí)，4 ℃過夜孵育一抗，室溫1小時(shí)孵育二抗，ECL避光顯影、拍照。以GAPDH為內(nèi)參分析目標(biāo)分子蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-ERK1/2表達(dá)為p-ERK1/2與ERK1/2光密度比值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

1.LINC00221在HCC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)：LINC00221在HCC細(xì)胞HCCLM6(1.383±0.074)、Hep3B(1.432±0.100)、MHCC-97H(1.632±0.055)、Huh-7(1.640±0.106)、MHCC-LM3(1.982±0.096)中表達(dá)水平高于正常肝上皮細(xì)胞LO2(1.000±0.058),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.HCC細(xì)胞中LINC00221的表達(dá)：空白對(duì)照組(1.000±0.057)和陰性對(duì)照組(0.964±0.048)中LINC00221相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染LINC00221干擾序列1組(0.398±0.010，P<0.01)以及LINC00221干擾序列2組(0.285±0.025，P<0.01)LINC00221相對(duì)表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組。說明siRNA-LINC00221轉(zhuǎn)染成功，后續(xù)體外功能驗(yàn)證試驗(yàn)將轉(zhuǎn)染LINC00221干擾序列2處理MHCC-LM3細(xì)胞。

3.LINC00221介導(dǎo)ERK信號(hào)通路對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響：空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組MHCC-LM3細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LINC00221干擾組MHCC-LM3細(xì)胞活力低于陰性對(duì)照組，(P<0.01)；LINC00221干擾+ERK信號(hào)激動(dòng)劑組MHCC-LM3細(xì)胞活力高于LINC00221干擾組(P<0.01)，見圖1。

圖1 干擾LINC00221對(duì)MHCC-LM3細(xì)胞增殖能力的影響

4.LINC00221介導(dǎo)ERK信號(hào)通路對(duì)HCC細(xì)胞遷移的影響：空白對(duì)照組(62.070±1.711)和陰性對(duì)照組(65.610±1.884)細(xì)胞劃痕愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LINC00221干擾組MHCC-LM3細(xì)胞劃痕愈合率低于陰性對(duì)照組(38.790±2.899)；LINC00221干擾+ERK信號(hào)激動(dòng)劑組MHCC-LM3細(xì)胞劃痕愈合率高于LINC00221干擾組(66.387±2.799，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01)。見圖2。

圖2 干擾LINC00221對(duì)MHCC-LM3細(xì)胞遷移能力的影響(放大倍數(shù)100倍)

5.LINC00221介導(dǎo)ERK信號(hào)通路對(duì)HCC細(xì)胞侵襲的影響：空白對(duì)照組(171.667±3.283)和陰性對(duì)照組(183.333±8.413)穿膜細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LINC00221干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)量低于陰性對(duì)照組(97.000±4.726)；LINC00221干擾+ERK信號(hào)激動(dòng)劑組穿膜細(xì)胞數(shù)量高于LINC00221干擾組(162.667±4.485)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 干擾LINC00221對(duì)MHCC-LM3細(xì)胞侵襲能力的影響(放大倍數(shù)100倍)

6.LINC00221對(duì)HCC細(xì)胞中ERK信號(hào)通路的影響：空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組MHCC-LM3細(xì)胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LINC00221干擾組MHCC-LM3細(xì)胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組；LINC00221干擾+ERK信號(hào)激動(dòng)劑組MHCC-LM3細(xì)胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)水平高于LINC00221干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05(P<0.01)。見圖4。

討論

有研究顯示，lncRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種惡性行為[2]。如在HCC中發(fā)現(xiàn)DLX6-AS1通過靶向調(diào)節(jié)miR-513c/Cul4A/ANXA10軸促進(jìn)HCC生長(zhǎng)[5]。HCC中低表達(dá)的NBR2提示HCC病人預(yù)后更差、惡性程度更高，可以通過ERK和JNK通路抑制Beclin 1依賴的細(xì)胞保護(hù)性自噬發(fā)生，抑制HCC細(xì)胞增殖[6]。lncRNA-POIR通過分泌miR-182-5p促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制索拉非尼敏感性[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00221在乳腺癌組織中表達(dá)是正常乳腺組織的2.1倍，與6種miRNAs存在靶向調(diào)控關(guān)系，介導(dǎo)下游靶mRNA差異表達(dá)[8]；另外LINC00221還與胃癌預(yù)后不良有關(guān)[9]。有研究團(tuán)隊(duì)分析TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)HCC組織中LINC00221過度表達(dá)，其高表達(dá)病人術(shù)后生存期更短，并可能與Hsa-miR-182和hsa-miR-96競(jìng)爭(zhēng)作用[4,10]。然而，尚不清楚LINC00221表達(dá)失調(diào)是HCC誘發(fā)因素或僅是HCC預(yù)后標(biāo)志。本研究首先檢測(cè)正常肝上皮細(xì)胞和HCC細(xì)胞株中LINC00221的表達(dá)，結(jié)果顯示，LINC00221在HCC細(xì)胞表達(dá)異常上調(diào)。我們?cè)贛HCC-LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-LINC00221干擾序列，檢測(cè)差異表達(dá)LINC00221對(duì)MHCC-LM3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程的影響，在細(xì)胞水平進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示，干擾LINC00221表達(dá)MHCC-LM3細(xì)胞增殖活力降低，同時(shí)細(xì)胞的遷移侵襲能力均明顯減弱。以上結(jié)果提示，在HCC細(xì)胞中高表達(dá)的LINC00221可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，加速HCC惡性發(fā)展，但其作用機(jī)制尚不清楚。

aP<0.01；1代表空白對(duì)照組、2代表陰性對(duì)照組、3代表LINC00221干擾組、4代表LINC00221干擾+ERK信號(hào)激動(dòng)劑組圖4 LINC00221對(duì)MHCC-LM3細(xì)胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)的影響

ERK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白可傳遞有絲分裂原信號(hào)，定位于細(xì)胞質(zhì)。激活的ERK被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性并產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。ERK家族包括5個(gè)亞家族ERK1～5，其中ERK1和ERK2參與調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞生理過程[11]。激活的ERK信號(hào)通路促進(jìn)了多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和耐藥調(diào)控[12]。在HCC中，多種lncRNAs通過ERK信號(hào)影響癌癥進(jìn)程。HOXD-AS1激活MEK/ERK信號(hào)加速HCC細(xì)胞周期進(jìn)程[13]。ZFAS1通過miR-624/MDK/ERK/JNK/P38信號(hào)通路影響HCC發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾LINC00221表達(dá)后MHCC-LM3細(xì)胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)減少，因此推測(cè)，LINC00221影響HCC細(xì)胞表型可能與ERK信號(hào)通路有關(guān)。我們干擾LINC00221同時(shí)加入ERK信號(hào)激動(dòng)劑，發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)激動(dòng)劑處理明顯逆轉(zhuǎn)了LINC00221干擾對(duì)MHCC-LM3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，說明LINC00221通過激活ERK信號(hào)，促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲生物學(xué)過程，發(fā)揮癌基因作用。ERK信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，LINC00221如何通過間接或直接作用機(jī)制誘導(dǎo)ERK活化尚不清楚。我們將進(jìn)一步研究LINC00221是否能夠通過ceRNA等機(jī)制調(diào)控ERK信號(hào)軸，影響HCC惡性病變進(jìn)展。