黃彩玲，甘思遠(yuǎn)，劉 旺，蔡凱爾，宋 浩，舒 旭，何志巍,5，孫艷芹

2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，癌癥死亡人數(shù)約996萬，其中肺癌死亡人數(shù)約180萬，位居首位[1]。小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是惡性度極高的肺癌類型，患者確診時(shí)常伴全身廣泛轉(zhuǎn)移[2]，雖然在SCLC初期對(duì)患者進(jìn)行細(xì)胞毒治療能產(chǎn)生效果，但絕大多數(shù)患者會(huì)迅速?gòu)?fù)發(fā)并對(duì)進(jìn)一步的化療產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致患者生存期顯著縮短、預(yù)后極差[3]。因此，探究SCLC的發(fā)生機(jī)制及化療耐藥問題極具臨床診療價(jià)值。Zeste同源物2增強(qiáng)子(enhancer of zeste homologue 2, EZH2)是多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)的催化單元，其通過組蛋白H3賴氨酸27三甲基化沉默許多參與腫瘤抑制機(jī)制的基因[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP與SCLC患者不良預(yù)后相關(guān)，因此本文重點(diǎn)探討EZH2對(duì)SCLC細(xì)胞增殖、凋亡和化療耐藥性的影響，并初步闡述EZH2作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP的下游效應(yīng)分子的調(diào)控通路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和材料胎牛血清(Gibco公司)；小分子抑制劑GSK-126(MCE公司)；EZH2單克隆抗體(Abcam公司)；H3K27me3單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；GAPDH抗體(Santa Cruz公司)；山羊抗兔多克隆IgG(Santa Cruz公司)；CCK-8試劑盒(同仁公司)。人SCLC細(xì)胞株H146、H446、H446DDP、H69、H69AR及人支氣管上皮樣細(xì)胞16HBE(ATCC公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)16HBE、H146、H446、H446DDP(基于H446細(xì)胞構(gòu)建的順鉑耐藥株)、H69、H69AR(多藥耐藥細(xì)胞株)等細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成EZH2的特異性引物由Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計(jì)并合成。以GAPDH作為內(nèi)參。EZH2引物序列：上游5′-ACATCC TTTTCATGCAACACC-3′，下游5′-GCTCCCTCCAA ATGCTGGTA-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGG CTGCTTTTAACTCTG-3′，下游5′-TGGCAGGTTTTT CTAGACGG-3′。

1.4 qRT-PCR(1)RNA提取(TRIzol法)，保證1.80≤D260/D280≤2.00，總RNA濃度≥500 ng/μL。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)階段(37 ℃ 15 min)和逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)階段(85 ℃ 5 s)。(3)PCR反應(yīng)：根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)液。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，合計(jì)40次循環(huán)，72 ℃ 10 min延伸。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.5 Western blot法細(xì)胞總蛋白提取后利用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，并于室溫下封閉，分別用EZH2和H3K27me3的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后用羊抗兔IgG于室溫條件下孵育1 h，再次TBST洗膜后用DAB進(jìn)行顯色。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)(1)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖：于96孔板中接種細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；加入CCK-8溶液；適時(shí)檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處細(xì)胞的OD值；連續(xù)幾日在固定時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。(2)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物敏感性：接種細(xì)胞于96孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h；分別加入阿霉素、順鉑及足葉乙甙三種藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；再加CCK-8溶液，4 h后檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處細(xì)胞的OD值。以上操作步驟重復(fù)3次，求各組細(xì)胞存活率的平均值，并計(jì)算各組細(xì)胞對(duì)藥物的IC50值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況，采用Annexin V/7ADD凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；細(xì)胞周期檢測(cè)需經(jīng)70%乙醇于4 ℃固定過夜，經(jīng)PI染色后再進(jìn)行測(cè)定。

1.8 免疫組化本組前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HOTTIP研究時(shí)已構(gòu)建了裸鼠成瘤模型[4]，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)HOTTIP下調(diào)細(xì)胞所成瘤體組織中EZH2和H3K27me3的表達(dá)。

1.9 生物信息學(xué)分析利用GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫分析不同組織學(xué)類型的肺癌患者組織中EZH2的表達(dá)水平與其生存期的關(guān)系、EZH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平、肺癌組織中TP53突變與EZH2表達(dá)水平的關(guān)系。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較符合正態(tài)分布時(shí)采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2在SCLC組織及細(xì)胞株中的表達(dá)及預(yù)后指導(dǎo)價(jià)值分析通過生物信息學(xué)技術(shù)(Kaplan-Meier Plotter在線工具)分析基因表達(dá)與生存期的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，EZH2在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者生存期無明顯相關(guān)性(P>0.05，圖1A)；而EZH2在肺腺癌組織中的表達(dá)與患者生存期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，具有較好的預(yù)后指導(dǎo)價(jià)值(圖1B)。本組收集10對(duì)SCLC組織和癌旁組織，對(duì)上述生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證分析，結(jié)果顯示EZH2在SCLC組織中的表達(dá)顯著升高(圖1C)，與上述結(jié)果一致。

EZH2在細(xì)胞株中的表達(dá)：與人支氣管上皮細(xì)胞16HBE相比，EZH2在H146、H446、H446DDP、H69、H69AR等5株SCLC細(xì)胞株中的表達(dá)較高，而相對(duì)于其親本細(xì)胞株H69和H446細(xì)胞，EZH2在化療耐藥細(xì)胞株H446DDP和H69AR中的表達(dá)更高(圖1D)。體外實(shí)驗(yàn)采用有效的shRNA干擾質(zhì)粒(2196或2278)下調(diào)相關(guān)細(xì)胞中EZH2的表達(dá)(圖1E)。

2.2 EZH2對(duì)SCLC細(xì)胞增殖和耐藥的影響采用小分子抑制劑GSK-126和EZH2 shRNA干擾序列抑制或者沉默EZH2的表達(dá)后，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的藥物敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與兩陰性對(duì)照組(H69AR和H69AR/NC)相比，H69AR/sh-EZH2組和H69AR/GSK-126組細(xì)胞對(duì)三種化療藥物(阿霉素、順鉑和足葉乙甙)的化療敏感性均明顯增強(qiáng)(P<0.001)，即耐藥性下降(表1，圖2A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，自細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48 h開始，與陰性對(duì)照組相比，EZH2下調(diào)可減弱H146和H446DDP細(xì)胞的增殖能力(P<0.01，圖2B)。

表1 EZH2表達(dá)下調(diào)對(duì)H69AR細(xì)胞的藥物敏感性影響

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞化療反應(yīng)性及增殖能力：A.細(xì)胞藥物敏感性；B.細(xì)胞增殖能力

2.3 EZH2下調(diào)對(duì)SCLC細(xì)胞周期及凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)分析H446DDP細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，EZH2下調(diào)后兩株細(xì)胞G2期細(xì)胞比例減少(圖3)。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，EZH2下調(diào)后兩株細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡率的增加：細(xì)胞早凋率(P<0.01)及晚凋率(P<0.05)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析EZH2下調(diào)對(duì)細(xì)胞周期的影響：**P<0.01

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析EZH2下調(diào)對(duì)H446DDP細(xì)胞凋亡的影響:*P<0.05; **P<0.01

2.4 EZH2下調(diào)對(duì)細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，524例肺鱗狀細(xì)胞癌和571例肺腺癌中分別有369例和233例發(fā)生TP53突變，且EZH2表達(dá)均較其他兩組高(圖5A、B)。同時(shí)對(duì)EZH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，EZH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在肺鱗狀細(xì)胞癌及肺腺癌組織中均較低(圖5C、D)。為明確EZH2的表達(dá)與細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系，使用梯度濃度的EZH2小分子抑制劑GSK-126處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，隨著GSK-126劑量的不斷升高，細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)梯度下降，而細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶H3K27me3的表達(dá)量也同樣呈梯度下降(圖5E)。

為進(jìn)一步觀察HOTTIP和EZH2之間的調(diào)控關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HOTTIP下調(diào)的細(xì)胞中EZH2的表達(dá)下降(圖5F)。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HOTTIP下調(diào)引起組織中EZH2和H3K27me3蛋白的表達(dá)稍有下降(圖6)，提示兩種蛋白均在癌基因HOTTIP的調(diào)控通路上，推測(cè)EZH2可能是HOTTIP的下游效應(yīng)分子，通過改變甲基轉(zhuǎn)移酶H3K27me3的活性參與SCLC的惡性表型。

圖5 EZH2下調(diào)對(duì)細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響：A.基于TP53突變狀態(tài)分析EZH2在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)；B.基于TP53突變狀態(tài)分析EZH2在肺腺癌中的表達(dá)；C.肺鱗狀細(xì)胞癌中EZH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平；D.肺腺癌中EZH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平；E.GSK-126梯度處理SCLC細(xì)胞后EZH2和H3K27me3蛋白的表達(dá)；F.HOTTIP下調(diào)后EZH2 mRNA的表達(dá)，*P<0.05

圖6 HOTTIP下調(diào)的細(xì)胞所成裸鼠瘤體組織中EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)，SP法

3 討論

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，肺癌是最常見的癌癥死因，其病死率位居惡性腫瘤之首[1]。盡管SCLC的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，但基于表觀遺傳學(xué)機(jī)制的研究已取得較大進(jìn)展[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，EZH2是PRC2上具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的催化核心結(jié)構(gòu)，其通過介導(dǎo)組蛋白3上第27號(hào)賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27me3)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制，從而在細(xì)胞增殖、周期調(diào)節(jié)及胚胎發(fā)育中起重要作用[5-6]。EZH2在實(shí)體腫瘤中表達(dá)通常會(huì)升高，如在胃癌、乳腺癌和肺癌中發(fā)揮致癌作用并與預(yù)后不良密切相關(guān)，并可抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和阻斷病毒感染[3,6-8]。

越來越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾等不同水平調(diào)控EZH2的表達(dá)及其甲基轉(zhuǎn)移酶活性[9-11]，另有一些長(zhǎng)鏈非編碼RNA為EZH2的下游效應(yīng)器，并有超過20%的長(zhǎng)鏈非編碼RNA受到PRC2復(fù)合物的調(diào)控[12-14]。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因HOTTIP啟動(dòng)子區(qū)存在明顯的組蛋白甲基化修飾，HOTTIP通過調(diào)控H3K27me3促進(jìn)了SCLC惡性轉(zhuǎn)化過程[4]。但HOTTIP是否介導(dǎo)EZH2的表達(dá)，參與甲基轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)和SCLC化療耐藥尚不清楚。

為明確EZH2與SCLC的關(guān)系，采用生物信息學(xué)技術(shù)分析EZH2在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在肺腺癌中的表達(dá)較高且與患者預(yù)后不良相關(guān)。眾所周知，TP53是一種明星抑癌基因，該基因突變與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和放療均有關(guān)，而且TP53突變者的無進(jìn)展生存期縮短[15-18]。進(jìn)一步分析TP53突變與EZH2的表達(dá)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中TP53突變者EZH2表達(dá)水平普遍較高，結(jié)果表明EZH2可能與肺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

研究結(jié)果提示，EZH2在SCLC多藥耐藥細(xì)胞株和SCLC組織中表達(dá)相對(duì)較高，表明EZH2可能與SCLC發(fā)生及耐藥密切相關(guān)；CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EZH2下調(diào)可能會(huì)抑制SCLC細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EZH2下調(diào)后G2期細(xì)胞數(shù)量明顯減少和細(xì)胞凋亡率增加，提示EZH2下調(diào)抑制SCLC細(xì)胞增殖很可能是通過干擾細(xì)胞G2期RNA及蛋白質(zhì)的合成實(shí)現(xiàn)，而細(xì)胞凋亡可能是EZH2參與SCLC耐藥性產(chǎn)生的重要途徑。以上結(jié)果共同證實(shí)，EZH2可能參與SCLC的發(fā)生及其化療抗藥性的產(chǎn)生，而EZH2調(diào)控SCLC發(fā)生及耐藥的分子機(jī)制尚不清楚。

結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，HOTTIP表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中EZH2表達(dá)下降，且HOTTIP下調(diào)的裸鼠皮下瘤體組織中EZH2和H3K27me3蛋白的表達(dá)下降，提示EZH2可能是HOTTIP發(fā)揮作用的下游分子，其可能通過改變甲基轉(zhuǎn)移酶活性參與SCLC細(xì)胞的增殖及化療耐藥過程。此外，EZH2的小分子抑制劑GSK-126在多個(gè)濃度均可抑制EZH2的表達(dá)，采用GSK-126或EZH2干擾質(zhì)粒對(duì)基因表達(dá)的干擾作用趨勢(shì)一致。

上述結(jié)果提示，EZH2可能與SCLC的惡性表型密切相關(guān)，其可能作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP的效應(yīng)分子，通過調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶H3K27me3的活性參與SCLC發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥過程。后續(xù)將開展延續(xù)性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析EZH2在臨床SCLC組織中的作用及其與小鼠腫瘤發(fā)生及化療反應(yīng)性的關(guān)系，以驗(yàn)證其致癌作用。