程 佳， 姬正偉， 仵西鳳， 路宏朝， 張 濤

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 漢中 723000)

維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)作為類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的成員之一[1]，既能參與維持體內(nèi)礦物質(zhì)動態(tài)平衡、骨代謝，還能在多種組織細胞的生長分化和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[2]。VDR在人體各組織細胞中廣泛存在，通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄而調(diào)控相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成進而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。研究表明，vitamin D的抗腫瘤效果與腫瘤組織內(nèi)VDR表達水平有關(guān)，而在不同的癌組織中VDR的表達量有所差異，如大腸癌中VDR表達量僅占32%，但在胃癌、乳腺癌中VDR表達量高達80%～90%[3]，這說明VDR的表達存在較大的組織差異性。VDR可以通過多種途徑作用于癌細胞的增殖[4-6]。同時，VDR的功能受到多種共調(diào)節(jié)子的影響，而調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用的方式并不是一成不變的。對腫瘤基質(zhì)細胞的研究顯示，VDR與共抑制子或共激活子的結(jié)合也具有明顯的組織特異性或分化階段特異性[7-8]。由此可知，在不同癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，VDR作為重要的調(diào)控因子直接或間接地參與調(diào)控癌細胞的增殖過程。由于肝癌組織與正常肝臟組織相比VDR表達增加，說明VDR的表達與肝癌腫瘤細胞的增殖具有相關(guān)性，但VDR作用于肝癌細胞增殖過程仍有待研究。

VDR作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達是通過識別靶基因序列中的維生素D應(yīng)答元件(vitamin D response element,VDRE)實現(xiàn)的，并且VDRE的數(shù)量與VDR引發(fā)轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)強弱有關(guān)[9]。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein,RBP4)基因上游存在VDRE[10]。而RBP4是體內(nèi)負責(zé)視黃醇轉(zhuǎn)運的蛋白，主要在肝臟中表達。自Yang等[11]發(fā)現(xiàn)RBP4與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)密切相關(guān)之后，國內(nèi)外大量研究證實RBP4在慢性炎癥[12]、脂代謝紊亂[13]、血管病變[14-15]等病理過程中發(fā)揮著重要作用，但RBP4促使相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制仍在持續(xù)探索中。

基于此，我們假設(shè)VDR可能會調(diào)節(jié)RBP4的表達，從而在一定程度上對肝癌細胞的生長產(chǎn)生影響。為此，利用RNAi技術(shù)抑制HepG2細胞中VDR的表達，以期在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平驗證VDR對HepG2細胞增殖的影響，同時探究VDR對RBP4的調(diào)控作用是否參與了HepG2細胞的增殖過程。

1 材料與方法

1.1 材料

VDR敲除型(VDR knockout,VDR-KO)小鼠及野生型(wild type,WT)小鼠的實驗樣品由張濤教授提供[16]。

高糖DMEM(1×)培養(yǎng)基(Life Technology)；0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液，胎牛血清和Opti-MEM(美國Gibco)；UltraSYBR Mixture(High ROX)(康為世紀)；cDNA第一鏈合成試劑盒 (北京全式金)；細胞活力檢測試劑盒、EdU-555細胞增殖檢測試劑盒、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒 (碧云天)；TRIzol RNA 分離試劑(ThermoFisher)；RBP4 Rabbit Polyclonal antibody、Coralite594-conjugated Goat Anti-RabbitlgG (H+L) (proteintech)；DAPI(武漢博士德)；siRNA干擾片段(吉瑪基因)；甲醇、氯仿等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

肝癌HepG2細胞在5% CO2和37 ℃條件下于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取已達到對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化后將細胞接種到6孔板中，待細胞密度達到80%以上，更換無血清的培養(yǎng)基，采用LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 Western Blot (WB)

將提取的蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離，120 V，2 h；加冰120 V，2 h轉(zhuǎn)PVDF膜。4 ℃封閉過夜。按照各抗體稀釋比例進行室溫孵育3 h。TBST洗膜，二抗孵育2 h，TBST洗膜。使用化學(xué)發(fā)光劑進行曝光。

1.2.3 Real-time quantitative PCR(qPCR)

收集各組細胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。實驗重復(fù)3次。引物序列如表1所示。

表1 qPCR引物列表

1.2.4 免疫熒光染色

組織冰凍切片或轉(zhuǎn)染的細胞，分別在預(yù)冷的丙酮和4%多聚甲醛中冰上固定；之后用1% Triton X-100室溫通透15 min；5%山羊血清，37 ℃封閉30 min；滴加RBP4一抗，室溫孵育2 h；山羊抗兔二抗避光孵育1 h；DAPI對細胞進行避光染核。在倒置熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.5 細胞活力檢測 (CellTiter-LumiTM發(fā)光法)

CellTiter-LumiTM發(fā)光法是一種通過化學(xué)發(fā)光法測定細胞內(nèi)ATP含量從而用于高靈敏度、寬線性范圍定量檢測活細胞數(shù)目的方法。HepG2細胞在室溫平衡10 min，96孔板每孔加入100 μL CellTiter-Lumi發(fā)光檢測試劑，室溫振蕩2 min后，于25 ℃孵育10 min，用多功能酶標儀進行化學(xué)發(fā)光檢測。最后，根據(jù)化學(xué)發(fā)光(Luminescence)讀數(shù)直接顯示細胞的相對活力RLU(relative light unit)。

1.2.6 EdU細胞增殖檢測

將轉(zhuǎn)染處理的HepG2細胞按照EdU-555細胞增殖檢測試劑盒的方法進行處理。EdU為5-乙炔基-2′-脫氧尿苷，是一種新型胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中，通過熒光探針Alexa Fluor 555以標記增殖分化的細胞。

1.2.7 雙熒光素酶活性檢測

將VDRsiRNA與RBP4啟動子缺失片段熒光素酶報告基因重組載體，分別是pGL3-(-1967/+98)、pGL3-(-1794/+98)、pGL3-(-1366/+98)、pGL3-(-720/+98)、pGL3-(-415/+98)、pGL3-(-209/+98)和pGL3-(-91/+98)，pGL3-Basic以及內(nèi)參pTK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行熒光素酶活性檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 siRNA降低HepG2細胞中VDR表達水平

利用qPCR檢測siRNA對HepG2細胞中VDR基因mRNA 表達的影響。結(jié)果顯示，與對照組比，VDRsiRNA-507對VDR基因mRNA表達的抑制作用最為顯著(P<0.01)，見圖1(a)，對VDR蛋白水平的抑制效率達到40%以上[圖1(c)(d)]。說明VDR siRNA-507靶向序列具有較高的沉默效率，基因干擾實驗符合預(yù)期。

(a)VDRsiRNA片段對HepG2細胞內(nèi)VDR的mRNA表達影響；(b)VDRsiRNA影響HepG2細胞增殖；(c)VDRsiRNA片段對HepG2細胞內(nèi)VDR蛋白表達的影響；(d)VDR/GAPDH的灰度值分析。* 為P<0.05；** 為P<0.01。圖1 VDRsiRNA干擾效率及對細胞增殖影響Figure 1 The VDR siRNA interference efficiency and effect on cell proliferation

隨后對轉(zhuǎn)染后的細胞進行CellTiter-LumiTM發(fā)光檢測，在相同底物濃度下RLU值越高表明其活細胞越多。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48 h，VDR siRNA-507的發(fā)光值最強[圖1(b)]，表明在干擾VDR的情況下，HepG2細胞明顯增多。由此推斷，VDR通過負調(diào)控作用的方式參與HepG2細胞的增殖過程。為了進一步驗證該假設(shè)，以VDRsiRNA為實驗處理，采用細胞集落形成和EdU染色檢測HepG2細胞的增殖情況。

2.2 干擾VDR顯著促進HepG2細胞的增殖

細胞集落形成實驗結(jié)果表明，與對照組比，VDR siRNA處理組的細胞數(shù)目顯著增加(P<0.01)，見圖2(b)，說明在干擾VDR的情況下促進了HepG2細胞的增殖。EdU檢測結(jié)果顯示，與對照組比，VDRsiRNA處理組的新增細胞數(shù)目顯著增加(P<0.01)，見圖2(c)和(d)，與細胞集落實驗結(jié)果一致。結(jié)果顯示，干擾VDR后的HepG2細胞增殖能力有所增加。

(a)VDRsiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞集落形成的結(jié)晶紫染色；(b)染色細胞面積統(tǒng)計圖；(c)VDRsiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞的EdU染色結(jié)果；(d)EdU染色細胞增殖統(tǒng)計圖。* 為P<0.05；** 為P<0.01。圖2 干擾VDR促進HepG2細胞的增殖Figure 2 The proliferation of HepG2 was promoted with VDRsiRNA

2.3 敲低VDR并未通過調(diào)控RBP4影響HepG2細胞的增殖

相對WT小鼠，VDR-KO小鼠肝臟RBP4的mRNA水平顯著增加，而在腎臟和脂肪組織中RBP4表達變化不顯著[圖3(a)]。隨后，VDR-KO小鼠的肝臟冰凍切片的免疫熒光染色結(jié)果顯示，其RBP4蛋白表達略有增加，但未達到統(tǒng)計學(xué)的顯著水平[圖3(b)和(c)]。

(a)RBP4 mRNA水平；(b)RBP4免疫熒光的定量分析；(c)RBP4的免疫熒光染色。* 為P<0.05，** 為P<0.01。圖3 VDR敲除鼠肝臟組織中RBP4表達水平Figure 3 RBP4 expression levels in liver of VDR knockout mice

在細胞水平上驗證的結(jié)果顯示，VDRsiRNA上調(diào)了RBP4的mRNA表達水平(P<0.01)，同時激活了BRP4的細胞膜受體STRA6(stimulated by retinoic acid gene 6)的表達(P<0.01)，但VDR的下游靶基因，即細胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)家族成員CYP24a1的表達并未發(fā)生顯著性變化，而下調(diào)了另一個靶基因CYP27b1的表達(P<0.05)，見圖4(a)。與組織學(xué)的結(jié)果相似，VDR的降低對RBP4蛋白的表達無顯著性影響[圖4(c)和(d)]。同時，由雙熒光素酶分析的結(jié)果可知，盡管RBP4啟動子區(qū)域中存在VDRE，但干擾VDR并沒有對RBP4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生顯著影響[圖4(b)]。

(a)VDRsiRNA對RBP4 mRNA表達的檢測；(b)VDRsiRNA對RBP4啟動子活性的影響；(c)VDRsiRNA對RBP4蛋白表達的影響；(d)RBP4免疫熒光染色定量分析。* 為P<0.05，** 為P<0.01。圖4 干擾VDR對RBP4表達及其啟動子活性的影響Figure 4 VDRsiRNA effects on RBP4 expression and its promoteractivity

3 討論

VDR可通過調(diào)控新型鈣離子通道蛋白(transient receptor potential vanilloid subfamily 5,TRPV5)的轉(zhuǎn)錄表達來抑制腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的增殖[5]。采用siRNA沉默VDR表達后，胃癌細胞增殖能力顯著增加，相反VDR過度表達的胃癌細胞則失去了增殖能力，經(jīng)證實VDR是通過調(diào)控β-連環(huán)蛋白(β-catenin)水平影響胃癌細胞增殖能力的[6]。VDR還可直接調(diào)控細胞周期蛋白表達，將肝癌細胞抑制在DNA合成前期，抑制肝癌細胞增殖[7]。研究表明，VDR在癌細胞的增殖過程中主要發(fā)揮抑制作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在降低HepG2細胞中VDR基因及蛋白表達的情況下，顯著促進了HepG2細胞的增殖，也說明VDR在肝癌HepG2細胞增殖過程中發(fā)揮抑制作用。

此外，研究結(jié)果證實與WT小鼠相比，VDR-KO小鼠脂肪組織的發(fā)育受損從而阻礙了瘦素(Leptin)蛋白的分泌[17]，并且在MC3T3-E1細胞的Leptin基因啟動子上游-28 kb處存在強烈的VDRE信號[18]。同時，VDR-KO小鼠體內(nèi)的成纖維生長因子23(fibroblast growth factor,FGF23)的水平顯著下降[19]。隨后，在FGF23基因下游和近端啟動子-1 156 bp處發(fā)現(xiàn)了VDRE[20]，并進一步證實了VDR對FGF23啟動子轉(zhuǎn)錄具有重要調(diào)控作用[21]。在RBP4啟動子區(qū)存在VDRE，并證實超表達VDR在HEK293T細胞中能夠改變RBP4的啟動子活性[10]。更關(guān)鍵的是，RBP4能夠通過激活MAPK信號通路使血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)過度增生[22]。VDR-KO小鼠肝臟中的RBP4表達受到了不同程度的影響。在此基礎(chǔ)上，實驗假設(shè)VDR的缺失可能會通過調(diào)節(jié)RBP4的轉(zhuǎn)錄表達而對肝癌細胞的增殖產(chǎn)生影響。然而，不論是組織水平還是細胞水平，VDR的缺失僅僅上調(diào)了RBP4轉(zhuǎn)錄水平，而在蛋白表達上的改變不顯著。因此，又進一步檢測了VDR siRNA對RBP4基因啟動子轉(zhuǎn)錄的作用。意外的是，VDR siRNA對RBP4基因啟動子活性的影響均不顯著。有研究顯示，vitamin D可以促進轉(zhuǎn)錄共激活子與VDR形成復(fù)合物，但分子伴侶熱應(yīng)激蛋白(heat shock proteins)Hsp90和p23可抑制該復(fù)合物識別VDRE，以阻斷配體激活的轉(zhuǎn)錄[23]。這說明VDR參與調(diào)節(jié)基因的順序表達是多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的結(jié)果。而在RBP4基因啟動子上不僅存在重要的順式作用元件TATA盒(TATATAAA)，還存在反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREBP)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)、維甲類X受體(retinoid X receptor,RXR)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點[24]。這些轉(zhuǎn)錄元件的存在可能會在一定程度上削弱VDR對RBP4啟動子的調(diào)控作用。此外，siRNA的轉(zhuǎn)染效率也可能會導(dǎo)致VDR無法對RBP4蛋白表達產(chǎn)生顯著性作用。由此推斷，VDRsiRNA對HepG2細胞增殖作用并非通過調(diào)控RBP4的表達實現(xiàn)的。

誠然，VDR抑制癌細胞增殖能夠通過多種途徑實現(xiàn)。例如，在vitamin D激活惡性前列腺上皮細胞中的VDR后，通過上調(diào)p21和p27的表達抑制周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)活性，從而抑制細胞增殖作用[25]。而對細胞周期相關(guān)的基因進行qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，干擾VDR對HepG2細胞中的CDK抑制因子p21和p27的表達無明顯影響，而細胞周期蛋白D1(cyclin D)基因表達量明顯低于NCsiRNA組(P<0.05)(結(jié)果未顯示)。因此，VDR siRNA促進HepG2細胞增殖過程與細胞周期性調(diào)控更為相關(guān)，而具體的結(jié)果還有待進一步驗證。

4 結(jié)論

干擾VDR表達會促進HepG2細胞的增殖。對肝癌細胞HepG2而言，VDR發(fā)揮重要的負調(diào)控作用，而VDR的降低對肝癌細胞增殖的促進作用并非通過RBP4實現(xiàn)。