馬小磊， 劉瑞娟， 曹 倩， 邢 睿， 陳世龍， 高慶波

(1. 中國科學院西北高原生物研究所青海省作物分子育種重點實驗室， 西寧 810008；2. 中國科學院大學， 北京 100049)

青藏高原擁有多樣的自然環(huán)境和豐富的生物資源，是我國特有物種最豐富的地區(qū)[1]。我國高等植物的細胞學研究仍有大量空白，僅有約22.6%的被子植物有細胞學研究[2]；青藏高原地區(qū)植物的細胞學研究較為薄弱，有細胞學研究的物種僅占該地區(qū)物種總數(shù)的10%[3]。

黑虎耳草[Micranthesatrata(Engl.)Losinsk.]、黑蕊虎耳草[M.melanocentra(Franch.)Lonsinsk.]在以往的分類系統(tǒng)中隸屬于虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草屬(SaxifragaTourn. ex L.)小花組(Sect.Micranthes)[4-6]。形態(tài)學和分子生物學等多方面的證據(jù)支持小花組從虎耳草屬獨立，成立新的屬MicranthesHaw.[6-8]，該屬暫時沒有確定的中文名。Micranthes大約有70個物種，主要分布于北美安第斯山脈，我國分布有13種，黑虎耳草(M.atrata)僅分布于祁連山及其周邊區(qū)域；黑蕊虎耳草(M.melanocentra)主要分布于青藏高原東緣和南緣[5]。前期研究表明Micranthes的物種核型復雜，染色體基數(shù)和倍性存在較大差異，且存在非整倍體和多倍體；國內(nèi)分布的Micranthes物種有6個已有細胞學方面的研究[9-10]。黑蕊虎耳草(M.melanocentra)有多倍體[10]和非整倍體[11]的報道；黑虎耳草(M.atrata)暫未看到相關(guān)研究報道。

祁連獐牙菜(SwertiaprzewalskiiPissjauk.)隸屬于龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬(SwartiaL.)。獐牙菜屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一直未能解決，分子證據(jù)顯示獐牙菜屬并非單系類群，且分子系統(tǒng)學和形態(tài)分類學出現(xiàn)明顯的分歧[12-13]。獐牙菜屬大約有150個物種，75個物種分布于我國。祁連獐牙菜(S.przewalskii)分布于祁連山及其周邊區(qū)域[14]。目前，獐牙菜屬29個物種有核型研究[9-10]，其中20個物種在中國有分布。獐牙菜屬的物種多為二倍體，但屬內(nèi)染色體基數(shù)差異較大，部分物種染色體基數(shù)在不同報道中存在差異[15-16]。祁連獐牙菜暫未看到相關(guān)研究報道。

黑虎耳草(M.atrata)、黑蕊虎耳草(M.melanocentra)和祁連獐牙菜(S.przewalskii)是重要的藏藥資源植物，3種植物開發(fā)利用和多樣性保護相關(guān)的研究較為欠缺。近年來部分學者對3種青藏高原特有植物的分子遺傳多樣性[17]、生物保護[18]等方面做了部分工作，但細胞學等基礎(chǔ)研究資料仍是空白。本研究以采集自青海和四川的黑虎耳草(M.atrata)、黑蕊虎耳草(M.melanocentra)和祁連獐牙菜(S.przewalskii)的多個居群的種子為材料，開展核型分析，以期為3個物種的開發(fā)利用及保護提供細胞學資料。

1 材料與方法

材料于2018—2019年采集自青海省和四川省，具體采集信息見表1。所有標本由中國科學院西北高原生物研究所高慶波研究員鑒定，憑證標本保存于西北高原生物研究所標本館(HNWP)。

采用濾紙萌發(fā)法和壓片法對材料進行處理。種子萌發(fā)：種子用50 mg/L的赤霉素處理2 h，置于墊有一張滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用50 mg/L的赤霉素溶液澆透，放置于培養(yǎng)箱中萌發(fā)。培養(yǎng)箱的程序設(shè)定為16 h光照+8 h黑暗，25 ℃恒溫。萌發(fā)期間每隔2～3天補充一次培養(yǎng)液。預處理：待幼苗根尖長到0.3～0.5 cm，將幼苗放置于噴有少量培養(yǎng)液的EP管中，室溫下用500 000～600 000 Pa壓強的一氧化氮(NO)處理2 h。固定：處理后的幼苗置于4 ℃冰箱中，加入卡諾試劑(冰醋酸∶無水乙醇=1∶3)固定2 h左右。染色：固定后的幼苗置入45%的冰醋酸處理5 min以上，將處理好的幼苗根尖切下(約1 mm)，放于載玻片上，滴一滴改良石炭酸品紅染液，染色3 min后壓片觀察。染色液配置方法和壓片操作參考《植物染色體研究技術(shù)》[19]。鏡檢：制作的臨時裝片放置于顯微鏡下進行觀察和計數(shù)，并拍攝染色體形態(tài)較好、分散均勻的有絲分裂中期細胞。

每個物種選取30個以上細胞進行染色體計數(shù)(黑虎耳草樣本數(shù)少，所統(tǒng)計細胞數(shù)目不足30個)，以其中80%以上細胞具一致且恒定的染色體數(shù)目作為該物種的染色體數(shù)。每個物種挑選5張染色體分散較好的中期細胞照片，使用KaryoType 2.0軟件[20]測量染色體長度。黑虎耳草和黑蕊虎耳草的染色體極小，大部分染色體無法判斷著絲粒位置，依據(jù)李懋學和張敩方[19]的標準，兩物種屬于具小染色體的植物，故僅測量染色體絕對長度，并求取平均值用于計算染色體相對長度、單倍體染色體總長以及最長和最短染色體長度比。祁連獐牙菜染色體大，故測量染色體絕對長度、長臂和短臂絕對長度，求取平均值并參考李懋學等[21]的標準進行染色體核型分析。判斷核型類型依據(jù)Stebbins等[22]的標準，判斷著絲點位置和染色體類型依據(jù)Levan等[23]的標準；同時計算著絲粒指數(shù)變異系數(shù)(CVCI)、染色體長度變異系數(shù)(CVCL)[24]、平均著絲粒不對稱系數(shù)(MCA)[25]、核型不對稱指數(shù)(As. K%)[26]；繪制核型模式圖。

表1 物種采集信息

2 結(jié)果與分析

黑虎耳草的2個居群采集于青海省祁連山國家公園，染色體數(shù)目均為2n=2x=22，染色體相對長度范圍為6.02%～12.74%(表2)，單倍體染色體總長THL=16.26 μm，最長和最短染色體長度比為1.93。黑虎耳草的花及中期染色體形態(tài)見圖1 (a)和 (b)。

表2 3個物種的核型參數(shù)

黑蕊虎耳草的5個居群采集于四川和青海，染色體數(shù)目均為2n=2x=22，染色體相對長度范圍為6.47%～12.91%(表2)，單倍體染色體總長THL=15.08 μm，最長和最短染色體長度比為2.04。黑蕊虎耳草的花及中期染色體形態(tài)見圖1 (c) 和(d)。

祁連獐牙菜的5個居群均采集于青海省祁連山國家公園。5個居群的根尖細胞的染色體數(shù)目相同，核型公式為2n=2x=24=20m+4sm，由中部著絲點和亞中部著絲點染色體組成，其中第3對和第9對染色體為亞中部著絲點染色體(sm)，其余為中部著絲點染色體(m)。染色體相對長度范圍為5.95%～11.23%(表2)，單倍體染色體總長THL=31.98 μm；最長和最短染色體長度比為2.03，臂比大于2的染色體比例為0，核型類型為1B；核型不對稱指數(shù)As.K%=58.8%、著絲粒指數(shù)變異系數(shù)CVCI=6.62、染色體長度變異系數(shù)CVCL=19.18、平均著絲粒不對稱系數(shù)MCA=17.61。祁連獐牙菜的花、有絲分裂中期染色體形態(tài)及核型模式圖，見圖1(e) 、(f) 和(g)。

(a)和(b)黑虎耳草；(c)和(d)黑蕊虎耳草；(e)～(g)祁連獐牙菜。圖1 3個物種的花、有絲分裂中期細胞及祁連獐牙菜核型模式圖Figure 1 Flower,mitotic metaphase chromosomes of three species and ideograms of Swertia przewalskii

3 討論與結(jié)論

全球有細胞學報道的廣義虎耳草屬物種有226種，多倍化和非整倍體現(xiàn)象在虎耳草屬中較常見[27-28]。以往研究中黑蕊虎耳草的倍性變化較大(2n=22，44，66，88，110 )[10]，且存在非整倍體(2n=22，12)[11]。但本研究的5個居群中并沒有發(fā)現(xiàn)多倍體及非整倍體，與前人研究結(jié)果不一致，推測是因為采樣區(qū)域不同。研究結(jié)果揭示分布在青海和四川的黑蕊虎耳草居群中出現(xiàn)多倍體的頻率較低。胡晶晶[27]使用流式細胞儀測定了65個虎耳草屬植物的染色體倍性和基因組大小，其中黑蕊虎耳草為二倍體，與本研究結(jié)果一致。黑蕊虎耳草和黑虎耳草的染色體數(shù)目均為2n=22。在Tkach等[8]的分類系統(tǒng)中，兩個物種隸屬于Micranthessect.Melanocentra(Engl. & Irmsch.)Tkach.，該組的物種Micranthesdivericata(Engl. & Irmsch.)Losinsk.[29]和M.pallida(Wall. Ex Ser.)Losinsk.[10]體細胞染色體數(shù)目均為2n=22。 2n=22在該屬其他組少見，僅M.micranthidifolia(Haw.) Small[30]，隸屬于MicranthesHaw. sect.Micranthes。

國內(nèi)外對獐牙菜屬的細胞學研究報道相對較少，現(xiàn)有的研究表明，獐牙菜屬的物種多為二倍體，染色體基數(shù)變化大(x=7～14)。本研究中祁連獐牙菜5個居群均為2n=24，核型公式為2n=2x=24=20m+4sm，核型類型為1B。獐牙菜屬有6種植物染色體數(shù)為2n=24，但6個物種均存在種內(nèi)染色體基數(shù)變化[9-10]，且獐牙菜屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明祁連獐牙菜和這6個物種的親緣關(guān)系較遠[12-14]。祁連獐牙菜及其近緣種染色體基數(shù)不一致，黃榮福等[15]報道了二葉獐牙菜(SwertiabifoliaBatal.)的染色體數(shù)目大約為26；何廷農(nóng)等[16]報道了華北獐牙菜(SwertiawolfgangianaGruning)和二葉獐牙菜均為2n=28；長柄獐牙菜(SwertiapetiolataRoyle ex D. Don)2n=26[10]。造成祁連獐牙菜及其近緣種染色體基數(shù)不一致的原因有待進一步的研究。

青藏高原地區(qū)低基數(shù)二倍體和古多倍體在龍膽科和虎耳草科的出現(xiàn)頻率很高[3,15]。黑虎耳草、黑蕊虎耳草和祁連獐牙菜均為高基數(shù)二倍體，即古多倍體。王家堅等[3]的研究表明青藏高原的地質(zhì)歷史和環(huán)境特性雖然有利于多倍體的形成，但植物在二倍體水平上的適應機制在青藏高原上依舊是很成功的，本實驗結(jié)果為該推斷提供了數(shù)據(jù)支撐。3種植物的核型報道補充了青藏高原特有物種的細胞學資料，同時為該物種的開發(fā)、利用和保護研究提供了依據(jù)。