章英才， 王 靜， 陶珊珊

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 銀川 750021)

阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，廣泛分布于植物體各器官的細(xì)胞中，參與植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[1]、生殖生長(zhǎng)和發(fā)育[2]的各個(gè)環(huán)節(jié)。目前集中研究AGPs在根形態(tài)建成、細(xì)胞增殖與程序性死亡、雌雄配子體的發(fā)育、花藥發(fā)育與花粉管生長(zhǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生以及植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等方面的功能[3-4]，但對(duì)植物果實(shí)發(fā)育中AGPs的研究較少，如蘋果[5]、寧夏枸杞[6-7]等果實(shí)。AGPs由多糖支鏈和蛋白質(zhì)核心鏈組成[8-10]，糖基部分主要由阿拉伯糖和半乳糖構(gòu)成[11]。研究表明，寧夏枸杞多糖是一種以-O-連接的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的阿拉伯半乳聚糖AGPs糖蛋白，枸杞果實(shí)的多糖具有典型的AGPs阿拉伯半乳聚糖糖蛋白特征，分布于果肉細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和質(zhì)體膜[6-7]；枸杞多糖是type II類型的阿拉伯半乳聚糖蛋白AGPs[12]。枸杞子糖蛋白被證實(shí)是枸杞果實(shí)提高免疫活性和抗衰老的藥用有效成分[13-14]。這與已報(bào)道的長(zhǎng)棗多糖的藥理功能相一致[15]，也與靈武長(zhǎng)棗不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中精制多糖的10種單糖中阿拉伯糖、半乳糖含量較高的研究結(jié)果一致[16]。因此，明確靈武長(zhǎng)棗果實(shí)AGPs多糖蛋白積累和分布非常重要。

AGPs可能分布在植物各種組織和細(xì)胞的細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞器以及胞外基質(zhì)等部位[17]。人工合成的苯基偶氮染色劑βGlcY(β-D-glucosyl-Yariv reagent)與AGPs發(fā)生特有反應(yīng)，形成棕紅色絮狀沉淀，成為鑒定AGPs的常用染色劑[9]。但更多的是利用βGlcY對(duì)組織和器官中AGPs進(jìn)行定量分析[17-18]，以及通過與AGPs結(jié)合研究其功能[18-19]，而利用βGlcY進(jìn)行定位分布的研究極少[17]。與AGPs進(jìn)行特異性反應(yīng)的單克隆或多克隆抗體，成為研究AGPs時(shí)空分布普遍采用的良好工具[20-21]。如Bao等[7]通過Western Blot分析證實(shí)JIM8、JIM13、MAC204、JIM94為抗枸杞果實(shí)AGPs的抗體，并對(duì)果實(shí)AGPs進(jìn)行了免疫組化定位。目前，通過βGlcY試劑對(duì)AGPs染色、單克隆抗體與AGPs反應(yīng)等手段，為不同植物中不同部位AGPs的分布和表達(dá)定位提供支撐[22-25]。

靈武長(zhǎng)棗(ZiziphusjujubaMill cv. Lingwuchangzao)原產(chǎn)于寧夏靈武市，果實(shí)中長(zhǎng)棗多糖蛋白是最重要的藥用生物活性成分之一。近年來，在靈武長(zhǎng)棗果實(shí)貯藏保鮮、品種選育等方面有了較多的研究成果[26]，而有關(guān)果實(shí)多糖重要組成AGPs糖蛋白的分布和與果實(shí)品質(zhì)影響的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以不同發(fā)育時(shí)期的“靈武長(zhǎng)棗”果實(shí)為試驗(yàn)材料，應(yīng)用βGlcY染色技術(shù)，研究了不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)AGPs的分布特征，并通過免疫熒光定位法進(jìn)行印證。為探討AGPs定位分布研究的βGlcY染色技術(shù)及該成分在品質(zhì)調(diào)控方面的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地6年生“靈武長(zhǎng)棗”為供試材料，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，分別在果實(shí)膨大前期(2021年7月10日)、快速膨大期(2021年8月9日)、著色期(2021年9月8日)、完熟期(2021年9月28日)，選擇標(biāo)記3 000朵花朵的枝條上果實(shí)作為試驗(yàn)對(duì)象，采摘后用冰壺冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室[27]。

按質(zhì)量比為9∶1稱取聚乙二醇-400二硬脂酸酯[Polyethylene glycol (PEG) 400 distearate(Sigma-Aldrich，cat.#305413)]和1-十六烷醇[1-Hexadecanol (Sigma-Aldrich，cat.#258741)]顆粒，放入燒杯中在50 ℃的溫箱中熔化混勻，室溫下冷卻成為熔點(diǎn)35 ℃～37 ℃石蠟Steedman’s wax保存?zhèn)溆谩＆翯lcY和βManY購(gòu)自Biosupplies Australia Pty Ltd；AGPs單克隆抗體MAC204購(gòu)自美國(guó)喬治亞大學(xué)，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 糖蛋白βGlcY定位

(1)石蠟切片。選取各不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)，用刀片將材料切成帶外果皮的(0.6×0.4×0.5) cm小塊，立即放入4%多聚甲醛-0.5%戊二醛的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)固定液中，蓋緊瓶蓋后注射器多次抽氣至樣品沉落瓶底，在室溫下固定12 h或過夜。樣品用PBS磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)清洗3次，每次15 min。在4 ℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水，每次60 min，100%乙醇3～4次，60 min /次。樣品在37 ℃恒溫箱中用1∶1的純乙醇∶Steedman’s wax石蠟滲透過夜，次日更換1∶3的純乙醇∶石蠟滲透2.5 h，再用純石蠟繼續(xù)滲透3次，每次2 h。將樣品用純石蠟在牛皮紙盒中包埋，常溫凝固后即可。將樣品蠟塊固著在小木塊上，在25 ℃左右環(huán)境中，用LEICA RM 2255切片機(jī)切片，厚度為10 μm，光面朝下放在較低溫的瓷盤中。先在涂有0.2%聚乙烯亞胺的載玻片上加一兩滴蒸餾水，用鑷子將蠟帶光滑面朝下輕放在載玻片水滴中，按順序排好，在25 ℃左右室溫下可自然展片，切片自然展片后將多余的水吸去，晾干一周后備用。(2)βGlcY和βManY標(biāo)記。將粘有蠟帶的載玻片切片放入裝有純乙醇的染色缸中，中間換2次純乙醇，30 min/次，切片完全脫蠟后，依次放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇的染色缸中逐級(jí)復(fù)水，每級(jí)10 min。直接在載玻片上滴1滴配置好的0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的Yariv reagent(用預(yù)先配制1 mg/mL溶解于0.15 mol/L的NaCl母液稀釋)對(duì)切片染色60 min。對(duì)照采用βManY(用預(yù)先配制1 mg/mL溶解于0.15 mol/L的NaCl母液稀釋)，即陰性對(duì)照切片用βManY代替βGlcY；然后用ddH2O沖洗2～3次，每次1 min。稍微晾干后，取100%甘油少許滴在切片上封片。吸去多余的封片劑后用指甲油將蓋玻片周圍封固，OLYMPUS IX73顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 糖蛋白免疫熒光定位

參照Bao等[7]的方法，略有改動(dòng)。(1)石蠟切片。4個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)用刀片切成合適的大小，立即放入含有體積分?jǐn)?shù)為3.7%的甲醛的2F4固定液中，蓋緊瓶蓋后注射器抽氣至樣品下沉瓶底，室溫固定4 h。更換固定液3次，每次30 min。然后用PBS磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)清洗3次，每次15 min。樣品在4 ℃下用0.05% Toluidine blue(甲苯銨藍(lán))染色15 min，在4 ℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水，每次60 min，100%乙醇3～4次，60 min/次。樣品用純乙醇∶Steedman’s wax石蠟=1∶1在37 ℃恒溫箱中滲透過夜，次日更換純乙醇∶石蠟=1∶3滲透2.5 h，再用純石蠟在37 ℃滲透3次，每次2 h。將樣品用純Steedman’s wax在牛皮紙盒中包埋，常溫凝固即可。后期蠟塊的固著、整修、切片、貼片和展片與前述石蠟切片步驟相同。(2)免疫熒光標(biāo)記。將貼片后的載玻片放入裝有純乙醇的染色缸中，中間換2次純乙醇，30 min/次，切片即可全部脫蠟。切片依次放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇的染色缸中逐級(jí)復(fù)水，每級(jí)10 min。將載玻片上切片在PBS(10 mmol/L，pH 7.4)培養(yǎng)皿中浸泡10 min，用含50 mmol/L甘氨酸的PBS溶液封閉30 min，PBS(10 mmol/L，pH 7.4)浸泡10 min，然后用2% BSA的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)溶液室溫封閉10 min，PBS(10 mmol/L，pH 7.4)浸泡10 min。用PBS(含1% BSA)以1∶100比例稀釋后的AGPs單克隆抗體MAC204，4 ℃下孵育過夜(陰性對(duì)照切片采用含1% BSA的PBS溶液代替一抗孵育)，次日用PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，以去除多余抗體，再用PBS(含1%BSA)以1∶200比例稀釋后的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗36 ℃黑暗條件下孵育1 h。標(biāo)記后，PBS淋洗浸泡3次，每次10 min，除去未標(biāo)記的二抗，用0.01% Toluidine blue染色10 min，以去除植物本身的自發(fā)熒光。切片用PBS(10 mmol/L，pH 7.4)淋洗(浸泡)10 min，稍微晾干后，取甘油少許滴在切片上，用蓋玻片封片，避免產(chǎn)生氣泡，吸去多余的封片劑后用指甲油將蓋玻片周圍封固，盡快在OLYMPUS IX73熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨大前期果實(shí)AGPs的βGlcY定位

βGlcY與AGPs發(fā)生特有的反應(yīng)，形成棕紅色絮狀沉淀。膨大前期果實(shí)0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度的βGlcY形成的棕紅色沉淀的強(qiáng)弱不同，濃度越高染色強(qiáng)度越大[圖1(a)～(d)]。而βManY在果實(shí)相應(yīng)部位均沒有棕紅色沉淀[圖1(e)]。果實(shí)外果皮βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光在細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布，緊鄰?fù)夤さ臄?shù)層排列較為緊密，內(nèi)部相鄰數(shù)層排列較疏松的大型中果皮細(xì)胞內(nèi)外均分布βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光[圖1(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束所有細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光[圖1(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況；外果皮及內(nèi)部組織AGPs定位。(e)近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內(nèi)部組織免疫熒光分布。(g)中部中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮；En：內(nèi)果皮。(a)～(f)，Bar=100 μm；(g)～(h)，Bar=50 μm。圖1 膨大前期果實(shí)AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 1 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the early bulking period

2.2 快速膨大期果實(shí)AGPs的βGlcY定位

快速膨大期果實(shí)0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度βGlcY形成的棕紅色沉淀的強(qiáng)弱不同，濃度越高染色強(qiáng)度越大[圖2(a)～(d)]。而βManY在維管束及薄壁細(xì)胞等部位均沒有棕紅色沉淀[圖2(e)]。外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光；內(nèi)部數(shù)層大型卵圓形薄壁細(xì)胞AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光均主要分布于細(xì)胞壁上，大部分細(xì)胞內(nèi)部無分布[圖2(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束的所有細(xì)胞內(nèi)外均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光；除了空腔之外，維管束周圍中果皮薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁都分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)部分布較少，部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂現(xiàn)象[圖2(a)～(d)，(f)～(h)]。近內(nèi)果皮維管束的所有細(xì)胞內(nèi)外以及維管束周圍薄壁細(xì)胞的部分細(xì)胞內(nèi)外也都分布βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光[圖2(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況；中果皮維管束及周圍組織AGPs定位。(e)中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內(nèi)部組織免疫熒光分布。(g)近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。圖2 快速膨大期果實(shí)AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 2 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the rapid enlargement period

2.3 著色期果實(shí)AGPs的βGlcY定位

著色期果實(shí)0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度的βGlcY形成棕紅色沉淀的強(qiáng)弱也不同，濃度越高染色強(qiáng)度越大[圖3(a)～(d)]。βManY在維管束及薄壁細(xì)胞等部位均沒有棕紅色沉淀[圖3(e)]。βGlcY-AGPs形成棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光在外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布[圖3(a)～(d)，(f)～(h)]。內(nèi)部數(shù)層大型卵圓形薄壁細(xì)胞βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光均主要在薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞內(nèi)部均較少分布，分布有所減少[圖3(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束的所有細(xì)胞均分布有AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光；維管束周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光，但大部分薄壁細(xì)胞內(nèi)部無分布[圖3(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況。(a)(d)外果皮及內(nèi)部組織AGPs定位；(b)(c)中果皮維管束及周圍組織AGPs定位。(e)中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內(nèi)部組織免疫熒光分布。(g)近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。圖3 著色期果實(shí)AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 3 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the the coloring period

2.4 完熟期果實(shí)AGPs的βGlcY定位

與著色期相似，完熟期果實(shí)0.05、0.1、0.5、1 mg/mL不同濃度βGlcY形成的棕紅色沉淀的強(qiáng)弱也不同，濃度越高染色強(qiáng)度越大[圖4(a)～(d)]。與前幾個(gè)時(shí)期相似，βManY在維管束及薄壁細(xì)胞等部位均沒有棕紅色沉淀[圖4(e)]。外果皮及內(nèi)部數(shù)層排列較為緊密的中果皮小細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光；相鄰內(nèi)部較大型的中果皮薄壁細(xì)胞βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光均主要在薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而細(xì)胞內(nèi)部均較少分布，分布明顯減少，很多細(xì)胞出現(xiàn)破裂[圖4(a)～(d)，(f)～(h)]。除空腔之外，在中果皮中部及內(nèi)部維管束的所有細(xì)胞均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光[圖4(a)～(d)，(f)～(h)]。維管束周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁均分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀和抗體所識(shí)別的抗原綠色熒光，但大部分薄壁細(xì)胞內(nèi)部無分布[圖4(a)～(d)，(f)～(h)]。

(a)～(d)分別為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL濃度βGlcY處理后AGPs的染色情況。(a)外果皮及內(nèi)部組織AGPs定位；(b)～(d)中果皮維管束及周圍組織AGPs定位。(e)中果皮維管束及周圍組織，βManY處理后均沒有棕紅色沉淀。(f)外果皮及內(nèi)部組織免疫熒光分布。(g)近外果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。(h)近內(nèi)果皮的中果皮維管束及周圍組織免疫熒光分布。A：AGPs形成的棕紅色沉淀；VB：維管束；Ex：外果皮。(a)～(h)，Bar=100 μm。圖4 完熟期果實(shí)AGPs的βGlcY及免疫熒光定位Figure 4 βGlcY and immunofluorescence distribution of AGPsduring the maturation period

總體來看，βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀在各時(shí)期果實(shí)外果皮及相鄰內(nèi)部數(shù)層排列緊密的中果皮小細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均有分布；中果皮大型卵圓形薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)在膨大前期均有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀，而在快速膨大期、著色期和完熟期均主要分布于薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁上，大部分細(xì)胞內(nèi)部無分布；各時(shí)期果實(shí)維管束所有細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部都分布有βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀。隨著果實(shí)發(fā)育成熟，βGlcY-AGPs形成的棕紅色沉淀分布有所減少。

3 討論與結(jié)論