張晶娜， 周 剛， 劉娟娟， 方澤民， 肖亞中

(安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代生物制造安徽省重點實驗室安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)研究中心，合肥 230601)

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類可以催化酚類和非酚類化合物氧化的含銅多酚氧化酶。一般情況下，4個底物分子在漆酶的I型Cu位置分別失去1個電子；4個電子經(jīng)電子傳遞鏈達(dá)到三銅中心與氧分子結(jié)合，將后者還原為2分子水[1]。漆酶由于催化底物范圍寬、以水為唯一產(chǎn)物等優(yōu)勢，被認(rèn)為是“綠色”的生物催化劑，在環(huán)境廢水處理、天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、新材料制備、新型電極研發(fā)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值[2]。來自Phomasp. UHH 5-1-03的漆酶可以去除廢水中85%的藥物活性化合物[2]；基于漆酶的生物傳感器已被用于測定食品、環(huán)境中的酚類物質(zhì)[3]；Yang等[4]以漆酶等為材料制備了一種新型生物傳感器，用于檢測對苯二酚的電催化性能，顯示出選擇性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)良性能。

研究顯示，真菌、植物、細(xì)菌和昆蟲等的基因組中均包含漆酶編碼基因。但是，真菌和細(xì)菌依然是漆酶的主要來源[5]。據(jù)統(tǒng)計，目前發(fā)現(xiàn)的漆酶超過80%來源于真菌，包括子囊菌門、擔(dān)子菌門和半知菌門真菌[6]。相比較，細(xì)菌來源的漆酶占比為10%左右，來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等的漆酶如CotA等已被克隆。與細(xì)菌漆酶相比，真菌漆酶具有氧化還原電勢高、比活力高、底物范圍廣等優(yōu)勢，已成為微生物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)、生物化工等領(lǐng)域的研究熱點[7-8]。然而，真菌漆酶發(fā)酵制備周期長、表達(dá)量低，主要在酸性條件下(pH 3.5～5.5)發(fā)揮最佳活性，當(dāng)pH值>7時活性基本為零，限制其在部分工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用[9]。發(fā)現(xiàn)在中堿性條件下具有高效催化活力的真菌漆酶并實現(xiàn)其高效制備對拓展漆酶的應(yīng)用至關(guān)重要。

課題組前期通過將灰蓋鬼傘菌(CoprinopsiscinereaOkayama7#130，OK7)與球托霉菌w5(Gongronellasp. w5)共培養(yǎng)，獲得漆酶Lcc9。該漆酶具有在中堿性條件下發(fā)揮最佳催化活性和堿性穩(wěn)定性等優(yōu)勢，可高效催化靛藍(lán)轉(zhuǎn)化，在紡織整染領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值[10]。在共培養(yǎng)條件下，Lcc9的最大表達(dá)量約為1.8 U/mL[10]。將Lcc9的cDNA克隆至畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)后，酶活力達(dá)到3.1 U/mL[11]。在此基礎(chǔ)上，本文利用雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)組成型gpdII啟動子控制漆酶Lcc9[12]，利用釀酒酵母同源重組技術(shù)構(gòu)建lcc9過表達(dá)載體，以實現(xiàn)其在灰蓋鬼傘菌株FA2222和OK7中的同源過表達(dá)，提高Lcc9的表達(dá)水平并為Lcc9的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C.cinereaOkayama7#130(OK7，ade8-)由美國北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校Patricia J. Pukkila教授惠贈，菌株C.cinereaFA2222(FA2222，trp-)、質(zhì)粒pYSK-lcc1、pAde8、pBD5由哥廷根大學(xué)Ursula Kües教授惠贈?；騦cc9克隆質(zhì)粒保存于本實驗室。引物的合成、測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Y1H購自Takara(日本)生物公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、DNA質(zhì)粒抽提試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；酵母質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；纖維素酶與幾丁質(zhì)酶購自Sigma-Aldrich化學(xué)(德國)有限公司；GF-1控時調(diào)速式高速分散器購自海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；ABTS購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。SD/-ura固體培養(yǎng)基(配方見Takara《釀酒酵母轉(zhuǎn)化用戶手冊》)用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化子篩選，YPDA(2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖及0.012%腺嘌呤半硫酸鹽)用于釀酒酵母的液態(tài)培養(yǎng)，再生培養(yǎng)基[12]與最簡培養(yǎng)基[12]分別用于灰蓋鬼傘陽性轉(zhuǎn)化子初篩和復(fù)篩，YMG固體培養(yǎng)基(0.4%葡萄糖、0.4%酵母提取物、1%麥芽提取物、1%瓊脂粉)用于灰蓋鬼傘菌株活化，Kjalke培養(yǎng)基(2%酵母提取物、3%葡萄糖、0.05%CaCl2·H2O、0.2% KH2PO4、0.005% MgSO4·7H2O)用于灰蓋鬼傘的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶。

1.2 方法1.2.1 pYSK-lcc9質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)lcc9基因序列設(shè)計一對含有pYSK質(zhì)粒同源片段的上下游引物，lcc9-F：ACATCCACCATCTCCGTTTTCTCCCATCTACACACAACAAGCTTATCGCCATG-TCCAGGAAACTTTTCTCTCTCGCCT；lcc9-R：TGACTATAGCAGCCTCCTACCACTGGCCCTCTGGTCAACTATAAT-ATTATTTAAGGAGTGGGGACAATTTGGATAGAGGTG(下劃線為同源臂片段)。通過PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增目標(biāo)基因lcc9，PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 50 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。質(zhì)粒pYSK-lcc1經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和HpaI雙酶切處理后回收載體片段，并與含有同源臂的lcc9片段共轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母Y1H感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組(圖1)。轉(zhuǎn)化菌株于SD/-ura固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d直至單克隆出現(xiàn)。挑取單克隆酵母菌落至3 mL YPDA液體培養(yǎng)基，在30 ℃ 250 r/min條件下培養(yǎng)1～2 d后，參照酵母質(zhì)粒抽提試劑盒操作步驟抽提釀酒酵母質(zhì)粒。按照大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化步驟將釀酒酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞以增加其拷貝數(shù)，挑取單克隆于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，抽提質(zhì)粒并測序。

F為上游同源臂片段；R為下游同源臂片段。Lcc9的表達(dá)由香菇啟動子PgpdII啟動，由漆酶基因lcc1終止子終止。圖1 質(zhì)粒pYSK的結(jié)構(gòu)及基因替換策略Figure 1 Structure of plasmid pYSK and strategy of gene replacement

1.2.2C.cinerea的轉(zhuǎn)化及篩選

按照《分子克隆與實驗指南》中的質(zhì)粒提取操作步驟抽提pYSK-lcc9、pAde8與pBD5質(zhì)粒。將pYSK-lcc9與pAde8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)OK7原生質(zhì)體細(xì)胞；pYSK-lcc9與pBD5質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)FA2222原生質(zhì)體細(xì)胞?；疑w鬼傘菌原生質(zhì)體制備及DNA共轉(zhuǎn)化操作步驟參照Kilaru等[12]的研究。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于再生培養(yǎng)基并于37 ℃條件下培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。每天挑取轉(zhuǎn)化子并計數(shù)。挑取的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至含有0.5 mmol/L ABTS的最簡培養(yǎng)基中進(jìn)行陽性克隆復(fù)篩。

1.2.3 陽性克隆的液態(tài)發(fā)酵、酶活力測定及活性電泳檢測

在YMG平板上挑取4塊邊長約0.5 cm的菌塊，接入YMG液體種瓶培養(yǎng)基(100 mL/500 mL)，120 r/min，37 ℃培養(yǎng)4 d后勻漿(350 W，28 000 r/min，5 s)；按照體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種至Kjalke(加入終濃度為0.1 mmol/L Cu2+)培養(yǎng)基中(100 mL/500 mL)，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，每隔24 h取樣并監(jiān)測漆酶活力變化。

漆酶活力測定采用ABTS法進(jìn)行，具體為取950 μL酒石酸鈉緩沖液(100 mmol/L，pH 4.0)，加入33 μL15 mmol/L ABTS和適當(dāng)稀釋的酶液17 μL，充分混勻后30 ℃水浴3 min，冰浴30 s終止反應(yīng)，在λ=420 nm波長下測定反應(yīng)液的光吸收值。漆酶活力計算公式：E(U/L)=OD420×稀釋倍數(shù)×555.56。

通過活性-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)檢測發(fā)酵液中的漆酶表達(dá)情況。具體操作步驟：將稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液上清液與2×上樣緩沖液混勻后，點樣10 μL至活性膠膠孔內(nèi)，于VE-180A微型垂直電泳槽中80 V電壓電泳30 min后，120 V繼續(xù)電泳3 h。取下活性膠并于100 mmol/L pH 4.0酒石酸鈉緩沖液(0.5 mmol/L ABTS)中室溫孵育，待淺藍(lán)色條帶出現(xiàn)，停止孵育并拍照取圖。

1.2.4 FA2222-lcc9菌株的3 L發(fā)酵罐發(fā)酵制備

按照1.2.3步驟活化FA2222菌株、勻漿并按5%接種量接至3 L發(fā)酵罐，選擇Kjalke培養(yǎng)基(含終濃度0.1 mmol/L的Cu2+)于37 ℃、50 r/min、初始pH值為5.8條件下發(fā)酵培養(yǎng)菌株，期間保持菌體溶氧(DO)為20%左右。每隔12 h取樣并測定漆酶活力。發(fā)酵結(jié)束后，用管式離心機(jī)8 000 r/min離心10 min收集發(fā)酵液上清液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 lcc9過表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)釀酒酵母同源重組原理(圖1)，當(dāng)lcc9起始同源臂長度設(shè)計為30 bp時，僅有14.3%的酵母轉(zhuǎn)化子包含同源重組的lcc9過表達(dá)載體pYSK-lcc9；當(dāng)同源臂長度增加至50 bp時，比例增加至100%。

(a)轉(zhuǎn)化子在再生培養(yǎng)基上的初篩；(b)和(c)分別為單轉(zhuǎn)和共轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化子在最簡培養(yǎng)基上的復(fù)篩。圖2 陽性轉(zhuǎn)化子的初篩與復(fù)篩Figure 2 Primary and re-screening of positive transformants on agar plates

2.2 C.cinerea陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

pYSK-lcc9共轉(zhuǎn)化入OK7和FA2222原生質(zhì)體后，為了確保獲得陽性轉(zhuǎn)化子，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩和復(fù)篩實驗。經(jīng)再生培養(yǎng)基初篩[圖2(a)]以及包含0.5 mmol/L底物ABTS最簡培養(yǎng)基復(fù)篩[圖2(b)和(c)]，共獲得pAde8單轉(zhuǎn)化OK7轉(zhuǎn)化株56株，pYSK-lcc9與pAde8共轉(zhuǎn)化OK7轉(zhuǎn)化株75株；獲得pBD5單轉(zhuǎn)化FA2222轉(zhuǎn)化株36株，pYSK-lcc9與pBD5共轉(zhuǎn)化FA2222轉(zhuǎn)化株64株(表1)。與單轉(zhuǎn)化比較，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化有效提升了轉(zhuǎn)化效率，分別為1.34倍/OK7和1.78倍/FA2222。經(jīng)進(jìn)一步復(fù)篩，獲得陽性O(shè)K7-lcc9共轉(zhuǎn)化株46株，陽性FA2222-lcc9共轉(zhuǎn)化株29株。

表1 單載體轉(zhuǎn)化及單載體與pYSK-lcc9共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子數(shù)目統(tǒng)計Table 1 Transformations of C. cinerea with vector alone,or using same batches of protoplasts,in combination with pYSK-lcc9 laccase gene derivatives

2.3 液態(tài)發(fā)酵、漆酶活力測定及活性電泳檢測

因目的基因隨機(jī)整合進(jìn)灰蓋鬼傘基因組，且整合入基因組的拷貝數(shù)不同，隨機(jī)挑取2株pAde8、2株pBD5轉(zhuǎn)化菌株、5株pAde8與pYSK-lcc9，以及5株pBD5與pYSK-lcc9共轉(zhuǎn)化陽性菌株進(jìn)行液態(tài)搖瓶發(fā)酵。選擇的發(fā)酵培養(yǎng)條件：在Kjalke液體培養(yǎng)基中接種5%勻漿的陽性菌株種子液于37 ℃進(jìn)行發(fā)酵。

結(jié)果顯示，所有OK7陽性轉(zhuǎn)化菌株均在第7天達(dá)到最高酶活力，共轉(zhuǎn)化陽性菌株中pAde8+pYSK-lcc9-1活力最高，為21.1 U/mL± 1.2 U/mL，pAde8+pYSK-lcc9-4活力最低，為5.1 U/mL± 0.5 U/mL。單轉(zhuǎn)化pAde8的漆酶活力最高為1.1 U/mL± 0.3 U/mL[圖3(a)]。漆酶過表達(dá)后活力提高4.6～19.2倍不等。相比較，F(xiàn)A2222的共轉(zhuǎn)化陽性菌株在第6天達(dá)到最高酶活力，在共轉(zhuǎn)化菌株中pBD5-pYSK-lcc9-4的漆酶活力最高，為12.3 U/mL± 1.1 U/mL，pBD5-pYSK-lcc9-2的漆酶活力最低，為3.7 U/mL± 0.3 U/mL，而pBD5單轉(zhuǎn)化FA2222菌株只檢測到極其微量的漆酶活力，約為5.1×10-2U/mL[圖3(b)]。漆酶過表達(dá)后活力提高72.5～241.2倍。

(a)OK7; (b)FA2222。圖3 OK7、FA2222菌株液態(tài)搖瓶發(fā)酵漆酶活力Figure 3 Laccase activity of OK7 and FA2222 strains in liquid cultures

對發(fā)酵液上清液同工酶譜檢測分析結(jié)果顯示，所有OK7-lcc9及FA2222-lcc9菌株均主要表達(dá)Lcc9(圖4)，與酶活力測定結(jié)果一致。同時，OK7-lcc9菌株少量表達(dá)漆酶Lcc5和痕量的Lcc1[10]。對照單獨轉(zhuǎn)化pAde8的菌株也有本底水平的Lcc9以及Lcc5和Lcc1的表達(dá)[圖4(a)]。相比較，同工酶譜檢測發(fā)現(xiàn)FA2222-lcc9菌株僅表達(dá)Lcc9蛋白，而pBD5單轉(zhuǎn)化菌株幾乎無漆酶蛋白表達(dá)[圖4(b)]。

(a)OK7; (b)FA2222。圖4 OK7、FA2222菌株發(fā)酵液上清液同工酶譜Figure 4 Isozyme spectrum of OK7 and FA2222 strains

2.4 OK7-lcc9和FA2222-lcc9菌株的3 L高密度發(fā)酵

選取OK7-lcc9(pAde8+pYSK-lcc9-1)和FA2222-lcc9(pBD5+pYSK-lcc9-4)菌株，在3 L發(fā)酵罐中開展漆酶的發(fā)酵制備研究。結(jié)果表明，OK7-lcc9菌株發(fā)酵液上清液最高酶活力僅為8 U/mL，低于搖瓶發(fā)酵酶活力[圖5(a)]。相同條件下，F(xiàn)A2222-lcc9的3 L發(fā)酵結(jié)果顯示，菌株在108 h時達(dá)到最高漆酶活力59 U/mL，相比普通搖瓶發(fā)酵，漆酶活力進(jìn)一步提高了4.8倍[圖5(b)]。

(a)OK7; (b)FA2222。圖5 OK-lcc9、FA2222-lcc9菌株3 L高密度發(fā)酵漆酶活力Figure 5 Laccase activity of OK-lcc9 and FA2222-lcc9 in 3 L bioreactor

對OK7-lcc9與FA2222-lcc9在發(fā)酵罐中的菌球形態(tài)進(jìn)行比較。OK7-lcc9菌球相對較松散，菌球表面呈不規(guī)則狀態(tài)，有大量菌絲凸起。相比較，F(xiàn)A2222-lcc9菌球結(jié)構(gòu)更加緊湊、密實，表面較為光滑(圖6)?；趯虮砻嫘螒B(tài)的連續(xù)觀察和監(jiān)測，推測OK7-lcc9菌球在發(fā)酵罐的劇烈攪拌條件下更易破裂，不利于漆酶合成和分泌。

圖6 OK7與FA2222菌球形態(tài)Figure 6 Photographs of pellets in the supernatant OK7 and FA2222

表2 不同方法制備C. cinerea來源漆酶的比較Table 2 Comparison of the results of different strategies for the preparation of C. cinerea laccase

3 討論

異源表達(dá)是高效制備酶蛋白的重要手段，多項研究顯示漆酶基因能夠以子囊菌為宿主進(jìn)行異源制備，獲得的最高酶活力為11.0 U/mL(以ABTS為底物)[17]。但異源表達(dá)存在菌株密碼子偏好、糖基化等問題，使得酶性質(zhì)與野生型相比差異較大[18-19]。例如，Pycnoporuscinnabarinus野生型漆酶Lcc1分子質(zhì)量為70.0 ku，而其Pichiapastoris異源表達(dá)產(chǎn)物因過度糖基化分子質(zhì)量增加至110.0 ku[20]。在另外一項研究中，雖然漆酶在Aspergillussp.中的異源表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量變化不大，但酶學(xué)性質(zhì)如pH值、Km和氧化還原電勢等明顯不同[20]。相比較，同源過表達(dá)不但能顯著提高漆酶產(chǎn)量，而且因宿主的遺傳背景相同保留原有的酶學(xué)性質(zhì)，是漆酶工業(yè)化應(yīng)用的重要技術(shù)保障。本研究利用同源過表達(dá)和高密度發(fā)酵技術(shù)制備了C.cinerea漆酶蛋白Lcc9，與C.cinerea漆酶的其他制備方法相比(表2)，大大提高了Lcc9的制備效率。

遺傳轉(zhuǎn)化是制約擔(dān)子菌遺傳學(xué)改造和工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。PEG/CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法操作簡單，已被廣泛應(yīng)用于多種擔(dān)子菌中。其中，原生質(zhì)體的制備效率和轉(zhuǎn)化參數(shù)如PEG的濃度、CaCl2濃度和pH值等是該方法成功的基礎(chǔ)。本研究中經(jīng)優(yōu)化后C.cinerea的轉(zhuǎn)化效率為250～350個轉(zhuǎn)化子/μg DNA，高于其他擔(dān)子菌的研究[21]。此外，與前人研究結(jié)果一致[22]，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化有效提升了轉(zhuǎn)化效率，分別為1.34倍/OK7和1.78倍/FA2222。共轉(zhuǎn)化較單載體轉(zhuǎn)化效率更高的可能原因是：一方面，在單載體轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)生色氨酸(pBD5)、腺嘌呤(pAde8)反饋抑制現(xiàn)象而抑制大量轉(zhuǎn)化子的生長；另一方面，目的基因通常是在多個位置異位整合進(jìn)灰蓋鬼傘基因組中的，在共轉(zhuǎn)化過程中兩個載體競爭整合，減少了反饋抑制，進(jìn)而轉(zhuǎn)化效率得以提高。

陽性菌株經(jīng)5%接種量、Kjalke培養(yǎng)基培養(yǎng)后，OK7陽性轉(zhuǎn)化子漆酶活力較野生型提高了4.6～19.2倍，F(xiàn)A2222陽性轉(zhuǎn)化子漆酶活力較野生型提高了72.5～241.2倍。因目的基因是隨機(jī)整合進(jìn)C.cinerea基因組中的，且整合進(jìn)基因組的拷貝數(shù)有差異[23]，進(jìn)而不同轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出不同的漆酶合成能力，未來可通過轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步篩選獲得高產(chǎn)漆酶的工程菌株。

FA2222-lcc9的3 L高密度發(fā)酵實驗，使得漆酶活力提高4.8倍，但OK7-lcc9經(jīng)3 L反應(yīng)器發(fā)酵，漆酶活力未見提升。通過菌體形態(tài)學(xué)觀察，推測OK7-lcc9菌球在發(fā)酵罐的劇烈攪拌條件下更易破裂，不利于漆酶合成和分泌。未來可通過形態(tài)學(xué)改造即增強(qiáng)OK7細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的柔韌度，使其適應(yīng)高密度發(fā)酵制備漆酶。