王小艷，王慶苗，周懷霞

（1.慶陽市中醫(yī)醫(yī)院 內(nèi)分泌科，甘肅 慶陽 745000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)內(nèi)科教研室，甘肅 蘭州 730000）

2 型糖尿病是臨床常見內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，90%糖尿病為該類型。隨著我國人口老齡化進(jìn)程加劇，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。糖尿病創(chuàng)傷愈合障礙是2 型糖尿病患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一，通常由微小組織創(chuàng)傷引發(fā)炎癥所導(dǎo)致。有數(shù)據(jù)顯示，約20% 2 型糖尿病患者會出現(xiàn)非治愈性糖尿病足潰瘍，嚴(yán)重情況下誘發(fā)感染、壞疽甚至截肢，給患者心理及生理健康帶來嚴(yán)重影響[2]。目前，臨床仍缺乏安全、有效、能促進(jìn)2 型糖尿病患者組織損傷修復(fù)的治療方法。因此探究安全有效的藥物促進(jìn)2 型糖尿病患者組織損傷修復(fù)是臨床亟待解決的問題之一[3]。

皮膚創(chuàng)傷主要采用自體皮膚移植、縫合及使用抗生素治療，但易造成增生性瘢痕。采用酶水解方式從蛋白質(zhì)中獲得的部分活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷愈合方面具有較高應(yīng)用價值。牡蠣是一種營養(yǎng)豐富、含有多種蛋白質(zhì)的海洋生物資源之一，具有抗氧化、抑菌等功能[4]。既往研究顯示，牡蠣酶解產(chǎn)物對皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合具有促進(jìn)作用，但具體機(jī)制尚未明確[5]。劉好[6]研究顯示，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1,SDF-1）/趨化因子受體4（chemokine receptor 4,CXCR-4）通路活化對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。目前有關(guān)牡蠣酶解產(chǎn)物對2 型糖尿病皮膚組織創(chuàng)傷愈合的作用及其機(jī)制研究少見報道，因此本研究探究其對2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)的作用，并分析其對SDF-1/CXCR-4 通路的影響，以期為臨床開發(fā)促進(jìn)2 型糖尿病組織損傷修復(fù)的藥物提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

50 只無特定病原體級4 周齡雄性小鼠，體重20～30 g，平均（25±5）g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0009，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0257。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑牡蠣肉（蘭州沃特萊斯生物科技有限公司），初元Ⅰ型產(chǎn)品（主要含小麥低聚肽、海洋魚皮膠原低聚肽），規(guī)格：100 mL/瓶，購自江西省江中藥業(yè)股份有限公司，動物蛋白酶（規(guī)格：3 萬u/g，河北省定州百克賽斯生物科技有限公司），鏈脲菌素（Streptozocin,STZ）（上海雅吉生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒（上海信帆生物科技有限公司），白細(xì)胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司），兔抗鼠SDF-1、CXCR4 及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）。

1.2.2 主要儀器Optima?XPN 超速離心機(jī)（蘇州貝克曼庫爾特生物科技有限公司），M1324R 型高速冷凍離心機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），JXDG型冷凍干燥機(jī)（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解物制備將牡蠣肉清洗、瀝干，打漿，調(diào)至pH 7.0，加1 000 u/g 動物蛋白酶，酶解5 h，沸水浴滅活10 min，冷卻，8 000 r/min 離心20 min，取上清液濃縮，濃縮后冷凍干燥備用。

1.3.2 模型復(fù)制及分組50 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食、不禁水12 h，用pH 4.8 檸檬酸緩沖液稀釋STZ 并配制成濃度為1%的溶液（避光、現(xiàn)用現(xiàn)配），將小鼠稱重后按30 mg/kg 劑量一次性腹腔注射STZ，注射結(jié)束后禁食24 h 但給予飲用5%蔗糖水溶液，隨后給予自由飲食、飲水。注射后3～7 d 抽取小鼠尾靜脈血檢測血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，即符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，可用于后續(xù)實驗。將2 型糖尿病模型小鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后背部剃毛、消毒，使用皮膚活檢針在小鼠背部剪去大小約1 cm×1 cm 的方形切口，充分分離皮膚、皮下組織及肌纖維膜組織，復(fù)制2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷模型，術(shù)后注射青鏈霉素合劑，預(yù)防傷口感染。將模型小鼠隨機(jī)分為5組，模型對照組，以及牡蠣酶解液低、中、高劑量組、陽性對照組，每組10 只。其中牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠于模型復(fù)制成功次日分別給予0.25 g/（10 g·d）、0.5 g/（10 g·d）、1.0 g/（10 g·d）牡蠣酶解液灌胃處理[5]，1 次/d，連續(xù)14 d，模型對照組同時間給予等量生理鹽水灌胃處理；陽性對照組同時間給予初元Ⅰ型產(chǎn)品0.1 mL/（10 g·d）灌胃處理。

1.3.3 創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率測定分別于術(shù)后第3 天、7 天、14 天觀察小鼠創(chuàng)面愈合情況，拍照并計算創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-當(dāng)日創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.4 創(chuàng)面組織標(biāo)本采集各組小鼠分別于術(shù)后第14 天后，以10%水合氯醛腹腔麻醉并處死，迅速提取背部創(chuàng)面組織標(biāo)本，取材大小為1.5 cm×1.5 cm，厚度＜0.5 cm。

1.3.5 HE 染色觀察創(chuàng)面組織病理變化分別取各組5 只小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片厚約6 μm，脫蠟、水化，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色，以中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化，并拍照。

1.3.6 ELISA法檢測創(chuàng)面組織炎癥因子分別取各組5 只小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本，制備組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照各ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α水平。

1.3.7 Western blotting 檢測創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白的表達(dá)分別取各組小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本，制備組織勻漿并提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗SDF-1（1∶500）、CXCR-4（1∶1 500）、內(nèi)參βactin（1∶500），次日加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影、定影，根據(jù)各蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠創(chuàng)面形態(tài)變化

各組小鼠均未出現(xiàn)感染及死亡。模型復(fù)制成功后第3天，各組小鼠創(chuàng)面均已結(jié)痂，傷口周圍出現(xiàn)紅腫，無液體滲出，傷口收縮均不明顯。模型復(fù)制成功后第7天，各組創(chuàng)面結(jié)痂變硬，創(chuàng)傷周圍表面不平整，創(chuàng)緣皮膚收縮明顯；其中，牡蠣酶解液高劑量組及陽性對照組結(jié)痂厚度優(yōu)于牡蠣酶解液低劑量組、模型對照組，局部創(chuàng)面呈暗紅色。模型復(fù)制成功后第14天，模型對照組傷口結(jié)痂有少量脫落，但瘢痕面積變化小，各給藥組傷口明顯縮小，部分明顯縮痂、脫痂；其中，牡蠣酶解液高劑量組及陽性對照組呈現(xiàn)肉紅色新生表皮，瘢痕暗紅。見圖1。

圖1 各組小鼠創(chuàng)面形態(tài)變化

2.2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率的變化

牡蠣酶解液低、中、高劑量組、陽性對照組和模型對照組小鼠術(shù)后3 d、7 d、14 d 的創(chuàng)面愈合率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點小鼠創(chuàng)面愈合率有差異（F=12.978，P=0.000）；②5 組小鼠創(chuàng)面愈合率有差異（F=16.836，P=0.000）；③5 組小鼠創(chuàng)面愈合率變化趨勢有差異（F=22.128，P=0.000）。見表1。

表1 各組小鼠不同時間點的創(chuàng)面愈合率比較（n=10，%，）

表1 各組小鼠不同時間點的創(chuàng)面愈合率比較（n=10，%，）

注：①與模型對照組比較，P ＜0.05；②與牡蠣酶解液低劑量組比較，P ＜0.05；③與牡蠣酶解液中劑量組比較，P ＜0.05。

2.3 各組小鼠創(chuàng)面組織病理變化

HE 染色結(jié)果顯示，模型對照組小鼠創(chuàng)面組織中汗腺細(xì)胞、新生血管及導(dǎo)管較少；牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織中有肉芽組織形成，毛囊、汗腺細(xì)胞和導(dǎo)管增生較多，且排列整齊。見圖2。

圖2 各組小鼠創(chuàng)面組織病理變化（HE染色×200）

2.4 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較

模型對照組、牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.518和10.827，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與模型對照組比較，牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織IL-6、TNF-α 降低（P＜0.05）；牡蠣酶解液低劑量組IL-6、TNF-α 高于中、高劑量組（P＜0.05），且牡蠣酶解液中劑量組IL-6、TNF-α 高于高劑量組（P＜0.05），呈劑量依賴性；牡蠣酶解液高劑量組與陽性對照組IL-6、TNF-α 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較（n=5，）

表2 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較（n=5，）

注：①與模型對照組比較，P ＜0.05；②與牡蠣酶解液低劑量組比較，P ＜0.05；③與牡蠣酶解液中劑量組比較，P ＜0.05。

2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4 通路蛋白相對表達(dá)量比較

模型對照組、牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.863 和78.137，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與模型對照組比較，牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；牡蠣酶解液低劑量組SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量低于中、高劑量組（P＜0.05），且牡蠣酶解液中劑量組SDF-1、CXCR-4蛋白相對表達(dá)量低于高劑量組（P＜0.05），呈劑量依賴性；高劑量組與陽性對照組SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3 和圖3。

表3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=5，）

表3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=5，）

注：①與模型對照組比較，P ＜0.05；②與牡蠣酶解液低劑量組比較，P ＜0.05；③與牡蠣酶解液中劑量組比較，P ＜0.05。

圖3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白的表達(dá)

3 討論

2 型糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝失常引起的系統(tǒng)性慢性疾病，可引起全身多個系統(tǒng)損害，其中糖尿病足潰瘍及傷口愈合困難是糖尿病最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。有研究表明，由于機(jī)體微循環(huán)障礙、抗感染能力降低、組織修復(fù)能力減弱等常導(dǎo)致糖尿病患者傷口出現(xiàn)潰瘍、感染、壞疽等，嚴(yán)重情況下導(dǎo)致截肢甚至死亡[7-9]。因此探尋能有效促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合的治療手段具有重要臨床意義。創(chuàng)傷愈合是一個動態(tài)修復(fù)過程，包含急性炎癥期、細(xì)胞增殖期、組織重塑期3 個階段，而2 型糖尿病對上述各階段均可產(chǎn)生破壞效應(yīng)，從而導(dǎo)致組織創(chuàng)傷修復(fù)能力受損及組織愈合障礙等[10-11]。傳統(tǒng)創(chuàng)傷愈合活性物質(zhì)如生長因子、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)因子等都難以轉(zhuǎn)化于臨床促愈合治療中[12]。近年來，生物活性肽的研究引起研究人員的青睞。有研究表明，其具有活性高、特異性和穩(wěn)定性強(qiáng)的特點，部分活性肽如牡蠣酶解活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷中具有較高的應(yīng)用潛能[13]。楊發(fā)明等[5]研究顯示，牡蠣酶解產(chǎn)物能夠促進(jìn)小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合，但具體機(jī)制尚未明確。

本研究復(fù)制2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷小鼠模型，結(jié)果顯示，與模型對照組比較，牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面愈合率升高，呈劑量依賴性。說明牡蠣酶解液可能促進(jìn)2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合。皮膚受傷后，組織中M2 型巨噬細(xì)胞會立即觸發(fā)局部炎癥反應(yīng)，減慢組織愈合過程。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α 水平降低，呈劑量依賴性，說明牡蠣酶解液可能減輕2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷小鼠創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合修復(fù)。

SDF-1/CXCR-4 通路是一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，SDF-1 與其受體CXCR-4 相互結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞中炎癥因子如IL-6、TNF-α 等合成及分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[14-15]。劉好[6]研究顯示，抑制CXCR-4 表達(dá)可促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。李東峻[16]研究顯示，抑制SDF-1/CXCR-4 軸活化對銀屑病皮損修復(fù)有一定促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量降低，呈劑量依賴性。說明牡蠣酶解液可能通過抑制SDF-1/CXCR-4 通路活化來抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)。

綜上所述，牡蠣酶解液可促進(jìn)2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)，其可能是通過抑制SDF-1/CXCR-4 通路活化進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的。然而本研究并未能闡明牡蠣酶解液對SDF-1/CXCR-4 通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)、將進(jìn)行深入闡述。