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        牡蠣酶解液對2型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)的作用及其機(jī)制研究*

        2022-12-17 08:07:56王小艷王慶苗周懷霞
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量糖尿病

        王小艷,王慶苗,周懷霞

        (1.慶陽市中醫(yī)醫(yī)院 內(nèi)分泌科,甘肅 慶陽 745000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)內(nèi)科教研室,甘肅 蘭州 730000)

        2 型糖尿病是臨床常見內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,90%糖尿病為該類型。隨著我國人口老齡化進(jìn)程加劇,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。糖尿病創(chuàng)傷愈合障礙是2 型糖尿病患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一,通常由微小組織創(chuàng)傷引發(fā)炎癥所導(dǎo)致。有數(shù)據(jù)顯示,約20% 2 型糖尿病患者會出現(xiàn)非治愈性糖尿病足潰瘍,嚴(yán)重情況下誘發(fā)感染、壞疽甚至截肢,給患者心理及生理健康帶來嚴(yán)重影響[2]。目前,臨床仍缺乏安全、有效、能促進(jìn)2 型糖尿病患者組織損傷修復(fù)的治療方法。因此探究安全有效的藥物促進(jìn)2 型糖尿病患者組織損傷修復(fù)是臨床亟待解決的問題之一[3]。

        皮膚創(chuàng)傷主要采用自體皮膚移植、縫合及使用抗生素治療,但易造成增生性瘢痕。采用酶水解方式從蛋白質(zhì)中獲得的部分活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷愈合方面具有較高應(yīng)用價值。牡蠣是一種營養(yǎng)豐富、含有多種蛋白質(zhì)的海洋生物資源之一,具有抗氧化、抑菌等功能[4]。既往研究顯示,牡蠣酶解產(chǎn)物對皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合具有促進(jìn)作用,但具體機(jī)制尚未明確[5]。劉好[6]研究顯示,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)/趨化因子受體4(chemokine receptor 4,CXCR-4)通路活化對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。目前有關(guān)牡蠣酶解產(chǎn)物對2 型糖尿病皮膚組織創(chuàng)傷愈合的作用及其機(jī)制研究少見報道,因此本研究探究其對2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)的作用,并分析其對SDF-1/CXCR-4 通路的影響,以期為臨床開發(fā)促進(jìn)2 型糖尿病組織損傷修復(fù)的藥物提供一定理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動物來源

        50 只無特定病原體級4 周齡雄性小鼠,體重20~30 g,平均(25±5)g,購自北京唯尚立德生物科技有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0009,實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2021-0257。

        1.2 主要試劑與儀器

        1.2.1 主要試劑牡蠣肉(蘭州沃特萊斯生物科技有限公司),初元Ⅰ型產(chǎn)品(主要含小麥低聚肽、海洋魚皮膠原低聚肽),規(guī)格:100 mL/瓶,購自江西省江中藥業(yè)股份有限公司,動物蛋白酶(規(guī)格:3 萬u/g,河北省定州百克賽斯生物科技有限公司),鏈脲菌素(Streptozocin,STZ)(上海雅吉生物科技有限公司),蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(上海信帆生物科技有限公司),白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司),兔抗鼠SDF-1、CXCR4 及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

        1.2.2 主要儀器Optima?XPN 超速離心機(jī)(蘇州貝克曼庫爾特生物科技有限公司),M1324R 型高速冷凍離心機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),JXDG型冷凍干燥機(jī)(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 牡蠣酶解物制備將牡蠣肉清洗、瀝干,打漿,調(diào)至pH 7.0,加1 000 u/g 動物蛋白酶,酶解5 h,沸水浴滅活10 min,冷卻,8 000 r/min 離心20 min,取上清液濃縮,濃縮后冷凍干燥備用。

        1.3.2 模型復(fù)制及分組50 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,禁食、不禁水12 h,用pH 4.8 檸檬酸緩沖液稀釋STZ 并配制成濃度為1%的溶液(避光、現(xiàn)用現(xiàn)配),將小鼠稱重后按30 mg/kg 劑量一次性腹腔注射STZ,注射結(jié)束后禁食24 h 但給予飲用5%蔗糖水溶液,隨后給予自由飲食、飲水。注射后3~7 d 抽取小鼠尾靜脈血檢測血糖,隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L,即符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),可用于后續(xù)實驗。將2 型糖尿病模型小鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后背部剃毛、消毒,使用皮膚活檢針在小鼠背部剪去大小約1 cm×1 cm 的方形切口,充分分離皮膚、皮下組織及肌纖維膜組織,復(fù)制2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷模型,術(shù)后注射青鏈霉素合劑,預(yù)防傷口感染。將模型小鼠隨機(jī)分為5組,模型對照組,以及牡蠣酶解液低、中、高劑量組、陽性對照組,每組10 只。其中牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠于模型復(fù)制成功次日分別給予0.25 g/(10 g·d)、0.5 g/(10 g·d)、1.0 g/(10 g·d)牡蠣酶解液灌胃處理[5],1 次/d,連續(xù)14 d,模型對照組同時間給予等量生理鹽水灌胃處理;陽性對照組同時間給予初元Ⅰ型產(chǎn)品0.1 mL/(10 g·d)灌胃處理。

        1.3.3 創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率測定分別于術(shù)后第3 天、7 天、14 天觀察小鼠創(chuàng)面愈合情況,拍照并計算創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-當(dāng)日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

        1.3.4 創(chuàng)面組織標(biāo)本采集各組小鼠分別于術(shù)后第14 天后,以10%水合氯醛腹腔麻醉并處死,迅速提取背部創(chuàng)面組織標(biāo)本,取材大小為1.5 cm×1.5 cm,厚度<0.5 cm。

        1.3.5 HE 染色觀察創(chuàng)面組織病理變化分別取各組5 只小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定,乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜,連續(xù)切片厚約6 μm,脫蠟、水化,進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,以中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化,并拍照。

        1.3.6 ELISA法檢測創(chuàng)面組織炎癥因子分別取各組5 只小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本,制備組織勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清液,嚴(yán)格按照各ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α水平。

        1.3.7 Western blotting 檢測創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白的表達(dá)分別取各組小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本,制備組織勻漿并提取總蛋白并檢測濃度及純度,電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入一抗SDF-1(1∶500)、CXCR-4(1∶1 500)、內(nèi)參βactin(1∶500),次日加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,顯色、顯影、定影,根據(jù)各蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達(dá)量。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組小鼠創(chuàng)面形態(tài)變化

        各組小鼠均未出現(xiàn)感染及死亡。模型復(fù)制成功后第3天,各組小鼠創(chuàng)面均已結(jié)痂,傷口周圍出現(xiàn)紅腫,無液體滲出,傷口收縮均不明顯。模型復(fù)制成功后第7天,各組創(chuàng)面結(jié)痂變硬,創(chuàng)傷周圍表面不平整,創(chuàng)緣皮膚收縮明顯;其中,牡蠣酶解液高劑量組及陽性對照組結(jié)痂厚度優(yōu)于牡蠣酶解液低劑量組、模型對照組,局部創(chuàng)面呈暗紅色。模型復(fù)制成功后第14天,模型對照組傷口結(jié)痂有少量脫落,但瘢痕面積變化小,各給藥組傷口明顯縮小,部分明顯縮痂、脫痂;其中,牡蠣酶解液高劑量組及陽性對照組呈現(xiàn)肉紅色新生表皮,瘢痕暗紅。見圖1。

        圖1 各組小鼠創(chuàng)面形態(tài)變化

        2.2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率的變化

        牡蠣酶解液低、中、高劑量組、陽性對照組和模型對照組小鼠術(shù)后3 d、7 d、14 d 的創(chuàng)面愈合率比較,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點小鼠創(chuàng)面愈合率有差異(F=12.978,P=0.000);②5 組小鼠創(chuàng)面愈合率有差異(F=16.836,P=0.000);③5 組小鼠創(chuàng)面愈合率變化趨勢有差異(F=22.128,P=0.000)。見表1。

        表1 各組小鼠不同時間點的創(chuàng)面愈合率比較(n=10,%,)

        表1 各組小鼠不同時間點的創(chuàng)面愈合率比較(n=10,%,)

        注:①與模型對照組比較,P <0.05;②與牡蠣酶解液低劑量組比較,P <0.05;③與牡蠣酶解液中劑量組比較,P <0.05。

        2.3 各組小鼠創(chuàng)面組織病理變化

        HE 染色結(jié)果顯示,模型對照組小鼠創(chuàng)面組織中汗腺細(xì)胞、新生血管及導(dǎo)管較少;牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織中有肉芽組織形成,毛囊、汗腺細(xì)胞和導(dǎo)管增生較多,且排列整齊。見圖2。

        圖2 各組小鼠創(chuàng)面組織病理變化(HE染色×200)

        2.4 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較

        模型對照組、牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.518和10.827,均P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織IL-6、TNF-α 降低(P<0.05);牡蠣酶解液低劑量組IL-6、TNF-α 高于中、高劑量組(P<0.05),且牡蠣酶解液中劑量組IL-6、TNF-α 高于高劑量組(P<0.05),呈劑量依賴性;牡蠣酶解液高劑量組與陽性對照組IL-6、TNF-α 水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        表2 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較(n=5,)

        表2 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較(n=5,)

        注:①與模型對照組比較,P <0.05;②與牡蠣酶解液低劑量組比較,P <0.05;③與牡蠣酶解液中劑量組比較,P <0.05。

        2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4 通路蛋白相對表達(dá)量比較

        模型對照組、牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.863 和78.137,均P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05);牡蠣酶解液低劑量組SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量低于中、高劑量組(P<0.05),且牡蠣酶解液中劑量組SDF-1、CXCR-4蛋白相對表達(dá)量低于高劑量組(P<0.05),呈劑量依賴性;高劑量組與陽性對照組SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3 和圖3。

        表3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白相對表達(dá)量比較(n=5,)

        表3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白相對表達(dá)量比較(n=5,)

        注:①與模型對照組比較,P <0.05;②與牡蠣酶解液低劑量組比較,P <0.05;③與牡蠣酶解液中劑量組比較,P <0.05。

        圖3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白的表達(dá)

        3 討論

        2 型糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝失常引起的系統(tǒng)性慢性疾病,可引起全身多個系統(tǒng)損害,其中糖尿病足潰瘍及傷口愈合困難是糖尿病最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。有研究表明,由于機(jī)體微循環(huán)障礙、抗感染能力降低、組織修復(fù)能力減弱等常導(dǎo)致糖尿病患者傷口出現(xiàn)潰瘍、感染、壞疽等,嚴(yán)重情況下導(dǎo)致截肢甚至死亡[7-9]。因此探尋能有效促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合的治療手段具有重要臨床意義。創(chuàng)傷愈合是一個動態(tài)修復(fù)過程,包含急性炎癥期、細(xì)胞增殖期、組織重塑期3 個階段,而2 型糖尿病對上述各階段均可產(chǎn)生破壞效應(yīng),從而導(dǎo)致組織創(chuàng)傷修復(fù)能力受損及組織愈合障礙等[10-11]。傳統(tǒng)創(chuàng)傷愈合活性物質(zhì)如生長因子、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)因子等都難以轉(zhuǎn)化于臨床促愈合治療中[12]。近年來,生物活性肽的研究引起研究人員的青睞。有研究表明,其具有活性高、特異性和穩(wěn)定性強(qiáng)的特點,部分活性肽如牡蠣酶解活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷中具有較高的應(yīng)用潛能[13]。楊發(fā)明等[5]研究顯示,牡蠣酶解產(chǎn)物能夠促進(jìn)小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合,但具體機(jī)制尚未明確。

        本研究復(fù)制2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷小鼠模型,結(jié)果顯示,與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面愈合率升高,呈劑量依賴性。說明牡蠣酶解液可能促進(jìn)2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合。皮膚受傷后,組織中M2 型巨噬細(xì)胞會立即觸發(fā)局部炎癥反應(yīng),減慢組織愈合過程。本研究結(jié)果顯示,與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α 水平降低,呈劑量依賴性,說明牡蠣酶解液可能減輕2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷小鼠創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng),促進(jìn)創(chuàng)傷愈合修復(fù)。

        SDF-1/CXCR-4 通路是一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,SDF-1 與其受體CXCR-4 相互結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞中炎癥因子如IL-6、TNF-α 等合成及分泌,促進(jìn)炎癥反應(yīng)[14-15]。劉好[6]研究顯示,抑制CXCR-4 表達(dá)可促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。李東峻[16]研究顯示,抑制SDF-1/CXCR-4 軸活化對銀屑病皮損修復(fù)有一定促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示,與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達(dá)量降低,呈劑量依賴性。說明牡蠣酶解液可能通過抑制SDF-1/CXCR-4 通路活化來抑制炎癥反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)。

        綜上所述,牡蠣酶解液可促進(jìn)2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù),其可能是通過抑制SDF-1/CXCR-4 通路活化進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的。然而本研究并未能闡明牡蠣酶解液對SDF-1/CXCR-4 通路的具體調(diào)控作用,后期應(yīng)、將進(jìn)行深入闡述。

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