沈 琳, 周 利, 張亞利

(1. 上海上園苗木有限公司, 上海 200083; 2. 南山植物園, 重慶 400060; 3. 上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所, 上海 201403)

近年來，山茶屬(CamelliaLinn.)連蕊茶組(Sect.TheopsisCohen-Stuart)植物因其花小而密等觀賞特征受到研究者及應(yīng)用者的關(guān)注與喜愛[1,2]。作者在野外調(diào)查中觀測到重慶縉云山作孚連蕊茶(CamelliatsofuiS. S. Chien)的花梗及萼片總長以及花蕾和花瓣顏色等形態(tài)特征與原始文獻[3]描述存在差異，這些差異在作孚連蕊茶作為景觀應(yīng)用和育種材料開發(fā)中具有重要價值。

Super-GBS技術(shù)是基于GBS進一步發(fā)展出的簡化基因組測序技術(shù)，因其能夠獲得更多、更準確的SNP/Indel等優(yōu)勢，目前已逐步運用到分子標記開發(fā)和進化分析等研究中[4]。近年來，作者先后開展山茶屬連蕊茶組和毛蕊茶組(Sect.EriandriaCohen-Stuart)不同物種、同一物種不同居群以及同一物種同一居群不同單株樣本的Super-GBS測序與分析，其中，兩兩樣本間的相似度比較在進行分類鑒定及進化分析方面具有一定的參考意義。

本研究對作孚連蕊茶在原生境及遷地栽培環(huán)境中的形態(tài)特征進行觀測和比較，探索Super-GBS技術(shù)在開展形態(tài)特征存在差異材料相似度比較中的應(yīng)用，以期為作孚連蕊茶的景觀應(yīng)用和種質(zhì)創(chuàng)新等提供支撐，同時也為其今后的分類地位探討提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

供試作孚連蕊茶野生居群主要分布于重慶縉云山(東經(jīng)106°23′、北緯29°49′)海拔約800 m的常綠闊葉林、針闊混交林和毛竹〔Phyllostachysedulis(Carriere) J. Houzeau〕林內(nèi)；遷地栽培材料種植于浙江金華的國際山茶物種園內(nèi)的連蕊茶組和毛蕊茶組資源種質(zhì)區(qū)。通過采集標本、形態(tài)特征記錄和拍照，比對作孚連蕊茶原始文獻[3]描述及林祁等[5]指定的后選模式標本的形態(tài)特征，鑒定為作孚連蕊茶。憑證標本保存于上海辰山植物標本館(CSH)。

Super-GBS測序與分析選取3個花部形態(tài)特征存在差異的作孚連蕊茶單株。其中，O-1單株(憑證標本號CSH0187825)采自縉云山，其花梗及萼片總長8～10 mm，花近白色，花柱極淺3裂，裂片長約1 mm；O-2單株(憑證標本號CSH0187824)采自縉云山，其花梗及萼片總長6～8 mm，花瓣白色或外輪花瓣被紫紅色，花柱淺3裂，裂片長約3 mm；E-1單株(憑證標本號CSH0187846)采自國際山茶物種園，其花梗及萼片總長10～12 mm，花瓣被紫紅色，花柱極淺3裂，裂片長約1 mm。

1.2 方法

1.2.1 植物形態(tài)特征觀測 結(jié)合原始文獻的形態(tài)特征描述，對生活型、枝干被毛情況、葉片長、葉片寬、花蕾著生方式、花蕾顏色、花梗及萼片總長、花瓣顏色、雄蕊被毛情況、花柱裂片長度、果實性狀、果實大小、種子大小等數(shù)量和質(zhì)量性狀進行觀測，數(shù)量性狀隨機選取15個樣本進行數(shù)據(jù)收集。

1.2.2 Super-GBS測序與分析 于春季采集幼嫩葉片，用錫箔紙包好后迅速放入液氮中，帶回實驗室后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，文庫構(gòu)建及測序由青島歐易生物科技有限公司完成。采用植物基因組DNA試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取DNA，樣品DNA抽提質(zhì)檢合格后，運用Super-GBS技術(shù)構(gòu)建測序文庫[4]。測序結(jié)果采用Super-GBS的信息分析流程進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、數(shù)據(jù)比對和基因分型[6-10]。本研究中的3份單株樣本與72份連蕊茶組和毛蕊茶組的樣本一起開展測序與分析。在整體分析SNP位點的基礎(chǔ)上，對O-1、O-2和E-1 3個樣本進行相似度〔相似度=(兩兩分型一致且不缺失/兩兩有分型且不缺失)×100%〕比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 野外觀測與原始文獻描述的比較

整體而言，在原生境和遷地栽培環(huán)境，作孚連蕊茶的葉披針形或長圓形及游離花絲被毛等主要識別特征與原始文獻描述基本一致，但其生活型和花部特征等性狀存在差異。原始文獻描述中生活型為灌木，而在原生境中存在灌木和小喬木(圖1-A)2種生活型；原始文獻描述中花1～2朵頂生，白色或初花時外部花瓣略被紫紅色，而在原生境和遷地栽培環(huán)境中均為頂生和腋生，花蕾白色或紫紅色(圖1-B)；原始文獻描述中花梗長5～6 mm，萼片長2 mm，而在原生境和遷地栽培環(huán)境中花梗及萼片總長6～12 mm，且在遷地栽培環(huán)境中花瓣存在全部被紫紅色的特征(圖1-D1,D2,D3)；原始文獻描述中游離花絲疏被毛，柱頭3裂，裂片長1 mm，而在原生境和遷地栽培環(huán)境中游離花絲疏被毛或近無毛，柱頭3裂，裂片長不足1 mm，或1～3 mm(圖1-D1)。

原始文獻描述對作孚連蕊茶幼葉顏色、果實及種子等性狀未做說明。原生境和遷地栽培環(huán)境中作孚連蕊茶幼葉綠色或紫紅色；蒴果近球形(圖1-C)，橫徑5～13 mm，1室，種子1粒；種子近球形，深褐色；盛花期為3月至4月，為連蕊茶組中花期較晚的資源。

A. 小喬木Small tree. B. 花蕾Flower bud. C. 果實Fruit. D1,D2,D3. 花Flower: D1. 花瓣白色White petals; D2. 外輪花瓣被紫紅色Outer petals with purplish red; D3. 花瓣被紫紅色Petals with purplish red.

2.2 SNP位點相似度的比較

基于Super-GBS技術(shù)的SNP位點相似度的比較結(jié)果表明：供試3個樣本共篩選出兩兩有分型且不缺失的SNP位點163 371個，3個樣本共有SNP位點147 436個，其中，O-1和O-2兩兩分型一致且不缺失的位點4 942個，共有位點152 378個，相似度為93.27%；E-1和O-1兩兩分型一致且不缺失的位點4 747個，共有位點152 183個，相似度為93.15%；E-1和O-2兩兩分型一致且不缺失的位點4 828個，共有位點152 264個，相似度為93.20%；E-1、O-1和O-2特異的位點分別為6 360、6 246和6 165個。

3 討論和結(jié)論

與原始文獻描述相比，作孚連蕊茶在原生境及遷地栽培環(huán)境的形態(tài)特征差異主要體現(xiàn)在生活型、花蕾著生方式和花瓣顏色等性狀，作孚連蕊茶的主要觀賞特征及典型識別特征可以概括為：灌木或小喬木；葉披針形或長圓形，葉長3.0～5.5 cm，寬1.2～1.7 cm；花頂生和腋生，花蕾白色或紫紅色；花梗及萼片總長6～12 mm，苞片散生于花梗；花瓣白色，或外輪花瓣被紫紅色，或全部花瓣紫被紅色；游離花絲多疏被毛；子房及花柱無毛；盛花期3月至4月，為連蕊茶組中花期較晚的種類。作孚連蕊茶在生活型、葉及花等性狀上的特點，可使其成為園林景觀、種質(zhì)創(chuàng)新的優(yōu)秀資源，在后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用中，可關(guān)注花蕾和花紫紅色等形態(tài)特征。SNP位點相似度分析結(jié)果顯示：供試3個樣本兩兩之間的相似度均在93%以上，結(jié)合作者對Super-GBS測序與分析中同一物種不同單株樣本相似度比較的結(jié)果，初步判斷3個單株為作孚連蕊茶的種內(nèi)變異。

本研究沿用Sealy[11]和張宏達[12]將作孚連蕊茶作為獨立物種的觀點，但閔天祿[13]將作孚連蕊茶作為毛蕊柃葉連蕊茶〔Camelliaeuryoidesvar.nokoensis(Hayata) Ming〕的異名，呂林玲[14]將其處理為Camelliasynapticavar.parviovata(Chang) Ming 的異名，可見該物種的分類地位仍需進一步研究。

致謝：感謝上海辰山植物園杜誠高級工程師和葛斌杰高級工程師在臘葉標本及原始文獻方面給予的幫助和支持！