馮嬌，劉楠楠

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍心血管病研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

心力衰竭嚴(yán)重影響并危害居民健康，其診療工作仍是亟待解決的問(wèn)題[1]。心力衰竭的臨床前期研究仍然嚴(yán)重依賴(lài)于小鼠心力衰竭模型，實(shí)驗(yàn)性復(fù)制心力衰竭的動(dòng)物模型有助于我們理解疾病所涉及的細(xì)胞和分子機(jī)制，在心力衰竭開(kāi)發(fā)新的預(yù)防和治療方法上發(fā)揮著重要作用[2]。心衰模型以不良的心臟重構(gòu)過(guò)程為特征[3]，應(yīng)用最廣泛的是Rockman等人[4]描述的橫向主動(dòng)脈弓縮窄(TAC)模型。該模型在某種程度上模擬人類(lèi)的高血壓狀態(tài)，出現(xiàn)左心室肥大及收縮或舒張功能不全，長(zhǎng)期進(jìn)展為心力衰竭[5]。心臟結(jié)構(gòu)和功能的評(píng)估是驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒εc否的關(guān)鍵之一，自從引入小鼠超聲心動(dòng)圖以來(lái)，大多數(shù)TAC模型的研究報(bào)告使用超聲心動(dòng)圖記錄心臟尺寸和功能[6]。

超聲心動(dòng)圖可在鎮(zhèn)靜的動(dòng)物身上快速進(jìn)行[7]，為活體心功能評(píng)估提供了獨(dú)特的手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)各種心臟模型、心臟結(jié)構(gòu)與功能改變有重要應(yīng)用價(jià)值[8]。二維B型顯像用于檢測(cè)心臟的異常運(yùn)動(dòng)或結(jié)構(gòu)改變，一維M型顯像用于量化心臟的大小和收縮力[9]。由于超聲成像技術(shù)的進(jìn)步，超聲系統(tǒng)已經(jīng)具備了獲得精確可靠的小鼠心臟圖像的能力，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)高頻超聲心動(dòng)圖測(cè)量左心腔大小、左室壁厚度及收縮功能，并結(jié)合其他輔助檢查對(duì)小鼠主動(dòng)脈弓縮窄所引發(fā)的心衰模型做出綜合評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠20只，8周齡，21～24克/只，訂購(gòu)于沈陽(yáng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院科研基地[SCXK(遼)2020-0001]，適應(yīng)性喂養(yǎng)于全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(遼)2020-0005]，1 w內(nèi)自由活動(dòng)與飲食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-1008)。

1.2 制作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

20只小鼠隨機(jī)分為兩組，假手術(shù)組(SHAM)6只，手術(shù)組(TAC)14只，手術(shù)前禁喂食物，隨意飲水，進(jìn)行主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)。如之前發(fā)表的文獻(xiàn)[10-11]，TAC組創(chuàng)建主動(dòng)脈弓縮窄模型，使用腹腔注射進(jìn)行麻醉，將甲苯噻嗪(10 mg/kg)、氯胺酮(100 mg/kg)混于生理鹽水，完全麻醉小鼠后，將其固定在小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行脫毛，使用碘伏進(jìn)行消毒，在臺(tái)式手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天 XTS-4A)下操作，切開(kāi)胸部皮膚，暴露胸骨，沿小鼠前正中線(xiàn)自胸骨上窩至胸骨角下剪開(kāi)胸骨，通過(guò)開(kāi)胸器撐開(kāi)暴露胸腺。沿左右脂肪墊連接處撥開(kāi)，暴露出主動(dòng)脈胸段。游離主動(dòng)脈弓，于下方穿入7-0絲線(xiàn)，將27G針頭與主動(dòng)脈弓平行放置，共同結(jié)扎。結(jié)扎后抽出細(xì)針觀察小鼠情況，對(duì)比右側(cè)無(wú)名動(dòng)脈與左側(cè)頸總動(dòng)脈充血情況，然后用5-0絲線(xiàn)連續(xù)縫合胸骨與皮膚，涂抹適量消炎藥。SHAM組開(kāi)胸分離主動(dòng)脈弓后用7-0絲線(xiàn)纏繞但不進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后將小鼠放在保溫墊上保溫，蘇醒后根據(jù)活動(dòng)情況放回飼養(yǎng)籠內(nèi)進(jìn)行日常飼養(yǎng)。對(duì)兩組小鼠進(jìn)行生存分析，術(shù)后至模型建立后6 w內(nèi)，每天檢查籠內(nèi)是否有動(dòng)物死亡。

1.3 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖

從頸部到胸部劍突水平去除毛發(fā)以?xún)?yōu)化聲學(xué)界面，用異氟醚麻醉小鼠(2%用于誘導(dǎo)，1.5%用于維持)，體溫保持在36 ℃～37 ℃，在整個(gè)成像過(guò)程中監(jiān)測(cè)心率和呼吸。使用高頻超聲探頭進(jìn)行經(jīng)胸超聲檢查。術(shù)前1 d、術(shù)后1 w、術(shù)后6 w使用小動(dòng)物超聲儀和30 MHz線(xiàn)性陣列換能器(Vevo 2100 Imaging System，Serial Number：2100-0335)觀察小鼠主動(dòng)脈弓處血流情況，多個(gè)視圖完成二維長(zhǎng)軸、連續(xù)短軸視圖和四腔心多普勒超聲檢查。避免在圖像采集過(guò)程中胸部受到任何壓縮和探頭無(wú)傾向性?xún)A斜，多普勒波束與流向截角控制在60°以?xún)?nèi)。采集反應(yīng)心室結(jié)構(gòu)的參數(shù)：左室舒張末期后壁厚度(LVPWd)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期容積(LVEDV)，左心室收縮末期容積(LVESV)，計(jì)算出反應(yīng)左心室收縮功能的指標(biāo)：射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。

1.4 病理組織學(xué)分析

術(shù)后6 w超聲檢查后24 h，小鼠按照手術(shù)方法麻醉，頸椎脫臼進(jìn)行安樂(lè)死，切除心臟并進(jìn)行器官稱(chēng)重，計(jì)算心體比值(HW/BW)，取對(duì)照組3只、手術(shù)組6只，心臟組織進(jìn)行切片，固定、脫水處理后，石蠟包埋，自然冷卻后，病理切片機(jī)切成4 μm厚的病理切片，用蘇木精和伊紅染色，并在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)分析。HE染色觀察心肌細(xì)胞。通過(guò)馬松染色對(duì)纖維化的情況進(jìn)行觀察，細(xì)胞核、纖維素、肌纖維顯像為黑色，而膠原纖維顯像成藍(lán)色。使用Media Cybernetics的Image-Pro Plus 2D軟件對(duì)圖像膠原含量進(jìn)行分析。

1.5 Western Blot檢測(cè)蛋白質(zhì)水平

另取對(duì)照組小鼠3只、手術(shù)組小鼠6只，整個(gè)心臟組織進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè)，心臟研磨后加入組織裂解緩沖液中，于4 ℃、12 000×g離心15 min，使用BCA protein 測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。在10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離等量的蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到硝NC膜，再將NC膜用5%的脫脂牛奶密封2 h，然后在4 ℃下與ANP抗體(abcam，ab180649)孵育，隔夜后PBST沖洗，用對(duì)應(yīng)的二級(jí)抗體(1∶1000)在室溫下孵育90 min，PBST洗膜后用ECL發(fā)光液顯影。密度分析使用ImageJ圖像軟件。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，各組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠存活率

術(shù)后至術(shù)后6 w每天記錄小鼠生存情況。手術(shù)組14只小鼠，2只在術(shù)后1 d死亡，假手術(shù)組小鼠無(wú)死亡，手術(shù)組小鼠存活率為85.7%。

2.2 高頻超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)與功能變化

小鼠各超聲數(shù)值之間均存在交互效應(yīng)，提示兩組小鼠隨著實(shí)驗(yàn)周數(shù)的延長(zhǎng)，心臟結(jié)構(gòu)與收縮功能變化情況不同；成對(duì)比較結(jié)果提示對(duì)照組小鼠各超聲指標(biāo)未隨時(shí)間變化產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而手術(shù)組小鼠術(shù)后6 w與術(shù)前1 d、術(shù)后1 w時(shí)各超聲指標(biāo)比較有顯著差異性；與對(duì)照組小鼠相比，術(shù)前1 d，兩組小鼠各超聲指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1；術(shù)后1 w時(shí)，TAC組小鼠左心室后壁厚度增加，左室大小及容積未見(jiàn)明顯變化，左室短軸縮短率無(wú)明顯變化，見(jiàn)表2；術(shù)后6 w時(shí)，TAC組小鼠左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑和容積增加，左室射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率減少，左室后壁厚度變薄，但尚未產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表3。兩組小鼠不同時(shí)間段有代表性的M型超聲，見(jiàn)圖1。

表1 術(shù)前1 d小鼠左室形態(tài)結(jié)構(gòu)與收縮功能參數(shù)

表2 術(shù)后1 w小鼠左室形態(tài)結(jié)構(gòu)與收縮功能參數(shù)

表3 術(shù)后6 w小鼠左室形態(tài)結(jié)構(gòu)與收縮功能參數(shù)

圖1 有代表性的M型超聲心動(dòng)圖

2.3 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

術(shù)后6 w測(cè)量心肌組織中心肌肥大相關(guān)蛋白ANP水平，TAC組較SHAM組表達(dá)水平增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

圖2 兩組小鼠心肌組織ANP蛋白表達(dá)水平

2.4 形態(tài)學(xué)及病理組織學(xué)改變

6 w時(shí)兩組小鼠之間體重(BW)沒(méi)有差異性，但是手術(shù)組小鼠心臟重量(HW)及心體比值(HW/BW)較對(duì)照組增加，見(jiàn)表4。HE染色顯示，與對(duì)照組心肌細(xì)胞大小均勻、形態(tài)完整相比，手術(shù)組小鼠心肌細(xì)胞肥大，胞漿染色加深，并可見(jiàn)心肌細(xì)胞壞死。Masson染色顯示，對(duì)照組心肌纖維排布整齊，手術(shù)組心肌纖維排布紊亂，并見(jiàn)大量間質(zhì)膠原纖維，表明心肌細(xì)胞纖維化明顯，見(jiàn)圖3。

表4 兩組小鼠術(shù)后6 w時(shí)心臟、體重、心體比值

A：術(shù)后6 w兩組小鼠心肌HE染色；B：術(shù)后6 w兩組小鼠心肌Masson染色圖3 小鼠心肌組織病理學(xué)圖像

3 討 論

本研究通過(guò)外科方法建立主動(dòng)脈弓縮窄模型，綜合應(yīng)用高頻超聲心動(dòng)圖及多種病理學(xué)方法，展示了小鼠TAC模型的病理發(fā)展進(jìn)程，其表現(xiàn)為代償性心肌肥厚到失代償擴(kuò)張型收縮期心衰的階段特征，為日后小鼠主動(dòng)脈弓縮窄模型的使用提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。術(shù)后1 w時(shí)小鼠出現(xiàn)心肌厚度增加但未出現(xiàn)心室擴(kuò)張及收縮功能障礙，術(shù)后6 w時(shí)小鼠有顯著的收縮功能減低，心肌組織肥大、壞死，纖維化明顯，ANP蛋白表達(dá)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TAC模型建模后成功率高、心功能減低理想，是一種良好的由后負(fù)荷增加導(dǎo)致的心衰模型。

實(shí)驗(yàn)中主動(dòng)脈縮窄術(shù)后1 d有2只小鼠死亡，尸解后見(jiàn)肺充血，死亡原因可能為急性左心衰，其余小鼠至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未發(fā)生死亡，證明該模型穩(wěn)定性良好，可廣泛應(yīng)用于壓力負(fù)荷性心衰疾病過(guò)程中的研究。

術(shù)后1 w時(shí)，小鼠的心腔大小、體重及容積未發(fā)生明顯變化，但已經(jīng)出現(xiàn)左室壁心肌增厚，提示此階段心臟表現(xiàn)為因后負(fù)荷增加所致的代償性心肌肥厚。同時(shí)，射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率作為左室收縮功能的主要指標(biāo)，分別代表了左室排空功能和心肌縮短能力，并未發(fā)生明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，但呈現(xiàn)出輕微的增強(qiáng)，考慮為收縮功能代償性增加。有實(shí)驗(yàn)證明，TAC術(shù)后1 w就能出現(xiàn)左室肥厚[12]，而在術(shù)后2 w將會(huì)達(dá)到峰值[13]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。

術(shù)后6 w時(shí)，小鼠大體表現(xiàn)為HW/BW的比值增加。ANP蛋白能特異性反映心肌細(xì)胞肥大并提示存在早期心力衰竭，在壓力超負(fù)荷法建立的模型中有較明顯的優(yōu)勢(shì)[14]。術(shù)后6 w的小鼠心肌細(xì)胞ANP表達(dá)增強(qiáng)，組織染色見(jiàn)細(xì)胞壞死、心肌纖維紊亂，間質(zhì)膠原纖維含量增多。此階段超聲測(cè)量的小鼠結(jié)構(gòu)方面，心腔增大、心室壁變??；在心功能方面，收縮功能代償性增加的優(yōu)勢(shì)消失，左室壁運(yùn)動(dòng)普遍減弱，射血乏力，從代償進(jìn)入失代償狀態(tài)。以上結(jié)果均證明了術(shù)后6 w充血性心力衰竭的存在。

小鼠主動(dòng)脈弓縮窄模型由于操作者手法及小鼠個(gè)體差異性，致使獲得的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托氖曳屎衽c心衰出現(xiàn)的時(shí)間也各不相同[15]，模型廣泛應(yīng)用心衰發(fā)病機(jī)理及藥物治療的研究[16]，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該模型早期表現(xiàn)出代償性心肌增厚以適應(yīng)后負(fù)荷增加，此階段與人類(lèi)高血壓性心臟病相似。繼續(xù)發(fā)展可出現(xiàn)左心室舒張末期壓力增加，可能會(huì)造成舒張功能不全近年來(lái)舒張性心衰受到越來(lái)越多的關(guān)注，該模型的應(yīng)用也得到了認(rèn)可[17]。

心臟功能是臨床和科學(xué)研究的關(guān)鍵指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的左室M型超聲心動(dòng)圖能夠檢測(cè)TAC小鼠的心臟收縮功能障礙。因尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)界定小鼠心臟大小及收縮功能正常值，所以本實(shí)驗(yàn)以術(shù)前1 d小鼠數(shù)據(jù)為基數(shù)。小鼠的心臟大小因品系、性別和年齡而異，故對(duì)小鼠進(jìn)行舒張功能評(píng)估的可行性必須謹(jǐn)慎[18]。小鼠心臟的心尖視圖不易再現(xiàn)，頻譜采樣時(shí)二尖瓣血流方向與超聲束不平行，缺乏可靠的角度校正法。更重要的是，小鼠心率快常伴隨著二尖瓣E波和A波的融合。為了區(qū)分E波和A波，常需減慢心率，而通過(guò)麻醉劑減慢心率時(shí)對(duì)小鼠舒張功能是否有影響尚不清楚[19]，因而應(yīng)使用多種方法綜合評(píng)價(jià)左室舒張功能。王冠等[20]證實(shí)了左心房面積和IVRT的改變可能是小鼠充盈壓升高和舒張功能不全的早期標(biāo)志，而LVEDP升高可能提示舒張功能不全的晚期指標(biāo)，重申了用多種方法測(cè)定小鼠心臟舒張功能的優(yōu)勢(shì)。本次實(shí)驗(yàn)以小鼠收縮功能指標(biāo)為重點(diǎn)，尚未全面驗(yàn)證舒張功能指標(biāo)。

隨著最近的技術(shù)進(jìn)步，新發(fā)布的超聲系統(tǒng)提供了更高的圖像分辨率和幀頻率，以確保小動(dòng)物的精準(zhǔn)定量測(cè)量。新的超聲心動(dòng)圖技術(shù)也將進(jìn)一步增強(qiáng)超聲成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)心臟功能的敏感性。例如，斑點(diǎn)追蹤應(yīng)變成像已被用于精確測(cè)量局部心肌功能。目前正在開(kāi)發(fā)的新傳感器技術(shù)將為三維、四維成像提供更大的發(fā)展空間。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)扎主動(dòng)脈弓后心臟發(fā)生一系列因壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)功能變化，模型可用于舒張與收縮功能障礙性疾病的進(jìn)一步研究，超聲心動(dòng)圖準(zhǔn)確反應(yīng)心臟結(jié)構(gòu)功能變化特征，是一種相對(duì)簡(jiǎn)單和無(wú)創(chuàng)性的技術(shù)，可以在不影響血管通路的情況下評(píng)估小鼠的心臟結(jié)構(gòu)細(xì)微變化，超聲心動(dòng)圖將為研究小鼠各種心血管疾病模型的評(píng)估提供更大的幫助。