胡文龍，謝雨瑤，楊新霞，牛麗偉，楊新生，楊菁

(1.錦州醫(yī)科大學；2.錦州衛(wèi)生學校外科教研室，遼寧 錦州 121000)

氧化苦參堿(OMT)為苦參和苦豆子的主要有效單體成分，在我國已有臨床應用[1]。在臨床上，有關氧化苦參堿的應用制劑主要為氧化苦參堿注射液、氧化苦參堿膠囊以及片劑，主要用于乙型肝炎及腫瘤的治療。近年來的研究證據(jù)表明，氧化苦參堿具有抑制炎癥、清除自由基、保護肝臟、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護等藥理作用，可能在改善代謝和老齡相關認知功能退變等方面具有良好的臨床應用前景[1]。OMT可以顯著緩解急性腦梗死大鼠腦水腫，抑制炎癥，從而發(fā)揮腦保護作用[2]。腦組織中星形膠質(zhì)細胞(AS)的激活與炎癥密切相關[3]。而在細胞水平上，OMT是否可以調(diào)節(jié)AS炎癥因子釋放，卻未見報道。利用脂多糖(LPS)刺激AS，引起炎癥反應[4]。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)與炎癥反應、免疫應答等重要的病理過程密切相關。本研究利用分離純化獲得AS，并采用LPS刺激該細胞制備損傷模型，通過此模型觀察OMT對炎癥因子釋放的影響；在此基礎上，通過檢測活性氧(ROS)含量及NF-κB激活狀態(tài)探討其作用機制，將OMT的作用機制引向深入。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑

24 h內(nèi)新生SD大鼠，購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心。氧化苦參堿，純度>99.0%，購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)液，購自美國Hyclone公司。脂多糖、D-Hank’s液、DAPI染液，購自北京索萊寶科技有限公司；2'，7' -二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)探針、0.25%胰酶-EDTA，購自碧云天生物技術有限公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、P-NF-κB p65、β-actin一抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒購自上海通蔚實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

按照文獻方法進行試驗[5]。取新生24 h內(nèi)的SD大鼠，無菌取出雙側大腦皮質(zhì)。皮質(zhì)用D-Hank’s沖洗3次后，用眼科剪將皮質(zhì)剪成小塊。然后加0.25%胰蛋白酶溶液5 mL，10 min后等體積15%胎牛血清培養(yǎng)液?；旌虾筮^濾。細胞濾液加入無菌離心管中，1000×g離心5 min，棄上清液，試管中加入5 mL含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，吹打成懸液后轉移到25 cm2培養(yǎng)瓶中，放培養(yǎng)箱中4 h后，再將含有細胞的培養(yǎng)液吸出，重新鋪入新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育。第2 d換1次液，以后每3 d換液1次。培養(yǎng)胞增殖至培養(yǎng)瓶底80%左右時傳代。細胞培養(yǎng)到第三代時進行實驗。

1.2.2 細胞純度鑒定

第三代細胞接種于蓋玻片，4 d后用PBS緩沖液沖洗，行常規(guī)免疫熒光實驗方法，即蓋玻片細胞用多聚甲醛固定。然后0.5% TritonX-100室溫處理，血清封閉后加入小鼠抗GFAP單克隆一抗抗體，濕盒中4 ℃冰箱過夜，PBS緩沖液漂洗，加羊抗小鼠FITC單克隆二抗抗體，然后PBS緩沖液洗滌3次。DAPI復染，PBS緩沖液沖洗，最后倒置熒光顯微鏡下觀察。選取3個視野進行計數(shù)。AS細胞GFAP 陽性，顯綠色熒光，為含有的AS數(shù)量；DAPI染核，呈藍色，為細胞總數(shù)，其比值為細胞純度。

1.2.3 細胞分組和藥物處理

當?shù)谌毎鲋车狡康准s80%時，利用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對細胞進行同步化。同步化的細胞隨機被分為對照組、LPS組、LPS+OMT組(100、300、900 μg/mL)。對照組僅加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；LPS 組則在培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mg/L的 LPS后，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h[5]330-337；LPS+OMT組培養(yǎng)液中分別加入終濃度為 100、300、900 μg/mL 的OMT，1 h后再加入終濃度為 1 mg/L的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 MTT法檢測AS細胞存活率

按 1.2.3細胞分組和藥物處理，按照參考文獻方法進行實驗[5]330-337。即繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后加入 20 μL MTT 溶液(5 g/L)，37 ℃培養(yǎng)4 h后 ，利用培養(yǎng)板離心機1000×g離心10 min后棄上清，然后每孔加入DMSO 150 μL后，震蕩破壞細胞膜后，于490 nm波長測定吸光度(A)。以對照組的A值為100%，其它組與對照組進行對比。

1.2.5 DCFH-DA熒光探針法檢測AS中ROS水平

按“1.2.3”細胞分組和藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，避光加入1 mL按一定比例稀釋的DCFH-DA探針(以1∶1000用不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)25 min。所有孔避光棄上清，加入1 mL 0.25%胰酶細胞消化液，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱消化，取出用顯微鏡觀察，待細胞呈圓形，加入等體積完全培養(yǎng)液終止消化，并吹下所有貼壁細胞，分別收集細胞至15 mL離心管，800×g離心3 min。避光棄上清，每管加入3 mL PBS重懸細胞，800×g再次離心3 min。避光棄上清，每管加入500 μL PBS重懸，并轉移到流式管內(nèi)使用流式細胞儀進行檢測，488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長。

1.2.6 Western Blot法檢測P-NF-κB p65蛋白含量

培養(yǎng)細胞結束后用RIPA裂解液冰上裂解提取細胞總蛋白。調(diào)整蛋白含量至1 mg/mL。加熱變形后利用10%的SDS-PAGE分離蛋白后再轉移到PVDF膜上。膜用5% BSA封閉液，然后用TBST洗，然后加入p-NF-κB p65或β-actin一抗4 ℃過夜。次日采用TBST洗后，滴加HRP標記山羊抗兔二抗室溫孵育。膜用TBST后用ECL顯影液顯影成像，用Image J軟件對結果進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。通過Shapiro-Wilk 和 Levene’s tests先檢測所有數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布以及方差齊性。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK方法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AS細胞純度鑒定

GFAP主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的AS中，參與細胞骨架的構成，是AS鑒定的公認標志物。實驗結果顯示，98%以上的細胞顯示綠色熒光，即表明培養(yǎng)的細胞純度為98%以上。能滿足實驗的需要，實驗細胞均采用該條件下分離純化后進行實驗，見圖1。

圖1 培養(yǎng)細胞純度鑒定(200×)

2.2 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞存活率的影響

MTT檢測OMT對LPS誘導的大鼠星型膠質(zhì)細胞存活率的影響。結果表1所示，LPS組細胞存活率降低至對照的49.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，說明LPS造成了細胞損傷。與LPS組比較，LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)組細胞存活率升高，分別為63.7%、77%、91.7%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，說明OMT對LPS造成的細胞損傷具有保護作用。從效果看，隨著濃度的升高，保護效果越強。

表1 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞存活率的影響

2.3 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的影響

為觀察OMT對AS細胞炎癥因子釋放的影響，采用ELSA方法對培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α含量進行了檢測。實驗結果發(fā)現(xiàn)，LPS組AS培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平比對照組明顯升高(P<0.001)。當培養(yǎng)液中加入100、300、900 μg/mL OMT后可以明顯抑制LPS引起的IL-1β和TNF-α釋放(P<0.001)，并且濃度越高抑制效果越明顯，見表2。

2.4 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞ROS水平的影響

活性氧(ROS)是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應的含氧產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等[6]。ROS是導致細胞氧化應激的主要因素之一，本實驗通過DCFH-DA熒光探針法檢測細胞中ROS水平[6]975-977，見圖4?？梢奓PS組AS中，ROS水平由對照組的19.80%，升高至55.60%(P<0.001)。與LPS組比較，LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)組細胞中ROS含量分別降低至44.90%、39.90%、32.20%，提示OMT可有效抑制LPS誘導的AS氧化損傷，見圖2。

表2 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的影響

A:對照組；B：LPS組；C：LPS+OMT 100 μg/mL；D:LPS+OMT 300 μg/mL；E：LPS+OMT 900 μg/mL；F:各組ROS含量，與LPS組相比，** P<0.001圖2 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞ROS水平的影響

2.5 OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞中P-NF-κB p65蛋白的影響

OMT對LPS引起的胰島內(nèi)皮細胞P-NF-κB p65升高具有抑制作用[7]，因此推測OMT也可能通過同樣的機制在AS細胞中揮作用。結果顯示，LPS組AS中P-NF-κB p65蛋白表達量是對照組的2.2倍。LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)P-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.001)，其中又以900 μg/mL OMT組最明顯，見圖3。

與LPS組相比，**P<0.001圖3 Western Blot法檢測OMT對LPS誘導星型膠質(zhì)細胞中P-NF-κB p65蛋白的影響

3 討 論

缺血性腦卒中是造成患者腦功能障礙的常見疾病。在腦缺血等病理情況下，AS出現(xiàn)活化，缺血區(qū)周圍有大量AS的聚集，對于恢復腦功能具有積極作用。但過度的AS聚集活化引起的炎癥對神經(jīng)元卻又有不利影響[8-9]。在分離的大鼠皮層細胞中，有神經(jīng)細胞、星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、成纖維細胞等。為確保實驗結果的可靠性，本實驗選用差速貼壁技術、傳代等技術，獲得了純度98%以上的AS細胞進行實驗。LPS由類脂 A、核心多糖和O-多糖側鏈組成，常在體外研究中刺激誘導AS活化，引起炎癥，是常用的刺激物[10]。作者選通用的1 mg/L LPS對AS進行刺激，結果發(fā)現(xiàn)AS細胞IL-1β和TNF-α釋放水平升高接近對照組的3倍，說明模型構建成功。再此基礎上，對OMT的抗炎效果進行了測定，結果表明100、300、900 μg/mL OMT對與LPS刺激釋放的IL-1β和TNF-α均具有抑制作用，且具有劑量效應關系。

氧化應激損傷是由ROS生成能力與消除能力失衡導致。AS細胞激活后，可以通過提高GSH生成、增強過氧化物酶等發(fā)揮抗氧化作用，但過度升高可造成細胞損傷[11]。實驗結果表明LPS可以引起AS細胞內(nèi)ROS含量明顯升高，而OMT對ROS的升高具有抑制作用，說明OMT的抗炎作用可能與抑制氧化應激有關。

細胞內(nèi)的ROS升高會觸發(fā)一系列信號通路，包括激活NF-κB[12]。NF-κB有p50和p65兩個亞基，它是轉錄因子，可以促進IL-1β和TNF-α的釋放引發(fā)炎癥反應，發(fā)揮保護作用，但過度激活也可以IL-1β和TNF-α的過度釋放，反而造成細胞損傷[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應主要通過NF-κB p65亞基發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。未刺激時，NF-κB p65與NF-κB抑制蛋白結合在胞漿中。當受刺激后，NF-κB p65被磷酸化激活，引起變構，脫離抑制蛋白后進入細胞核內(nèi)[14]，促炎癥因子表達及釋放。NF-κB p65的磷酸化是該過程的關鍵[15]。實驗結果顯示，LPS導致AS的P-NF-κB p65含量明顯升高，而OMT對LPS誘導的NF-κB p65磷酸化具有抑制作用，因此有理由推測OMT可能是通過抑制κB p65磷酸化，進而減少炎癥因子IL-1β和TNF-α的釋放。

綜上所述，OMT可抑制LPS引起的AS損傷及炎癥因子的釋放，其機制可能與其清除ROS、抑制NF-κB p65磷酸化來發(fā)揮作用。但同時也意識到，腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)中參與炎癥反應的主要細胞，而OMT對小膠質(zhì)細胞及其與AS細胞的相互影響仍需進一步研究。