譚 軍，王 蕊，林興軍，施忠海，董云萍，張 昂*

咖啡連作根際土壤水提液對其幼苗根系發(fā)育的影響

譚 軍1，王 蕊2，林興軍1，施忠海2，董云萍1，張 昂1*

1. 中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所/農業(yè)農村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室，海南萬寧 571533；2. 云南農業(yè)大學熱帶作物學院，云南普洱 665099

咖啡是世界三大飲料之一，營養(yǎng)豐富，經濟價值高，深受消費者歡迎?？Х仁菬釁^(qū)重要的多年生經濟作物，長期的連作產生了嚴重的連作障礙，已成為影響咖農增收、制約產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴重問題，亟待解決。本研究采集咖啡園病株根際土壤，開展室內盆栽試驗，研究其4個濃度的水提液（0、0.50、1.00和2.00 g/mL，分別表示為CK、T1、T2和T3）對咖啡幼苗根系生長發(fā)育的影響，以期明晰咖啡連作障礙產生的機理，為克服咖啡連作障礙提供科學和試驗依據。結果表明：發(fā)病植株根際土壤水提液導致其幼苗根系表皮細胞變小、排列更加緊密，并且隨著濃度的升高，根系細胞壁及內膜系統(tǒng)逐漸被破壞，形成空腔；初生木質部細胞的木質化程度逐漸增加。根系鮮重、干重、總根長、根體積、根尖數、總根表面積以及根系活力均隨根際土壤水提液濃度的升高而下降，T2處理與CK相比差異顯著（<0.05），T3處理差異極顯著（<0.01）。隨著根際土壤水提液濃度的升高，根系木質素含量和相對電導率逐漸升高，T1處理與CK相比，木質素含量增加29.53%，差異顯著，T2、T3處理木質素含量分別增加42.38%、66.52%，差異均達極顯著；T2、T3根系相對電導率分別增加34.40%、58.30%，差異均達極顯著。根系可溶性蛋白含量隨著土壤水提液濃度的升高呈現先升高后下降的變化趨勢，T2處理與CK相比，可溶性蛋白含量增加61.75%，差異顯著。MDA含量、SOD、POD和CAT活性均隨著土壤水提液濃度升高而升高，T3處理與CK相比，SOD活性增長56.77%，差異顯著；POD活性增加96.28%，差異極顯著。綜上可知，發(fā)病咖啡植株根際土水提液中存在自毒物質，破壞咖啡幼苗根系結構、抑制根系生長發(fā)育。

咖啡；根系；連作；根際土壤；自毒作用

咖啡是世界三大飲料之一，每年全球消費量超過9′109kg，具有廣泛的營養(yǎng)價值、經濟價值和藥用價值。咖啡是我國乃至全球熱區(qū)重要的經濟作物。據統(tǒng)計，2020年我國咖啡種植面積已達9.94萬hm2，年產咖啡豆11.41萬t，是云南、海南等熱區(qū)農民重要的經濟來源[1]?？Х仁嵌嗄晟洕魑?，長期連作導致樹體衰弱、產質量下降、經濟效益降低。但再植或者咖啡老園更新時出現大量死株，嚴重影響了咖農種植的積極性和產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，現已成為產業(yè)亟待解決的問題。筆者田間調查發(fā)現再植的咖啡植株普遍存在黃化、長勢弱、不發(fā)新根、甚至部分根系腐爛的問題。大量研究表明，自毒作用是連作障礙發(fā)生的重要誘因。自毒作用是發(fā)生在同種植物間的抑制生長發(fā)育的一種化感作用[2-3]。長期的連作導致自毒物質在土壤中積累，尤其是在根際土壤中形成高濃度的微環(huán)境。自毒作用已給農業(yè)生產造成諸多負面影響。如白茹[4]研究表明蘋果根系水提液破壞其幼苗根系膜的結構和功能，降低膜的流動性、增加膜的相對透性、降低葉片光合色素和光合速率，進而影響蘋果樹生長發(fā)育；陸茜[5]研究表明楊樹根際土壤水提液抑制其幼苗根系的生長；李敏等[2]證實酚酸類物質是枸杞自毒物質，對其種子萌發(fā)具有較強抑制作用；袁婷婷等[6]研究表明蠶豆自毒物質阿魏酸導致其根系木質素含量升高、細胞形變、胞內物質外泄，顯著加劇了連作障礙的發(fā)生。

根是植物吸收養(yǎng)分的主要器官,也是最先感知土壤環(huán)境改變的器官。健康的根系對植物生長發(fā)育至關重要[7]。但迄今為止，有關咖啡化感物質對其根系生長發(fā)育影響的研究還鮮見報道。因此，本研究采集大田再植發(fā)病咖啡植株根際土壤，并通過室內盆栽試驗探討其水提液對咖啡根系發(fā)育的影響，以期明晰咖啡連作障礙產生的機理，為克服咖啡連作障礙提供科學和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤取自海南省瓊海市大路鎮(zhèn)咖啡園（19°44￠N，110°47￠E）。該園咖啡種植時間超過15年，連作障礙嚴重，再植咖啡植株長勢弱、成活率低。采用抖落法采集發(fā)病咖啡植株根際土，混勻過10 mm篩，置于滅菌自封袋中帶回實驗室自然風干。參照陳艷芳[8]的方法提取咖啡根際土水提液，并濃縮至2 g/mL后用0.22 μm的濾膜過濾除菌，冷藏保存?zhèn)溆?。開展試驗時用無菌水分別稀釋成濃度為0.5、1.0 g/mL的溶液。在咖啡園毗鄰區(qū)域采集從未種植過咖啡的耕層土壤，過篩、風干后按照耕層土壤有機肥=7∶3配制營養(yǎng)土，備用[9]。營養(yǎng)土理化特征為pH 6.50±2.12，有機質(28.91±3.85)g/kg、堿解氮(151.71±6.01)mg/kg、速效磷(20.13±1.92)mg/kg、速效鉀(170.63± 5.91)mg/kg。供試咖啡品種為中粒種主栽品種‘熱研1號’（Pierre ex Froehner cv. Reyan No.1）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 盆栽試驗于2019年12月至2021年4月在中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所日光溫室內進行?？Х确N子經沙床催芽，子葉完全展開后于2020年3月10日選擇健壯、無病害的苗移栽至高12 cm、直徑10 cm裝有1.50 kg營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中培養(yǎng)，于2020年4月15日選取健壯的長勢一致的植株開始試驗處理。即分別用無菌水、0.5、1.0和2.0 g/mL的根際土壤水提液分別澆灌咖啡植株，依次標記為CK、T1、T2和T3，每3 d灌根一次，每次100 mL。各處理15株、3次重復。全程置于蔭蔽度50%的日光溫室中培育。于2021年3月29日取植株根系分析、測定。

1.2.2 項目測定 采用石蠟切片，番紅-固綠染色觀察根尖結構[10]；TTC方法測定根系活力，WinRhizo根系分析系統(tǒng)掃描分析根系形態(tài)[11]；巰基乙酸法測定根系木質素含量[12]；電導率測定儀（雷磁，DZS-708）測定根系相對電導率；BCA法測定根系可溶性蛋白含量；氮藍四唑（NBT）還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；過氧化氫法測定過氧化氫酶（CAT）活性；硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（MDA）含量[11]。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，運用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析，采用Microsoft Excel 2013軟件進行數據處理和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 咖啡根際土水提液對其幼苗根系解剖結構的影響

由圖1可知，根際土壤水提液處理與CK相比，根系表皮細胞變小、排列更緊密。隨著根際土壤水提液濃度的升高，皮層薄壁細胞變小，細胞壁發(fā)生破裂、形成空腔；內皮層細胞變小，在T3濃度處理下，內皮層細胞形成的緊密環(huán)狀結構消失，形成空隙；初生木質部細胞的木質化程度逐漸增加。可知，咖啡根際土壤水提液破壞了其幼苗根系的細胞結構。

圖1 不同濃度咖啡根際土水提液處理的咖啡幼苗根尖切片

2.2 咖啡根際土水提液對其幼苗根系生長的影響

由表1可知，根系鮮重、干重、總根長、根體積、根尖數和總根表面積均隨土壤水提液濃度的升高而下降。T1處理各指標與CK相比雖有降低，但差異不顯著，T2處理各指標均達顯著，T3處理各指標均達極顯著。因此，咖啡根際土壤水提液對其幼苗根系生長發(fā)育有顯著影響。

2.3 咖啡根際土水提液對其幼苗根系活力的影響

由圖2可知，T1處理根系活力比CK降低8.91%，二者差異不顯著；T2和T3處理根系活力均極顯著低于CK，分別降低35.64%、58.91%；T3處理根系活力顯著低于T2處理，降低36.15%?？芍Х雀H土壤水提液降低了咖啡幼苗的根系活力。

2.4 咖啡根際土水提液對其根系木質素含量的影響

由圖3可知，咖啡苗根系木質素含量隨著連作土壤水提液濃度增加而升高。T1處理木質素含量與CK相比增加29.53%，差異顯著，T2、T3分別增加42.38%、66.52%，差異均達極顯著。T3處理木質素含量也顯著高于T1處理?？芍?，咖啡根際土壤水提液增加了咖啡苗根系木質素的含量。

表1 不同濃度咖啡根際土水提液處理的幼苗根系形態(tài)

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05），不同大寫字母表示處理間差異極顯著（<0.01）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05), different capital letters indicate extremely significant difference among treatments (<0.01).

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

2.5 咖啡根際土水提液對其幼苗根系相對電導率的影響

由圖4可知，T1處理的根系相對電導率與CK相比略有增加，但二者差異不顯著；T2、T3根系相對電導率分別增加34.40%、58.30%，均達極顯著差異；T3根系相對電導率比T2增加47.54%，差異顯著。可知，咖啡根際土壤水提液增加了咖啡幼苗根系相對電導率。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

2.6 咖啡根際土水提液對其幼苗根系可溶性蛋白含量的影響

由圖5可知，隨著土壤水提液濃度的升高，根系可溶性蛋白含量呈現先升高后下降的變化趨勢。T2處理可溶性蛋白含量與CK相比增加61.75%，差異顯著；T1處理增加33.01%；差異不顯著。T3根系可溶性蛋白比T2處理下降88.73%，差異顯著?？芍?，咖啡根際土壤水提液對其幼苗根系可溶性蛋白含量有顯著影響。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.7 咖啡根際土水提液對根系抗氧化酶活性的影響

由圖6可知，SOD、POD和CAT活性均隨著土壤水提液濃度升高而升高。T3處理SOD活性與CK相比增長56.77%，差異顯著；T1、T2、T3處理的POD活性分別增加55.90%、87.22%、96.28%，差異極顯著；T2和T3處理的CAT活性增加15.31%、27.82%，差異極顯著水平。

2.8 咖啡根際土水提液對其根系MDA含量的影響

由圖7可知，根系MDA含量隨著土壤水提液濃度升高而升高。T1處理MDA含量與CK相比略有增加，差異不顯著；T2處理增加30.03%，差異顯著；T3處理增加83.55%，差異極顯著。可知，咖啡根際土壤水提液對咖啡苗膜系統(tǒng)造成了損傷。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

根系是植物重要的代謝器官和養(yǎng)分吸收器官，也是植株唯一與土壤接觸的器官，最先感知土壤環(huán)境的改變并做出響應[13-14]。當遭遇逆境脅迫時，根系通過信號傳導系統(tǒng)啟動相關抗逆基因的轉錄、表達、合成抗逆代謝物質，改變能量流方向、調節(jié)生理狀態(tài)，最終影響根系的生長發(fā)育和形態(tài)結構[14-16]。本研究表明即使是低濃度的發(fā)病咖啡根際土壤水提液也會導致咖啡幼苗根系表皮細胞變小、排列更加緊密；并且隨著水提液濃度的升高，皮層薄壁細胞變小，逐漸破裂形成空腔；根系相對電導率升高。這說明發(fā)病咖啡根際土壤水提液中的化感自毒物質擾亂了代謝途徑，改變了細胞形態(tài)，破壞了細胞膜系統(tǒng)導致胞內物質外泄。本研究結果與前人研究的結果基本一致。如向維[17]在研究三七皂苷類自毒物質對其根系的影響時也出現質壁分離、胞結構被破壞的現象；李勇等[18]研究表明，人參根系在其自毒物質苯甲酸脅迫下出現細胞壁異常增厚、核膜溶解消失、細胞內產生空腔。由此可知化感物質對根系的自毒機理有一定的共性。

可溶性蛋白是重要的滲透調節(jié)物質和功能性蛋白，在維持細胞滲透壓和正常代謝活動方面起著重要作用，其含量高低是植物代謝能力強弱的一個重要指標[19-20]。植物遭遇脅迫時，可溶性蛋白合成受阻、含量降低。本研究中隨著根際土水提液濃度的升高，咖啡幼苗根系可溶性蛋白含量呈現先升高后下降的變化趨勢。這表明發(fā)病咖啡根際土水提液濃度低于1.0 g/mL時，根系可以通過合成可溶性蛋白，提高細胞滲透壓、增強代謝能力，降低毒害作用；當濃度高于1.0 g/mL時，自毒作用增強，抑制了可溶性蛋白的合成。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

本研究中咖啡幼苗根系活力，根系鮮重、干重，總根長，根體積和總根表面積均隨著發(fā)病植株根際土水提液濃度升高而顯著下降。根系活力的強弱在一定程度上反映根系代謝的旺盛程度和養(yǎng)分吸收能力的強弱[4]。本研究表明發(fā)病咖啡根際土壤水提液影響根系的代謝和吸收功能，影響干物質積累，進而導致根系發(fā)育受阻，根系鮮重、干重下降。根尖的發(fā)育以及側根的形成受外界環(huán)境因子和內部信號的調控[21]。細胞表面的信號感受器感知到外界環(huán)境信號的刺激，啟動轉錄因子調控相關基因的表達，進而調控根尖頂端分生組織、側根的發(fā)育。大量研究表明，如bZIP、MYB、AP2/ERF等轉錄因子家族，生長素、細胞分裂素等激素廣泛參與根系發(fā)育調控、逆境應答等多個生物學過程[22-24]。本研究中咖啡幼苗根尖數量隨著發(fā)病植株根際土水提液濃度升高而顯著下降，與大田調研的發(fā)病咖啡植株根系生長發(fā)育受阻、不發(fā)新根的結論基本一致。據此推測發(fā)病植株根際土中存在抑制咖啡根系發(fā)育物質，但具體是何種物質及其抑制機理還有待更進一步研究。

活性氧在植物體內參與多種生命過程，兼具有利和毒害的雙重功能[25-26]。大量研究表明正常情況下細胞內的活性氧含量和抗氧化酶系的活性處于動態(tài)平衡。但遭遇逆境脅迫時，活性氧含量大量積累，打破與抗氧化酶系的平衡，導致細胞膜系統(tǒng)受損，表現出MDA含量增加、相對電導率升高[27-29]。本研究表明發(fā)病咖啡植株根際土壤中存在某種或者某些化學物質對咖啡幼苗根系造成了氧化脅迫，導致細胞膜系統(tǒng)受損。該研究結果與根系解剖觀察到的結果一致，也與其他學者研究的脅迫導致細胞抗氧化酶活性增加，膜系統(tǒng)受損的結論一致。

4 結論

發(fā)病咖啡植株根際土壤水提液存在自毒物質，破壞咖啡幼苗根系結構、影響根系生長發(fā)育。隨著水提液濃度的升高，咖啡幼苗根系受損逐漸加重，木質化程度、MDA含量和抗氧化酶活性逐漸增加，根系鮮重、干重，總根長，根體積和總根表面積顯著下降。本研究結果為揭示咖啡連作障礙的形成提供了科學和試驗依據。

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Effects of Aqueous Extracts from Continuous Cropping Rhizosphere Soil of Coffee on Development of Seedling Roots

TAN Jun1, WANG Rui2, LIN Xingjun1, SHI Zhonghai2, DONG Yunping1, ZHANG Ang1*

1. Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China; 2. Tropical Crops College, Yunnan Agricultural University, Pu’er, Yunnan 665099, China

Coffee with rich nutritional value and high economic value is one of the three major beverages in the world, and is deeply welcome by consumers all over the world. Coffee is an important perennial cash crop in hot areas, and the long-term continuous cropping of which has produced serious continuous cropping obstacles, which has become a serious problem affecting the income of coffee farmers and restricting the sustainable development of the industry. Therefore, it needs to be solved urgently. In order to clarify the mechanism of coffee continuous cropping obstacle and provide scientific and experimental basis for overcoming it, the rhizosphere soil of diseased coffee plants was collected, and the indoor pot experiment was carried out to study the response of root growth and development of coffee seedlings to four concentrations of which water extracts (0, 0.50, 1.00 and 2.00 g/mL, recorded as CK, T1, T2and T3, respectively) in this study.The rhizosphere soil aqueous extracts of diseased coffee plants caused the epidermal cells of coffee seedlings to become smaller and arranged more closely. With the increase of its concentration, the root cell wall and intimal system were gradually destroyed and formed a cavity. The lignification degree of primary xylem cells increased gradually as well. Root fresh weight, dry weight, total root length, root volume, root tip number, total root surface area and root activity decreased with the rhizosphere soil aqueous extracts of diseased coffee plants. Compared with CK, those from T2decreased to a significant different level (0.05), and those from T3decreased to a very significant different level (0.01). The lignin content and relative conductivity of roots increased gradually with the rhizosphere soil aqueous extracts. Compared with CK, the lignin content of T1increased by 29.53%, reaching a significant different level, and the lignin of T2and T3increased by 42.38% and 66.52% respectively, reaching a very significant different level. The root relative conductivity of T2and T3increased by 34.40% and 58.30%, respectively. With the aqueous extracts concentration rising up, the soluble protein content of roots increased, 61.75% higher of T2than that of CK. Although subsequently the amount decreased, but which was significantly different according to the data recorded before. MDA content, and the activities of SOD, POD and CAT increased with the increase of the aqueous extracts concentration. Compared with CK, the activity of SOD in T3increased by 56.77%, reaching a significant different level, POD activity increased by 96.28%, reaching a very significant different level. In conclusion, there are autotoxic substances in the aqueous extract of rhizosphere soil of diseased coffee plants, which destroy the root structure of coffee seedlings and affect the growth and development of roots.

coffee; root; monocropping; rhizosphere soil; autotoxicity

S571.3；S-3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.013

2022-02-16；

2022-03-31

國家自然科學基金項目（No. 31901469）；海南省自然科學基金項目（No. 320QN345）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（No. 1630142020006）。

譚 軍（1985—），男，博士，助理研究員，研究方向：作物栽培。*通信作者（Corresponding author）：張 昂（ZHANG Ang），E-mail: angzhang_henu@163.com。