栗 晗，江尚燾，彭海英，高日芳，張金蓮*，李冬萍，姜 柔，董彩霞，陳廷速*

廣西百色市芒果樹根際土壤叢枝菌根真菌資源初探

栗 晗1，江尚燾1，彭海英1，高日芳2，張金蓮2*，李冬萍2，姜 柔1，董彩霞1，陳廷速2*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部資源節(jié)約型肥料工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210095；2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧 530007

為探明廣西百色市芒果根際土壤叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal, AM）真菌的分布情況，本研究對(duì)廣西芒果主產(chǎn)區(qū)的芒果根際土壤及根系樣本進(jìn)行AM真菌分離，并比較不同施肥制度下芒果根際土壤的AM真菌種類和根系菌根侵染情況。采集5個(gè)主施有機(jī)肥的芒果園（OT）和5個(gè)主施化肥的芒果園（CT）根際土壤，采用濕篩傾析法分離土壤中的AM真菌孢子，通過(guò)富集和誘導(dǎo)培養(yǎng)純化其中的AM真菌，進(jìn)行分子和形態(tài)鑒定。采用墨水醋染色法對(duì)根系樣本進(jìn)行染色及內(nèi)生真菌侵染率的測(cè)定。共分離出6種AM真菌，OT處理分離出無(wú)梗囊霉屬（sp）1種，近明球囊霉屬（sp）1種，類球囊霉屬（sp.）1種；CT處理分離出無(wú)梗囊霉屬2種，近明球囊霉屬1種。2種施肥制度分離出的AM真菌種類較少，且分離出的AM真菌種類均較常見，并無(wú)特有種。根系染色發(fā)現(xiàn)，OT處理菌絲分布較多，AM真菌結(jié)構(gòu)豐富，可明顯觀察到叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)，還發(fā)現(xiàn)有少量的深色有隔真菌（dark septate endophytes, DSE）；CT處理的菌絲相對(duì)較少，泡囊結(jié)構(gòu)和叢枝也較少，DSE相對(duì)較多。方差分析結(jié)果顯示，施肥類型、芒果品種和樹齡對(duì)AM真菌的根外菌絲、泡囊結(jié)構(gòu)以及孢子密度均有不同程度的影響，其中施用有機(jī)肥較化肥對(duì)AM真菌的根外菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)均有顯著的促進(jìn)作用。綜上，本研究篩選所得菌種豐富了我國(guó)AM真菌菌種庫(kù)，并為篩選果樹高效AM真菌菌劑奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，也為果園管理提供了新方向。

芒果；根際；土壤；叢枝菌根真菌

芒果是一種常綠大喬木，為我國(guó)主要的熱帶水果之一。廣西壯族自治區(qū)作為我國(guó)最大的芒果生產(chǎn)基地，具有悠久的種植歷史，尤其是被命名為“中國(guó)芒果之鄉(xiāng)”的百色地區(qū)。隨著芒果產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，問(wèn)題也伴隨而來(lái)。大多數(shù)果農(nóng)為追求效益濫施和偏施化肥，普遍存在有機(jī)肥施用不足、鉀肥投入不足的問(wèn)題[1]，導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降、樹體營(yíng)養(yǎng)不足、病蟲害易侵入等問(wèn)題。叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal, AM）真菌是一種具有廣泛宿主范圍的共生真菌，它能與大約80%的植物建立共生關(guān)系[2]。AM真菌依賴于宿主植物提供的碳源，而其菌絲網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)大吸收能力促進(jìn)植物養(yǎng)分的吸收[3]，還能夠提高宿主植物對(duì)各種生物和非生物脅迫的耐受性，例如干旱脅迫和細(xì)菌、真菌、線蟲等病原體入侵[4-5]。前人已有研究表明，AM真菌可提高果樹礦質(zhì)元素吸收、增加抗旱耐鹽等抗脅迫能力，還可直接或間接改善果實(shí)品質(zhì)。李嬌嬌[6]研究表明，AM真菌促進(jìn)了葉片和根系中滲透物質(zhì)的積累，通過(guò)調(diào)節(jié)激素和相關(guān)酶活性提高梨樹幼苗的抗旱性。張敏瑜等[7]研究表明，AM真菌的定殖促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)，改變了柑橘類水果中次生代謝產(chǎn)物的積累。因此，對(duì)于果樹生態(tài)系統(tǒng)，如何利用AM真菌資源提高土壤肥力、改善樹體營(yíng)養(yǎng)和果實(shí)品質(zhì)具有很大研究?jī)r(jià)值。

AM真菌資源分布廣泛，種類多樣。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的AM真菌有147種[8]，但果樹中發(fā)現(xiàn)的AM真菌相對(duì)較少。目前芒果根際土壤AM真菌的分離鮮有報(bào)道。AM真菌多樣性受宿主植物、土壤、氣候、地理等影響。張貴云[9]研究分析了不同耕作條件下土壤環(huán)境因子與AM真菌孢子密度及侵染率的相關(guān)性，結(jié)果表明土壤有機(jī)質(zhì)與其呈正相關(guān)；還有許多研究均表明果園有機(jī)管理對(duì)保持AM真菌多樣性和豐富度具有積極作用[10-11]。本研究從芒果主產(chǎn)區(qū)之一的廣西百色地區(qū)采集2種不同施肥制度的芒果根際土壤，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)及土著AM真菌的純化分離，通過(guò)分離芒果根際土壤土著AM真菌，為后續(xù)研究和開發(fā)適宜芒果的菌根菌劑提供理論依據(jù)，并對(duì)果園管理提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2020年7月在廣西百色市芒果主產(chǎn)區(qū)選取5個(gè)主施有機(jī)肥的芒果園（OT-1、OT-2、OT-4、OT-7、OT-10）和5個(gè)以化肥為主，不施（或少施）有機(jī)肥的芒果園（CT-3、CT-5、CT-6、CT-8、CT-9），果園氣候和土壤類型盡可能保持一致。采用五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品，即在同一地塊選取5個(gè)點(diǎn)，先去掉表層大塊碎石和枯枝落葉，將根系及土壤挖出，深度30～40 cm，然后將與根系緊密結(jié)合的土壤敲出。將5個(gè)點(diǎn)的土壤混合，用4分法保留樣品，裝入無(wú)菌紙袋。每個(gè)果園采集土樣1 kg，同一果園根系樣品放入同一密封袋，4℃保存帶回實(shí)驗(yàn)室。帶回實(shí)驗(yàn)室后分為2份，分別置于4℃和室溫條件下。

1.1.2 采樣地概況 采樣地概況見表1。土樣在室內(nèi)風(fēng)干，過(guò)20目篩，水土比為2.5∶1，采用PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)測(cè)定pH。

表1 采樣信息表

1.2 方法

1.2.1 芒果根系內(nèi)生真菌侵染率測(cè)定 從10個(gè)根系樣品中分別選擇各級(jí)根系各5～10條，放入50 mL離心管。清水浸泡30 min，自來(lái)水清洗后，超聲波處理30～60 s，用50%酒精室溫保存。芒果根系染色處理參考廖楠等[12]的方法，侵染率的測(cè)定參考汪茜等[13]的方法。

1.2.2 AM真菌的分離擴(kuò)繁 將采集的土壤樣品過(guò)20目篩，裝入封口袋。分別稱取10個(gè)土樣各20 g，采用濕篩傾析法篩取AM孢子并記錄孢子數(shù)量，將從5個(gè)OT處理和5個(gè)CT處理中篩取的孢子分別混合，最后將孢子按形態(tài)分開，分別接種于玉米苗根部，在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所玻璃溫室進(jìn)行單孢子分離培養(yǎng)8個(gè)月后，將檢測(cè)有孢子的樣品進(jìn)行孢子鑒定。

1.2.3 AM真菌孢子的形態(tài)鑒定 形態(tài)鑒定參考汪茜等[14]的方法，根據(jù)孢子分類特征如顏色、形狀大小、表面紋飾、孢子內(nèi)含物、孢壁結(jié)構(gòu)、連孢菌絲的數(shù)目、寬度及形狀和附屬結(jié)構(gòu)產(chǎn)孢子囊等對(duì)孢子進(jìn)行分類及種屬鑒定。對(duì)照《VA菌根真菌鑒定手冊(cè)》和http://invam.wvu.edu/home，http:// mycorrhizae.org.in/cmcc/index，http://www.i-beg.eu/網(wǎng)站提供的圖片及菌種描述，并查閱相關(guān)種的原始發(fā)表資料和近幾年發(fā)表的有關(guān)AM真菌的分類資料進(jìn)行種屬的檢索和鑒定。

1.2.4 AM真菌的分子鑒定 參考駱禮華等[15]的方法分別提取AM真菌單個(gè)孢子的DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一次PCR擴(kuò)增：采用引物GeoA2-Geo11[16]（表2）。反應(yīng)體系（20 μL）：PCRmix 10 μL，ddH2O 7 μL，引物GeoA2 0.5 μL，引物Geo11 0.5 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。

第二次PCR擴(kuò)增：采用AM真菌特異性通用引物對(duì)AML1-AML2[17]（表2），模板以第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍，取2 μL，反應(yīng)體系與第一次PCR相同，反應(yīng)程序退火溫度改為58℃，延長(zhǎng)時(shí)間為1 min，其余反應(yīng)程序與第一次相同。取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，用1.0%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物由擎科基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后下載相似性達(dá)97%的序列，用MAGA 7軟件通過(guò)鄰位加入法（N-J），運(yùn)行1000次bootstrap驗(yàn)證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 Nested PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，利用LSD法多重比較平均數(shù)間的差異顯著性（<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果根系內(nèi)生真菌檢測(cè)

不同施肥處理的芒果根系叢枝菌根（AM）真菌和深色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes, DSE）侵染有差異。主施有機(jī)肥的芒果園（OT）（圖1A～圖1F）菌絲分布較多，AM真菌結(jié)構(gòu)豐富，可以明顯觀察到叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)，還發(fā)現(xiàn)有少量的DSE。主施化肥的芒果園（CT）（圖1G～圖1L）菌絲相對(duì)較少，與OT處理相比菌絲較細(xì)，CT處理的泡囊結(jié)構(gòu)和叢枝也較少，而DSE相對(duì)較多。

A～F：主施有機(jī)肥的芒果園；G～L：主施化肥的芒果園。

2.2 AM真菌和深色有隔真菌侵染情況

不同樣點(diǎn)芒果根系的內(nèi)生真菌定殖情況不同（表3，表4）。AM真菌總定殖率依次為：OT-10>OT-4>CT-3>OT-1>OT-2>CT-9>CT-5>CT-6> CT-8>OT-7。除OT-2沒有DSE定殖外，其余樣點(diǎn)均有定殖，DSE總定殖率依次為CT-8>CT-9> OT-1>OT-10>CT-3>CT-5>OT-4>CT-6>OT-7。OT處理和CT處理的AM真菌侵染率的平均值分別為40.21%和32.56%，其DSE侵染率的平均值分別為0.65%和5.54%，CT處理的根系A(chǔ)M真菌侵染率有低于OT處理的趨勢(shì)，DSE侵染率與之相反。此外，OT處理的根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊和叢枝的平均豐度均高于CT處理，而OT處理的微菌核和有隔菌絲平均豐度低于CT處理。

表3 不同采樣點(diǎn)根系A(chǔ)M真菌的定殖情況

表4 不同采樣點(diǎn)的根系有隔內(nèi)生真菌（DSE）定殖情況

經(jīng)方差分析可以得出，2種施肥處理的孢子數(shù)無(wú)顯著差異，但不同芒果樹齡及品種間的孢子數(shù)有顯著差異。施肥對(duì)AM真菌定殖的根外菌絲、泡囊結(jié)構(gòu)有顯著影響，其中OT處理的根外菌絲和泡囊侵染率均顯著高于CT處理，品種對(duì)AMF的根外菌絲也有顯著影響（表5）。

2.3 AM真菌孢子形態(tài)特征

如圖2所示，芒果根際土壤中共分離出6種AM真菌孢子，OT處理和CT處理各3種，分別是CT-1-4、CT-2-7、CT-3-10、OT-2-13、OT-4-3、OT-4-15，具體描述如下：

2.3.1 層狀近明球囊霉（）編號(hào)CT-1-4（圖2A1～圖2A3），孢子黃棕色，球形或近球形，大小為77.88～148.56 μm，平均為104.50 μm。孢子壁3層。L1透明至淡黃色層狀壁，厚1.00～4.00 μm，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中被染成淺藍(lán)色，這一層往往易被降解。L2層狀壁，淡黃色至黃色，厚4.60～8.07 μm，由多亞層組成，無(wú)染色反應(yīng)。L3膜狀壁，厚<1.00 μm，在Melzer’s試劑中呈淡粉色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中被染成淺藍(lán)色至藍(lán)色。連孢菌絲透明至淡黃，圓筒形至漏斗形，偶爾略下彎，其壁與孢子壁L1和L2相連，菌絲有隔。

表5 施肥、樹齡和品種對(duì)AM和DSE真菌定殖結(jié)構(gòu)的方差分析

注：*表示顯著差異（<0.05）。

Note:*indicate significant difference (<0.05).

2.3.2 近明球囊霉屬（sp.） 編號(hào)OT-2-13（圖2B1～圖2B3），孢子透明至淡黃色，球形或近球形，大小為31.54～61.86 μm，平均為47.49 μm。孢子壁3層。L1層無(wú)色透明易脫落，厚度0.43～1.10 μm。L2透明至淡黃色，厚3.21～5.06 μm，由多亞層組成，在Melzer’s試劑中被染成黃色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中被染成藍(lán)色。L3為膜狀壁，透明至淡黃色，厚<1.00 μm，在Melzer’s試劑中被染成黃色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中被染成藍(lán)色。內(nèi)含物呈光滑透明無(wú)雜質(zhì)的油滴狀，在Melzer’s中會(huì)有絮狀的內(nèi)含物染上黃色。連點(diǎn)寬度3.25～ 4.03 μm，連孢菌絲呈圓柱形，菌絲壁透明，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中被染成藍(lán)色。

2.3.3 空洞無(wú)梗囊霉（） 編號(hào)CT-2-7（圖2C1～圖2C3），孢子球形至近球形，偶有橢圓形，大小為88.61～141.42 μm，平均108.51 μm，淡黃至黃棕色。孢子壁3層，L1易逝壁，無(wú)色透明，緊貼L2，乳酸酚棉藍(lán)試劑中有反應(yīng)。L2層狀壁，黃色至黃棕色，厚3.40～5.28 μm，有圓形或卵形凹坑紋飾，寬0.70～2.81 μm，深3.50 μm，坑與坑之間由脊分開，脊寬0.48～ 1.58 μm。乳酸酚棉藍(lán)試劑中有反應(yīng)。L3膜狀壁，無(wú)色透明，厚<1.00 μm，乳酸酚棉藍(lán)試劑中有反應(yīng)。發(fā)芽壁2層（GW1、GW2）。GW1膜狀，無(wú)色透明，乳酸酚棉藍(lán)試劑中有反應(yīng)。GW2膜狀，無(wú)色透明，雙層（GW2-L1、GW2-L2），GW2-L1膜狀，無(wú)色透明，厚<1.00 μm，有珠狀顆粒，Melzer’s試劑中無(wú)反應(yīng)，乳酸酚棉藍(lán)試劑中有反應(yīng)。GW2-L2膜狀，無(wú)色透明，厚<1.00 μm，Melzer’s試劑中染成紫紅色，乳酸酚棉藍(lán)試劑中有反應(yīng)。

2.3.4 蜜色無(wú)梗囊霉（） 編號(hào)CT-3-10（圖2D1～圖2D3），孢子形狀多為球形或近球形，大小為50.07～106.25 μm，平均80.00 μm，顏色為蜂蜜色至淡黃棕色。孢子壁2層，L1層狀壁，黃色，厚1.74～3.70 μm，外表光滑。L2膜狀壁，無(wú)色透明，厚度<1.00 μm，附著在L1上。發(fā)芽壁2層（GW1、GW2）。GW1膜狀壁，無(wú)色透明，半韌性，厚度<1.00 μm，孢子破裂后易皺。GW2兩層緊貼（GW2-L1、GW2-L2），GW2-L1無(wú)色透明，厚度<1.00 μm，有時(shí)表面有細(xì)小顆粒附著，GW2-L2具可塑性，無(wú)色透明，在Melzer’s試劑中染成紫紅色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中顯藍(lán)色。脫落痕直徑7.53 μm。

2.3.5 無(wú)梗囊霉屬（sp） 編號(hào)OT-4-3（圖2E1～圖2E4），孢子形狀多為球形或近球形，大小為53.92～101.72 μm，平均79.08 μm，顏色為淡黃色至淡棕色。孢子壁3層。L1外層，透明，厚1.00 μm，易吸附雜質(zhì)，有時(shí)脫落。L2層狀壁，淡黃色，厚2.47～3.18 μm。L3膜狀壁，無(wú)色透明，厚度<1.00 μm，很少與孢子壁完全分離。發(fā)芽壁2層（GW1、GW2）。GW1一層雙層膜狀壁，無(wú)色透明，兩層厚度基本相似，厚度<1.00 μm，通常兩層粘著似單層。GW2兩層，在Melzer’s中對(duì)比明顯。GW2-L1透明狀，厚度<1.00 μm，表面有細(xì)小顆粒附著，GW2-L2無(wú)色透明，無(wú)定形，在Melzer’s試劑中染成紅紫色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中顯藍(lán)色。

2.3.6 類球囊霉屬（sp） 編號(hào)OT-4-15（圖2F1～圖2F4），孢子球形至近球形，大小為40.39～75.88 μm，平均為53.23 μm，無(wú)色透明至淺黃色。孢子壁4層。L1（W1）易逝層，厚0.78～ 1.08 μm，無(wú)色透明，易黏附雜質(zhì)，緊貼L2，在Melzer’s試劑中染成淺黃色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中染成淺藍(lán)色。L2（W2）和L3（W3）層狀壁，由多個(gè)亞層組成，二者緊密相連，有時(shí)分開，厚3.10～5.22 μm，在Melzer’s試劑中變成橙黃色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中變成藍(lán)色，著色快。L4膜狀壁，厚<1.00 μm，在Melzer’s試劑中變成橙黃色，在乳酸酚棉藍(lán)試劑中變成藍(lán)色，著色快。連點(diǎn)呈圓筒狀，<10.00 μm。

2.4 AM真菌分子鑒定

對(duì)已純化的6種AM真菌進(jìn)行分子鑒定，所得序列在GenBank上進(jìn)行blast序列比對(duì)，并與相關(guān)菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。經(jīng)比對(duì)，編號(hào)OT-2-13和OT-4-15未鑒定出；CT-3-10與無(wú)梗囊霉屬（sp, MH424517.1）聚成一支，序列同源性為97%；而OT-4-3、CT-2-7與無(wú)梗囊霉屬（sp）聚在較大分支，三者間親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。CT-1-4與近明球囊霉屬（sp, MT378291.1）聚成一支，序列同源性為97%。將CT-3-10、OT-4-3、CT-2-7和CT-1-4的序列提交至NCBI GenkBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)分別為OL966069、OL966070、OL966067、OL966068。從鑒定結(jié)果可看出，近明球囊霉屬（sp）1種、無(wú)梗囊霉屬（sp）3種。相對(duì)于屬的分子鑒定，種的的分子鑒定可信度并不太高，因此最終要結(jié)合形態(tài)鑒定確定種類。

A為層狀近明球囊霉（CT-1-4），A1：水；A2：Melzer+PVLG試劑；A3：乳酸酚棉藍(lán)試劑。B為近明球囊霉屬（OT-2-13），B1：水；B2：Melzer試劑；B3：乳酸酚棉藍(lán)試劑。C為空洞無(wú)梗囊霉（CT-2-7），C1：水；C2：Melzer試劑；C3：乳酸酚棉藍(lán)試劑。D為蜜色無(wú)梗囊霉（CT-3-10），D1：水；D2：Melzer試劑；D3：乳酸酚棉藍(lán)試劑。E為無(wú)梗囊霉屬（OT-4-3），E1：水；E2：Melzer試劑；E3：乳酸酚棉藍(lán)試劑；E4：PVLG+Melzer試劑浸。F為類球囊霉屬（OT-4-15），F(xiàn)1：水；F2：Melzer試劑；F3：乳酸酚棉藍(lán)試劑；F4：PVLG+Melzer試劑。

圖3 基于18S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 芒果根際AM真菌種類

通過(guò)對(duì)芒果根際土壤進(jìn)行AM真菌的純化分離，從主要施用有機(jī)肥和主要施用化肥的2種肥料處理土壤中各分離得到3種AM真菌，在2種處理土壤中分離獲得的AM真菌孢子形態(tài)相似，但種類不同。目前尚未將AM真菌的分類類群與其功能屬性聯(lián)系起來(lái)[18]，即使同一個(gè)屬的AM真菌，其功能可能也會(huì)存在差異。純化得到的AM真菌屬數(shù)量較少，其原因可能有：（1）AM真菌對(duì)外界非生物因素響應(yīng)不同，如不同季節(jié)AM真菌群落組成不同；（2）一些孢子萌發(fā)侵染到根系后，土壤中孢子量減少，未能純化得到真菌孢子[19]；（3）部分AM真菌無(wú)法產(chǎn)孢；（4）孢子在不同階段或發(fā)生病變等原因?qū)е滦螒B(tài)鑒定困難[20]。AM真菌多樣性往往受宿主植物影響，二者間相互選擇，這與宿主植物基因型、根系形態(tài)及對(duì)AM真菌光合產(chǎn)物的分配密不可分。從芒果根際土壤中分離出來(lái)的優(yōu)勢(shì)種為無(wú)梗囊霉屬（sp），并未觀測(cè)到、等常見的AM真菌，這說(shuō)明與該地區(qū)芒果形成自然共生的AM真菌可能有別于其他常規(guī)作物。本研究中的采樣點(diǎn)以酸性土壤為主，VERESOGLOU等[21]研究表明無(wú)梗囊霉科（Acaulosporaceae）和巨孢囊霉科（Gigasporaceae）對(duì)酸性土壤環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，與本研究中分離出的無(wú)梗囊霉屬一致。王軍曉[22]通過(guò)濕篩傾析法從棗樹根際土壤中分離獲得AM真菌孢子，通過(guò)形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn)也有近明球囊霉屬（）、無(wú)梗囊霉屬（）和類球囊霉屬（）3種，而通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)果表明，球囊霉屬（）的相對(duì)豐度較高，其次為盾巨孢囊霉屬（）。其原因可能是有些AM真菌產(chǎn)孢較少。JIANG等[23]對(duì)芒果根際土壤的AM真菌進(jìn)行高通量測(cè)序，得到其優(yōu)勢(shì)種為球囊霉屬（），其次為類球囊霉屬（），同時(shí)包括近明球囊霉屬（）和無(wú)梗囊霉屬（），但豐度較低。此外，前人在桑樹[24]、葡萄[25]、香蕉[26]、核桃[27]、橘[28]、樹莓和黑莓[29]等果樹根際土壤中也分離得到無(wú)梗囊霉屬（）、近明球囊霉屬（）、類球囊霉屬（）等AM真菌。由此可見從芒果根際土壤中分離出的AM真菌在屬水平上具有普遍性。本研究分離出的芒果土著AM真菌為篩選果樹高效AM真菌菌劑提供了一定基礎(chǔ)，對(duì)將來(lái)開發(fā)生物菌劑具有重要的實(shí)踐意義。

3.2 施肥種類對(duì)芒果AM真菌侵染的影響

在果園生態(tài)系統(tǒng)中，微生物調(diào)控許多過(guò)程，包括養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解、土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定等。其中AM真菌在土壤團(tuán)聚體形成和碳固存中起著重要作用[30]。AM真菌還可促進(jìn)果樹樹體養(yǎng)分吸收及抗脅迫能力。因此，強(qiáng)化生態(tài)系統(tǒng)中關(guān)鍵微生物——AM真菌的作用對(duì)果園具有重要意義，果園管理應(yīng)該向促進(jìn)果樹與AM真菌共生的方向發(fā)展。當(dāng)AM真菌在肥力良好環(huán)境中，會(huì)形成較多叢枝和泡囊吸收養(yǎng)分；而肥力較低時(shí)，AM真菌會(huì)形成較少泡囊和菌絲圈吸收和儲(chǔ)存能量[31]。前人研究表明，果園集約化管理降低了土壤微生物多樣性，有機(jī)肥的適度施用可以提高果園生態(tài)多樣性，也有利于提高AM真菌多樣性和豐富度[2]。本研究通過(guò)根系染色發(fā)現(xiàn)OT處理菌絲分布較多，AM真菌結(jié)構(gòu)豐富，可明顯觀察到叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)，方差分析顯示OT處理的AM真菌根外菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)顯著高于CT處理，進(jìn)一步印證了前人的結(jié)論[31]。但對(duì)于AM真菌總定殖率，2種施肥處理間并無(wú)顯著差異，這可能與不同芒果品種和樹齡有關(guān)。已有報(bào)道桑[32]和枸杞[33]根系的AM真菌群落α-多樣性受品種影響，蔡邦平等[34]研究表明根圍土壤AM真菌種類或孢子密度與宿主植物的生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)。溫苗等[35]的研究結(jié)果也表明隨著樹齡的增加，根系A(chǔ)M真菌菌絲侵染率先上升后下降，而叢枝侵染率逐漸下降，泡囊侵染率無(wú)明顯變化。DSE是一類生長(zhǎng)在植物根部且可以在體外培養(yǎng)的共生真菌，它與AM真菌功能相似，在植物根系與AM真菌共享生態(tài)位。本研究中DSE侵染強(qiáng)度與AM真菌侵染強(qiáng)度在OT和CT處理中的表現(xiàn)恰恰相反，這與歐陽(yáng)瑞培等[36]的結(jié)果一致。其原因可能是土壤條件與氣候的限制，或者是定殖的優(yōu)先性。另已有研究表明DSE可以改變植物的菌根狀態(tài)，調(diào)節(jié)根際的不同共生狀態(tài)[37]。以上結(jié)果說(shuō)明施用有機(jī)肥對(duì)AM真菌的定殖可能具有促進(jìn)作用，但AM真菌與有機(jī)質(zhì)的相互影響機(jī)制目前尚未完全解析，有機(jī)肥對(duì)AM真菌的調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

綜上，芒果根際土壤中共分離出3屬6種AM真菌孢子，但未來(lái)仍需深入研究不同種/屬的AM真菌改善果樹養(yǎng)分吸收及抗逆功能大小。通過(guò)調(diào)查不同施肥處理的芒果根系A(chǔ)M真菌侵染狀況發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥較化肥顯著促進(jìn)AM真菌根外菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)的形成，這對(duì)AM真菌促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收有重要意義，芒果樹齡和品種對(duì)根外菌絲、孢子密度也有顯著影響。本研究中芒果土著AM真菌的分離對(duì)開發(fā)生物菌劑具有重要的實(shí)踐意義，并為篩選果樹高效AM真菌菌劑提供基礎(chǔ)，也為果園管理提供了新方向。

[1] 胡小璇. 芒果有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施效果及有機(jī)肥氮素有效性初探[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020.

HU X X. Study on the effect of combined application of organic and inorganic fertilizers on mango and nitrogen availability of organic fertilizer[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2020. (in Chinese)

[2] BERRUTI A, LUMINI E, BALESTRINI R, BIANCIOTTO V. Arbuscular mycorrhizal fungi as natural biofertilizers: let’s benefit from past successes[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 6: 1559.

[3] 劉洪章, 遲麗華, 圖力古爾, 李 玉. 叢枝菌根真菌資源及其在果樹上的應(yīng)用[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002(2): 50-55.

LIU H Z, CHI L H, TOLGOR, LI Y. AM (arbuscular-mycorrhizas) fungi resources and their applcation in fruit trees[J]. Journal of Jilin Agricultural University, 2002(2): 50-55. (in Chinese)

[4] DOWARAH B, GILL S S, AGARWALA N. Arbuscular mycorrhizal fungi in conferring tolerance to biotic stresses in plants[J]. Journal of Plant Growth Regulation, 2021(2): 1-16.

[5] WIPF D, KRAJINSKI F, VAN TUINEN D, RECORBET G, COURTY P E. Trading on the arbuscular mycorrhiza market: from arbuscules to common mycorrhizal networks[J]. New Phytologist, 2019, 223(3): 1127-1142.

[6] 李嬌嬌. 叢枝菌根真菌對(duì)干旱脅迫下梨樹幼苗生長(zhǎng)以及抗旱性的影響[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2021.

LI J J. Effect of arbuscular mycorrhizal fungi on growth and drought resistance of pear seedlings under water stress[D]. Chongqing: Southwest University, 2021. (in Chinese)

[7] 張敏瑜, 王明元, 侯式貞, 劉建福, 林 萍, 李雨晴. 接種叢枝菌根真菌對(duì)柑橘生長(zhǎng)與次生代謝的影響[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2020, 28(1): 78-83.

ZHANG M Y, WANG M Y, HOU S Z, LIU J F, LIN P, LI Y Q. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on plant growth and secondary metabolism in[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2020, 28(1): 78-83. (in Chinese)

[8] 王幼珊, 劉潤(rùn)進(jìn). 球囊菌門叢枝菌根真菌最新分類系統(tǒng)菌種名錄[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2017, 36(7): 820-850.

WANG Y S, LIU R J. A checklist of arbuscular mycorrhizal fungi in the recent taxonomic system of Glomeromycota[J]. Mycosystema, 2017, 36(7): 820-850. (in Chinese)

[9] 張貴云. 不同農(nóng)業(yè)措施對(duì)叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)和侵染效應(yīng)的影響[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

ZHANG G Y. Effects of different agricultural practices on community structure and colonization rate of arbuscular mycorrhizal fungi[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[10] BANERJEE S, WALDER F, BUCHI L, MEYER M, HELD A Y, GATTINGER A, KELLER T, CHARLES R, VAN DER HEIJDEN M G A. Agricultural intensification reduces microbial network complexity and the abundance of keystone taxa in roots[J]. The ISME Journal, 2019, 13(7): 1722-1736.

[11] WINDISCH S, SOMMERMANN L, BABIN D, CHOWDHURY S P, GROSCH R, MORADTALAB N, WALKER F, HOGLINGER B, EL-HASAN A, ARMBRUSTER W, NESME J, SORENSE S J, SCHELLENBERG I, GEISTLINGER J, SMALLA K, ROTHBALLER M, LUDEWIG U, NEUMANN G. Impact of long-term organic and mineral fertilization on rhizosphere metabolites, root-microbial interactions and plant health of lettuce[J]. Frontiers in Microbiology, 2021(11): 3157.

[12] 廖 楠, 張金蓮, 李冬萍, 汪 茜, 龍艷艷, 譚裕模, 李 松, 陸祖軍, 陳廷速. 甘蔗根系內(nèi)生真菌染色方法探討[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 29(4): 814-819.

LIAO N, ZHANG J L, LI D P, WANG Q, LONG Y Y, TAN Y M, LI S, LU Z J, CHEN T S. Method to stain endophytic fungi in sugarcane roots[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2016, 29(4): 814-819. (in Chinese)

[13] 汪 茜, 龍艷艷, 李冬萍, 張金蓮, 宋 娟, 周生茂, 車江旅, 陳廷速. 5種染色劑對(duì)生姜根系叢枝菌根(AM)真菌的染色效果比較[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 46(8): 1425-1429.

WANG Q, LONG Y Y, LI D P, ZHANG J L, SONG J, ZHOU S M, CHE J L, CHEN T S. Staining effects of five stains on arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in ginger roots[J]. Journal of Southern Agriculture, 2015, 46(8): 1425-1429. (in Chinese)

[14] 汪 茜, 張金蓮, 龍艷艷, 李冬萍, 陳廷速, 車江旅. 廣西柳江生姜根際土壤叢枝菌根真菌資源研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 29(1): 115-119.

WANG Q, ZHANG J L, LONG Y Y, LI D P, CHEN T S, CHE J L. Resources of arbuscular mycorrhizal fungi in ginger fields of Liujiang, Guangxi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2016, 29(1): 115-119. (in Chinese)

[15] 駱禮華, 姚劉斌, 江 龍. 雙重培養(yǎng)體系中AM真菌孢子的種類鑒定[J]. 貴州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 34(5): 38-42.

LUO L H, YAO L B, JIANG L. Species identification of AM fungal spores from dual culture system[J]. Journal of Guizhou University (Natural Sciences), 2017, 34(5): 38-42. (in Chinese)

[16] SCHWARZOTT D, SCHUSSLER A. A simple and reliable method for SSU rRNA gene DNA extraction, amplification, and cloning from single AM fungal spores[J]. Mycorrhiza, 2001, 10(4): 203-207.

[17] LEE J, LEE S, YOUNG J P W. Improved PCR primers for the detection and identification of arbuscular mycorrhizal fungi[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2008, 65(2): 339-349.

[18] MUNKVOLD L, KJOLLER R, VESTBERG M, ROSENDAHL S, JAKOBSEN I. High functional diversity within species of arbuscular mycorrhizal fungi[J]. New Phytologist, 2004, 164(2): 357-364.

[19] KLAMER M, ROBERTS M S, LEVINE L H, DRAKE B G, GARLAND J L. Influence of elevated CO2on the fungal community in a coastal scrub oak forest soil investigated with terminal-restriction fragment length polymorphism analysis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(9): 4370-4376.

[20] 王化秋, 程 巍, 郝 俊, 毛圓圓, 盧 綺, 古天岳, 李棟恒. 貴州煤矸石山香根草根系及根際土叢枝菌根真菌(AMF)群落的季節(jié)動(dòng)態(tài)研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2021, 40(3): 514-530.

WANG H Q, CHENG W, HAO J, MAO Y Y, LU Q, GU T Y, LI D H. Seasonal dynamic changes of community of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in root system and rhizosphere soil ofin coal gangue in Guizhou of Southwest China[J]. Mycosystema, 2021, 40(3): 514-530. (in Chinese)

[21] VERESOGLOU S D, CARUSO T, RILLIG M C. Modelling the environmental and soil factors that shape the niches of two common arbuscular mycorrhizal fungal families[J]. Plant and Soil, 2013, 368(1/2): 507-518.

[22] 王軍曉. 設(shè)施栽培條件下棗園叢枝菌根真菌多樣性研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2021.

WANG J X. Arbuscular mycorrhizal fungal diversity in jujube orchard under facility cultivation[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2021. (in Chinese)

[23] JIANG S T, HU X X, KANG Y L, XIE C Y, AN X R, DONG C X, XU Y C, SHEN Q R. Arbuscular mycorrhizal fungal communities in the rhizospheric soil of litchi and mango orchards as affected by geographic distance, soil properties and manure input[J]. Applied Soil Ecology, 2020, 152: 103593.

[24] 鄭亞茹. 桑樹根際叢枝菌根真菌(AMF)多樣性及對(duì)宿主耐鹽性的影響[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2021.

ZHENG Y R. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in mulberry rhizosphere and its effect on salt tolerance of hosts[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2021. (in Chinese)

[25] 屈雁朋. 西北地區(qū)葡萄園AM真菌的篩選、鑒定和接種效應(yīng)[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2009.

QU Y P. The screening, identification of arbuscular mycorrhizal fungi from the vineyards in Northwestern China and the effects of promotion[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2009. (in Chinese)

[26] 李嵐嵐. 海南香大蕉根際叢枝菌根真菌及菌根化蕉苗對(duì)枯萎病的防效研究[D]. ?？? 海南大學(xué), 2015.

LI L L. Researches on arbuscualr mycorrhiza fungi at the rhizosphere ofspp. on Hainan island and efficacy of mycorrhiza of banana seedlings towilt disease of banana[D]. Haikou: Hainan University, 2015. (in Chinese)

[27] 李榮波, 景躍波, 卯吉華, 寧德魯. 云南核桃不同套種模式根際叢枝菌根真菌多樣性[J]. 北方園藝, 2021(5): 84-93.

LI R B, JING Y B, MAO J H, NING D L. Arbuscular mycorrhizal fungi diversity of walnut orchards in Yunnan under different intercropping systems[J]. Northern Horticulture, 2021(5): 84-93. (in Chinese)

[28] 張錦娟. 黃棕壤橘園叢枝菌根真菌多樣性的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

ZHANG J J. The diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in yellow-brown soil citrus orchards[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2010. (in Chinese)

[29] 王少峰. 樹莓和黑莓根際AM真菌生態(tài)學(xué)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2006.

WANG S F. Study on the ecology of arbuscular mycorrhizal fungi from the rhizospere of raspberry and blackberry[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2006. (in Chinese)

[30] MORRIS E K, MORRIS D J P, VOGT S, GLEBER S C, BIGALKE M, WILCKE W, RILLIG M C. Visualizing the dynamics of soil aggregation as affected by arbuscular mycorrhizal fungi[J]. The ISME Journal, 2019, 13(7): 1639-1646.

[31] 張淑容, 賀學(xué)禮, 徐浩博, 劉春卯, 牛 凱. 蒙古沙冬青根圍AM和DSE真菌與土壤因子的相關(guān)性研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2013, 33(9): 1891-1897.

ZHANG S R, HE X L, XU H B, LIU C M, NIU K. Correlation study of AM and DSE fungi and soil factors in the rhizosphere of[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2013, 33(9): 1891-1897. (in Chinese)

[32] 溫 苗. 四川主栽桑樹品種和土壤因子對(duì)桑園AMF群落的影響[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2020.

WEN M. Effects of major mulberry cultivars and soil factors on arbuscular mycorrhizal fungal community in Sichuan[D]. Chongqing: Southwest University, 2020. (in Chinese)

[33] 呂 燕, 劉建利, 李靖宇, 候琳琳, 孫 敏, 茍 琪. 不同品種和產(chǎn)區(qū)寧夏枸杞根系A(chǔ)MF多樣性[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2021, 37(6): 36-48.

LV Y, LIU J L, LI J Y, HOU L L, SUN M, GOU Q. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi inhabiting the roots ofin different varieties and cultivation regions[J]. Biotechnology Bulletin, 2021, 37(6): 36-48. (in Chinese)

[34] 蔡邦平, 陳俊愉, 張啟翔, 郭良棟. 云南昆明梅花品種根圍叢枝菌根真菌多樣性研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(S1): 38-41.

CAI B P, CHEN J Y, ZHANG Q X, GUO L D. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi associated within Kunming, Yunnan, China[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2013, 35(S1): 38-41. (in Chinese)

[35] 溫 苗, 施松梅, 羅 協(xié), 何新華, 徐云飛, 胥 曉. 不同樹齡桑園叢枝菌根侵染、球囊霉素土層分布及與土壤因子的關(guān)系[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2020, 26(5): 1138-1146.

WEN M, SHI S M, LUO X, HE X H, XU Y F, XU X. Relationships between spatial distribution of arbuscular mycorrhizal colonization, glomalin-related soil protein, and rhizhospheric soil chemical properties under different aged mulberry orchards[J]. Chin Journal of Applied and Environment Biology, 2020, 26(5): 1138-1146. (in Chinese)

[36] 歐陽(yáng)瑞培, 姚慶智, 石俊庭, 梁秀雪. 艾蒿根系共生真菌與土壤理化因子的相關(guān)性分析[J]. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2021, 49(2): 49-55.

OUYANG R P, YAO Q Z, SHI J T, LIANG X X. Correlation analysis of root symbiotic fungi ofand soil physical and chemical factors[J]. Journal of Northern Agriculture, 2021, 49(2): 49-55. (in Chinese)

[37] SCERVINO J M, GOTTLIEB A, SILVANI V A, PERGOLA M, FERNANDEZ L, GODEAS A M. Exudates of dark septate endophyte (DSE) modulate the development of the arbuscular mycorrhizal fungus (AMF)[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41(8): 1753-1756.

Resources of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Rhizosphere Soil of Mango Trees in Baise, Guangxi, China

LI Han1, JIANG Shangtao1, PENG Haiying1, GAO Rifang2, ZHANG Jinlian2*, LI Dongping2, JIANG Rou1, DONG Caixia1, CHEN Tingsu2*

1. College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricutural University / Jiangsu Provincial Key Lab of Solid Organic Waste Utilization / Jiangsu Collaborative Innovation Center of Solid Organic Wastes / Educational Ministry Engineering Center of Resource-Saving Fertilizers, Nanjing, Jiangsu 210095, China; 2. Microbiology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China

In order to find out the distribution of AM fungi in the mango rhizosphere soil in Baise City, Guangxi, AM fungi were isolated from the rhizosphere soil and root samples from the main mango producing areas with both main application of organic fertilizers and main application of chemical fertilizer in Baise, Guangxi, and the species and infection of AM fungi under different fertilization regimes were compared. The rhizosphere soils of 5 mango orchards with the main application of organic fertilizer (OT) and 5 mango orchards with the main application of chemical fertilizer (CT) were collected. The AM fungi spores in the soil were isolated by the wet sieve decantation method, and the AM fungi in them were purified by enrichment and induction culture. The spores were identified molecularly and morphologically. The root samples were stained by the ink-vinegar solution staining method and the infection rate of endophytic fungi was determined. Six spore species of AM fungi were identified in the soil samples. Three AM fungal spores including one, oneand onewere identified in OT-treated soil samples. Three AM fungal spores including two, onewere identified in CT-treated soil samples. Few species of AM fungi were isolated from the two fertilization systems, and the isolated species of AM fungi were relatively common, with no endemic species. Root staining showed that OT treatment had more hyphae, AM fungal structures were abundant, arbuscular and vesicle structures could be clearly observed, and a small amount of dark septate endophytes (DSE) were also found. CT treatment had relatively few hyphae, with less vesicular structures and arbuscules, and relatively more DSE. Analysis of variance (ANOVA) revealed that the colonization rate of extraradical hyphae, vesicle structure and spore density were affected by fertilization regime, mango variety and tree ages to a different extent. OT treatment had higher rates of extraradical hyphae and vesicle structure than those of CT treatment. In summary, the AM fungi isolated in this study enriched the AM fungal strain library in China, which would provide a basis for selecting high-efficiency AM fungal inoculants for fruit trees and a new direction for orchard management.

mango; rhizosphere; soil; arbuscular mycorrhizal fungi

S667.7；S154.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.018

2022-03-09；

2022-05-10

廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD20159001）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2017YFD0202101）。

栗 晗（1998—），女，碩士研究生，研究方向：果樹營(yíng)養(yǎng)與根際調(diào)控。*通信作者（Corresponding author）：張金蓮（ZHANG Jinlian），E-mail：zhangjinlian1@126.com；陳廷速（CHEN Tingsu），E-mail：2831404955@qq.com。