趙鑫茹，莫映熙，李界秋，蒙姣榮*

桑樹基因的表達(dá)模式分析及原核表達(dá)

趙鑫茹1，莫映熙1，李界秋2，蒙姣榮1*

1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530005；2. 廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西南寧 530005

泛素結(jié)合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）在植物中具有重要的作用，參與植物的生長發(fā)育、逆境脅迫、免疫響應(yīng)等生理活動(dòng)。本課題組前期通過分析桑脈帶相關(guān)病毒（, MVBaV）侵染的桑樹品種‘桂桑優(yōu)62號(hào)’（）轉(zhuǎn)錄組獲得了上調(diào)表達(dá)的基因。為探究泛素結(jié)合酶基因的功能，本研究以‘桂桑優(yōu)62號(hào)’桑樹為材料，克隆的CDS序列進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)獲得該蛋白。結(jié)果顯示，編碼區(qū)全長為567 bp，編碼蛋白含188個(gè)氨基酸，大小為21.03 kDa，屬于親水、酸性、不穩(wěn)定的核定位蛋白，具有保守的UBC結(jié)構(gòu)域。將其氨基酸序列與其他物種的UBC氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)MaUBCC與川桑MnUBCC的相似性最高為98.40%，且具有最近的進(jìn)化親緣關(guān)系。熒光定量PCR分析基因表達(dá)模式，結(jié)果顯示在桑苗的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在根部表達(dá)量最高，分別是莖和葉的1.24倍和1.71倍；對(duì)外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）和非生物脅迫（低溫、高溫、高鹽、干旱）處理均產(chǎn)生響應(yīng)，且在ABA和MeJA處理下表現(xiàn)出顯著上調(diào)，在24 h時(shí)的表達(dá)量分別為正常水平的29.55、9.05倍，推測(cè)在桑樹的生長發(fā)育中具有廣泛的調(diào)控作用，參與桑樹的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì)非生物脅迫的防御反應(yīng)。利用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，0.5 mmol/L IPTG在37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得約為25 kDa的融合蛋白，與預(yù)期大小相符，為今后進(jìn)行基因功能研究提供了基礎(chǔ)材料。本研究為進(jìn)一步探究桑樹泛素蛋白酶體途徑的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

桑樹；泛素結(jié)合酶；表達(dá)模式；原核表達(dá)

泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是植物體內(nèi)功能最廣泛的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)，它既可以去除大部分異常和短壽命的多肽和蛋白質(zhì)，也可以調(diào)節(jié)它們的活性，以維持植物的正常生長[1]。該系統(tǒng)由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶E1（ubiquitin-activating enzyme, UBA）、泛素結(jié)合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）、泛素連接酶E3（ubiquitin-ligase）、26S蛋白酶體（proteasome）組成[2]。泛素結(jié)合酶E2在這個(gè)系統(tǒng)中具有“橋梁”的作用，它在E3的協(xié)助下，接受被E1活化的泛素，并將其轉(zhuǎn)移到靶蛋白上[3]。E2大小不等，但每個(gè)E2都有140～200個(gè)氨基酸形成的UBC保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)UBC的兩端是否有延伸將分為4類，只有UBC結(jié)構(gòu)域的E2為第Ⅰ類，不僅含有UBC結(jié)構(gòu)域且N端有延伸的為第Ⅱ類，C端有延伸的為第Ⅲ類，兩端都有延伸的為第Ⅳ類[4]。

泛素結(jié)合酶E2已經(jīng)被證實(shí)參與植物的許多生理反應(yīng)，與植物的生長發(fā)育息息相關(guān)。CUI等[5]研究擬南芥的得出該基因受到氧化脅迫的誘導(dǎo)，參與植物的氧化脅迫反應(yīng)。擬南芥中的被證實(shí)除參與植物生長發(fā)育外，還與其生物脅迫響應(yīng)有關(guān)。WANG等[6-7]通過對(duì)比擬南芥突變體和野生型發(fā)現(xiàn)影響著雌配子體的形成，后續(xù)又發(fā)現(xiàn)影響擬南芥的形態(tài)，且突變體一定程度上提高了擬南芥對(duì)灰霉病菌的抗性。大豆泛素結(jié)合酶在擬南芥中異源表達(dá)可提高種子的重量和氨基酸的含量[8]。李興涵等[9]利用RNAi技術(shù)降低萊茵衣藻泛素結(jié)合酶的表達(dá)量獲得轉(zhuǎn)基因藻株發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶參與缺氮、缺磷脅迫響應(yīng)，正向調(diào)控油脂積累。沉默煙草中馬鈴薯的同源基因后可降低煙草對(duì)晚疫病菌的抗性[10]。DIAO等[11]對(duì)荷花進(jìn)行非生物脅迫和外源激素處理后發(fā)現(xiàn)表達(dá)量都有顯著變化，表明可能參與荷花的非生物脅迫和激素調(diào)節(jié)。

桑樹（spp.）具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，桑葉、桑木可作藥材，桑葉可作蠶的飼料，桑葚可以直接食用也可加工制成其他食品，并且桑樹本身還具有很高的環(huán)保效益。川桑（）基因組測(cè)序的工作已經(jīng)完成[12]，但目前關(guān)于桑樹中泛素結(jié)合酶E2的研究和報(bào)道較少。前期研究中，我們對(duì)桑脈帶相關(guān)病毒（, MVBaV）侵染的桑樹品種‘桂桑優(yōu)62’（）轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，獲得上調(diào)表達(dá)基因。本研究從‘桂桑優(yōu)62’克隆了，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR研究其不同組織中和在外源激素、非生物脅迫下的表達(dá)情況，分析在桑樹中的作用，通過原核表達(dá)獲得該蛋白，以期為泛素蛋白酶體途徑在桑樹中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為桑樹‘桂桑優(yōu)62號(hào)’，種植于溫度25℃、濕度70%的人工氣候培養(yǎng)室?？俁NA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司，高保真酶PrimeSTAR?HS（Premix）購自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?II Q RT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）、質(zhì)粒提取試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、熒光定量PCR試劑盒ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix、普通PCR酶2 × RapidMaster Mix均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，克隆試劑盒pEASY- Blunt Zero Cloning Kit和pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、PVDF膜購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，小鼠抗His-Tag單克隆抗體購于百遠(yuǎn)生物公司，山羊抗小鼠IgG抗體購于碧云天生物公司，引物合成于擎科梓熙生物科技有限公司，測(cè)序工作由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 桑幼苗種植管理及處理 將桑苗培養(yǎng)至6～7葉期，選取長勢(shì)一致的桑苗進(jìn)行外源激素和非生物脅迫處理。外源激素處理：用100 μmol/L水楊酸（salicylic acid, SA）、赤霉素（gibberellin, GA）、脫落酸（abscisic acid, ABA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）對(duì)桑苗葉片進(jìn)行噴灑至飽和。非生物脅迫處理：將桑苗置于4、42℃光照培養(yǎng)箱設(shè)為低溫和高溫處理；將桑苗根部浸泡于10% PEG 6000溶液和100 mmol/L NaCl溶液，設(shè)為干旱和高鹽處理。分別于每種處理后的0、1、6、12、24 h時(shí)采集葉片，提取總RNA，用于后續(xù)基因在外源激素和非生物脅迫處理下表達(dá)模式的分析。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 根據(jù)天根公司總RNA提取試劑盒的說明書提取健康桑葉和MVBaV侵染桑葉、桑苗的不同組織（根、莖、葉）和不同處理下桑葉或桑根的總RNA。通過超微量核酸蛋白分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度。根據(jù)南京諾唯贊公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書對(duì)桑樹總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個(gè)反應(yīng)加入總RNA 500 ng，最終體系為20 μL，最后獲得cDNA，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3基因編碼區(qū)的克隆根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的桑樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)克隆編碼區(qū)的特異性引物（表1）。以6～7葉期桑苗葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增的ORF序列，反應(yīng)體系：高保真酶25.0 μL，上游引物-F和下游引物-R（0.01 mol/L）各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 19.0 μL，共50.0 μL。將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒將其純化回收，按目的基因與載體片段7∶1的摩爾比例，將目的基因連接到-Blunt Zero載體上，使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含Kan抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～24 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究所用引物

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件分析MaUBC-C的結(jié)構(gòu)域，Plant-mPLoc（http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位情況。通過ProtParam （https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析MaUBC-C蛋白的理化性質(zhì)，ExPaSy-SOPMA （https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https: //swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件預(yù)測(cè)MaUBC-C蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。SignalP-5.0 Serve r（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHM M Server v. 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）、Protscale（https://web. expasy.org/ protscale/）在線軟件分析蛋白疏水性N端信號(hào)肽，預(yù)測(cè)蛋白的跨膜和疏水情況。在NCBI上進(jìn)行MaUBC-C進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，獲得MaUBC-C同源蛋白序列。使用DNAMAN對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，再通過MEGA 7軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)的ORF序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）的特異性引物（表1），選用桑樹α-tubulin作為內(nèi)參基因（表1），采用SYBR Green法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1.0 μL，上、下游引物（0.01 mol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，共20.0 μL。擴(kuò)增時(shí)，選擇3步法：95℃ 10 s，4.4℃/s；60℃ 15 s，2.2℃/s，72℃ 10 s，4.4℃/s，采集方式為Single，循環(huán)45次。每種處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)再設(shè)3個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。利用2–ΔΔCT法計(jì)算出在MVBaV侵染桑葉、桑苗不同組織和不同處理?xiàng)l件下0、1、6、12、24 h表達(dá)量。

1.2.6原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以克隆質(zhì)粒-Blunt Zero-為模板，設(shè)計(jì)帶有原核表達(dá)載體pET-30α接頭的引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。利用限制性內(nèi)切酶HⅠ、dⅢ酶切獲得線性pET-30a。根據(jù)全式金無縫克隆試劑盒的說明書進(jìn)行操作，將目的基因與線性載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，并進(jìn)行菌落PCR、酶切鑒定和測(cè)序。

1.2.7的誘導(dǎo)和免疫印跡分析 將過夜培養(yǎng)的菌液擴(kuò)大50倍培養(yǎng)，以37℃、200 r/min條件繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)600為0.4～0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，開始進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件為37℃、200 r/min。在誘導(dǎo)時(shí)間1、2、3、4、5、6 h時(shí)收集菌液2.0 mL，離心后用1.0 mL pH為7.4的無菌PBS洗滌3次。最后加入500 μL PBS溶解，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)情況。為進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白的表達(dá)情況，將誘導(dǎo)蛋白通過半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用小鼠抗His單克隆抗體為一抗、山羊抗小鼠IgG抗體為二抗進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaUBC-C基因的序列分析

以提取桑樹葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，-F/R為引物擴(kuò)增獲得的開放閱讀框架（ORF）序列，測(cè)序結(jié)果顯示ORF長為567 bp，預(yù)測(cè)編碼含188個(gè)氨基酸的蛋白。通過NCBI對(duì)的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與川桑的核酸序列高度一致，為98.40%；通過SMART在線網(wǎng)站對(duì)MaUBC-C氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示MaUBC-C含有1個(gè)保守的UBC結(jié)構(gòu)域，且兩端有延伸，屬于第Ⅳ類E2結(jié)合酶（圖1A），因此將候選基因命名為（GenBank號(hào)為：OL982612）。

ProtParam在線軟件分析MaUBC-C氨基酸序列得出，MaUBC C蛋白分子式為C935H1441N243O289S10，分子量大小為21.03 kDa，等電點(diǎn)為5.07，親水性為-0.441，脂肪指數(shù)為70.05，不穩(wěn)定指數(shù)64.12，為酸性不穩(wěn)定蛋白。ExPaSy- SOPMA預(yù)測(cè)MaUBC-C蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示MaUBC-C蛋白含有34.57%的α-螺旋結(jié)構(gòu)、16.49%的延伸連結(jié)構(gòu)、1.60%的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)、47.34%的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（圖1B）。利用SWISS- MODEL預(yù)測(cè)得出MaUBC-C蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示其與人類的泛素結(jié)合酶UBCH10具有很高的相似性（圖1C）。通過SignalP分析顯示，MaUBC-C并不包含信號(hào)肽，表明MaUBC-C不屬于分泌型蛋白。TMHMM、Protscale分析得出其是一個(gè)不含跨膜結(jié)構(gòu)的親水蛋白。Plant-mPLoc預(yù)測(cè)MaUBC-C定位在細(xì)胞核。

紅色：延伸鏈結(jié)構(gòu)；紫色：無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；藍(lán)色：α-螺旋結(jié)構(gòu)；綠色：β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.2 MaUBC-C蛋白同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTp對(duì)MaUBC-C氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)MaUBC-C與川桑（）、核桃（）、楊梅（）、大麻（）、棗樹（）、梨（×、蘋果（）、桃（）、山黃麻（）、月季（）等多種高等植物的E2蛋白高度同源，其氨基酸序列與MaUBC-C的一致性為84.46%以上，其中與川桑MnUBC-C一致性最高為98.40%，其他依次是山黃麻ToUBC-C（91.10%）、大麻CsUBC-C（88.02%）、桃PpUBC-C（86.91%）、月季RcUBC-C（86.70%）、梨PbUBC- C（86.39%）、蘋果MdUBC-C（85.86%）、棗樹ZjUBC-C（85.86%），與核桃JrUBC-C、楊梅MrUBC19的一致性最低，均為84.46%（圖2）。將這些序列共同導(dǎo)入DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示這11個(gè)物種的泛素結(jié)合酶都含有UBC保守結(jié)構(gòu)域，這表明E2蛋白在進(jìn)化過程中比較保守。

紅色劃線部分為UBC保守結(jié)構(gòu)域。

利用MEGA 7軟件構(gòu)建這11個(gè)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為兩大支，梨PbUBC-C、蘋果MdUBC-C、桃PpUBC-C、月季RcUBC-C、棗樹ZjUBC-C、核桃JrUBC-C、楊梅MrUBC19聚為一支，大麻CsUBC-C、山黃麻ToUBC-C、川桑MaUBC-C聚為一支。MaUBC-C與大麻CsUBC-C、山黃麻ToUBC-C、川桑MnUBC-C的親緣性更近；MaUBC-C和川桑MnUBC-C單獨(dú)聚為一小支，MaUBC-C和川桑MnUBC-C的親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.3 MaUBC-C的表達(dá)模式分析

2.3.1的組織表達(dá)分析 以提取6～7葉期桑苗根、莖、葉的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用qPCR檢測(cè)在不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示，在根、莖、葉組織中均有表達(dá)，在根部的表達(dá)量最高，是莖、葉的1.24、1.71倍。

2.3.2 MVBaV侵染對(duì)表達(dá)的影響 以健康桑葉為對(duì)照，利用qPCR檢測(cè)MVBaV侵染桑葉的表達(dá)量，結(jié)果顯示，在MVBaV侵染的桑葉種的表達(dá)量顯著上調(diào)，為健康葉片的4.26倍（圖5），與本課題組前期對(duì)健康桑樹轉(zhuǎn)錄組和MVBaV侵染桑樹的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

圖3 MaUBC-C蛋白與其他植物E2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.3.3 外源激素處理下的表達(dá)量分析 對(duì)6～7葉期桑苗進(jìn)行外源激素（SA、GA、ABA、MeJA）處理，通過熒光定量PCR檢測(cè)其表達(dá)量。結(jié)果顯示，的表達(dá)量在不同外源激素的處理后呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。在ABA處理后，的表達(dá)量整體呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)模式，1 h時(shí)表達(dá)量高于正常水平，為0 h的3.06倍，隨著ABA處理時(shí)間的增長，表達(dá)量不斷增高，在24 h表達(dá)量到達(dá)最大值，為正常水平的29.55倍。在GA處理的1 h時(shí)，表達(dá)量下降為0 h的0.45倍，而隨著時(shí)間的延長，表達(dá)量與0 h時(shí)相比變化并不顯著，6、12、24 h時(shí)表達(dá)量分別為0 h的1.17、1.00、0.82倍。在MeJA處理后，表達(dá)量變化趨勢(shì)與ABA處理后相同，整體呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，在24 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的9.05倍。在SA處理后，1 h時(shí)表達(dá)量降低，為正常水平的0.66倍，6 h時(shí)表達(dá)量與1 h相比并無顯著差異，為正常水平的0.68倍，12 h時(shí)，表達(dá)量上調(diào)到正常水平的2.19倍，24 h時(shí)表達(dá)量略有下降，為0 h的1.91倍。以上表明可能參與桑樹的激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑（圖6）。

**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）；**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

2.3.4 非生物脅迫下的表達(dá)量分析將6～7葉期的桑苗分別進(jìn)行低溫、高溫、高鹽、干旱非生物脅迫處理，通過熒光定量PCR分析在不同非生物脅迫下的表達(dá)情況。在低溫處理下，整體呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，在1、6、12、24 h的表達(dá)量均低于正常水平，1 h時(shí)表達(dá)量為0 h的0.62倍，隨后表達(dá)量開始逐漸降低，于12 h降到最低值，為0.04倍，24 h時(shí)表達(dá)量略有回升，但還是顯著低于正常水平，為0.21倍。在高溫處理下，的表達(dá)量呈現(xiàn)“降-升-降-升”的趨勢(shì)，1 h時(shí)表達(dá)量下降，為正常水平為0.47倍，6 h時(shí)表達(dá)量接近正常水平，12 h時(shí)表達(dá)量又表現(xiàn)出下調(diào)模式為0.46倍，24 h時(shí)為0.65倍。在高鹽處理下，在1、12、24 h的表達(dá)量與0 h相比并無顯著差異，只有6 h時(shí)表達(dá)量與0 h的表達(dá)量差異顯著，為正常水平的2.76倍。在干旱處理下，的表達(dá)量呈現(xiàn)“降-升-降”的趨勢(shì)，1 h時(shí)表達(dá)量下降到正常水平以下，但無顯著差異，6 h時(shí)開始上調(diào)，12 h時(shí)到達(dá)最大值為2.94倍，24 h時(shí)的表達(dá)量開始下降，為1.53倍（圖7）。由此推測(cè)與桑樹的非生物脅迫響應(yīng)有關(guān)。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）；**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

2.4 MaUBC-C的原核表達(dá)

以克隆質(zhì)粒為模板，帶有pET-30a載體接頭的引物pET-30a--F、pET-30a--R為模板，擴(kuò)增獲得。利用無縫克隆技術(shù)將和pET-30a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。經(jīng)菌落PCR和HⅠ、dⅢ雙酶切鑒定（圖8），將驗(yàn)證正確重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示插入片段序列與ORF序列完全一致，表明原核表達(dá)載體pET-30a-構(gòu)建成功。

M: GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder; 1: MaUBC-C. 2: pET-30a-MaUBC-C; 3: Double enzyme digestion of pET-30a-MaUBC-C by BamHⅠ andHindⅢ.

用0.5 mmol/L的IPTG在37℃條件下對(duì)重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h。對(duì)獲得的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)和免疫印跡分析，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，誘導(dǎo)菌株出現(xiàn)一條大小25 kDa左右的條帶，大小與預(yù)期基本相符（圖9A），利用His-Tag抗體對(duì)重組菌株進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示重組菌株出現(xiàn)與一條大小與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果相同的特異性條帶，只含pET-30a的大腸桿菌（對(duì)照）并沒有條帶出現(xiàn)（圖9B），原核表達(dá)成功。

圖9 MaUBC-C誘導(dǎo)情況驗(yàn)證

3 討論

泛素結(jié)合酶E2在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，與植物的光形態(tài)建成、非生物脅迫、免疫響應(yīng)等生理活動(dòng)有關(guān)[12]。目前，已有多種植物的E2全基因家族被鑒定出來，擬南芥、土豆、番茄、香蕉中分別有37、57、59、74個(gè)E2[13-16]。本研究從桑樹品種‘桂桑優(yōu)62號(hào)’克隆獲得了1個(gè)基因，命名為。該基因編碼的MaUBC-C蛋白與同為桑屬的川桑MnUBC-C蛋白具有98.40%的相似度和較近的親緣性，這表明E2蛋白在進(jìn)化過程中高度保守。

已有多個(gè)研究表明基因在多種植物中具有組織特異性。在高粱中，有8個(gè)SbUBC基因在葉片或種子表達(dá)量是其他組織中的30倍以上，表明這些基因可能參與了葉片或種子的發(fā)育[17]；檢測(cè)在葡萄中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，和分別在衰老的葉片和冬芽中表達(dá)量較高，推測(cè)和可能與葡萄的落葉期和休眠期的生理活動(dòng)有關(guān)[18]；玉米中的在不同的組織中具有不同的表達(dá)模式，說明基因在玉米發(fā)育過程中起著多方面的作用[19]。本研究利用熒光定量PCR分析了在桑苗中不同組織中（根、莖、葉）的表達(dá)模式，結(jié)果顯示在根、莖、葉中均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量最高，推測(cè)可能在桑樹的根中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。

泛素結(jié)合酶E2與植物的免疫防御息息相關(guān)，參與植物對(duì)病毒的應(yīng)答過程。CHEN等[20]通過分析感染黃瓜花葉病毒（, CMV）黃金百香果的轉(zhuǎn)錄組得到了43個(gè)表達(dá)量發(fā)生變化的泛素化相關(guān)基因，其中包括2個(gè)基因。EINI等[21]驗(yàn)證出木爾坦棉花曲葉病毒（, CLCuMV）中的βC1和番茄SlUBC3蛋白可以發(fā)生相互作用，且βC1轉(zhuǎn)基因煙草中的多泛素化蛋白水平會(huì)增加，推測(cè)βC1與SlUBC3的互作影響CLCuMV侵染植株的過程。IMURA等[22]證明了擬南芥AtUbc2p蛋白與番茄叢矮病毒（, TBSV）中的復(fù)制蛋白P33互作，AtUbc2p可以提高TBSV的復(fù)制能力。本研究驗(yàn)證了桑脈帶相關(guān)病毒MVBaV可以影響基因的表達(dá)，證明基因與MVBaV侵染桑樹有關(guān)。但該基因在MVBaV侵染桑樹的過程中的作用機(jī)制尚不清楚。本課題組將研究MaUBC-C的互作蛋白，從而進(jìn)一步明確基因在桑樹免疫中的功能。

大量研究表明參與植物的激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫調(diào)節(jié)。用SA、MeJA處理龍眼發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)，表明泛素結(jié)合酶與龍眼的激素響應(yīng)通路有關(guān)[23]；AHN等[24]通過對(duì)擬南芥的、、單突變株和三突變株進(jìn)行ABA和干旱處理，氣孔關(guān)閉程度和萎蔫情況顯示突變株對(duì)ABA和干旱處理更為敏感，這說明、和在干旱脅迫響應(yīng)中起著負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用；SUN等[25]獲得了擬南芥、突變株后對(duì)其進(jìn)行了高鹽處理，結(jié)果表明、突變株表現(xiàn)出高鹽逆境的不耐受，他們又對(duì)和回補(bǔ)株進(jìn)行了高鹽逆境鑒定，結(jié)果顯示回補(bǔ)株與野生型并無差異，這證實(shí)了、與擬南芥的干旱調(diào)節(jié)有關(guān)；陳曙等[26]對(duì)玉米進(jìn)行低氮處理發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的8個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，推測(cè)玉米泛素結(jié)合酶可能參與了玉米對(duì)低氮脅迫響應(yīng)過程。在外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）、非生物脅迫（低溫、高溫、高鹽、干旱）的處理下，表達(dá)量產(chǎn)生了不同程度的變化，推測(cè)在桑樹的激素信號(hào)調(diào)節(jié)和逆境脅迫中具有重要作用。

已有研究表明，ABA、MeJA與植物對(duì)病毒的抗性有關(guān)。ALAZEM等[27]證明ABA通過調(diào)節(jié)2、3的表達(dá)來提高植株對(duì)竹花葉病毒（, BaMV）的抗性；大豆中的抗性基因可以誘導(dǎo)ABA的合成，從而提高對(duì)大豆花葉病毒（, SMV）無毒株系G5H的抗性[28]；MeJA通過提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、激活一系列的抗氧化酶、誘導(dǎo)抗性基因的表達(dá)來增強(qiáng)黑綠豆對(duì)印度綠豆黃花葉病毒（, MYMIV）的抗性[29]。本研究已經(jīng)證明MVbaV、ABA、MeJA可以誘導(dǎo)基因的表達(dá)，推測(cè)基因可能在ABA、MeJA誘導(dǎo)的對(duì)病毒的抗性中起到一定的作用，但具體作用機(jī)制尚不可知。另外，植物的蛋白酶體途徑和激素的合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)協(xié)同作用來影響植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[30-31]，以維持植株的正常生長，但對(duì)逆境脅迫響應(yīng)是否與植株體內(nèi)激素豐度的調(diào)節(jié)和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)還有待研究。我們通過原核表達(dá)獲得了MaUBC-C的蛋白，后續(xù)研究中將進(jìn)一步驗(yàn)證其體外的活性，解析基因在桑樹的激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫、免疫反應(yīng)中的作用。本研究克隆了基因，分析了其在外源激素處理和非生物脅迫下的表達(dá)模式，并獲得了MaUBC-C蛋白，為揭示泛素-蛋白酶體途徑在桑樹中的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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Expression Pattern Analysis and Prokaryotic Expression ofGene in Mulberry

ZHAO Xinru1, MO Yingxi1, LI Jieqiu2, MENG Jiaorong1*

1. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China; 2. Agri-animal Industuial Development Institute, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China

Ubiquitin-conjugating enzyme (E2) plays an important role in plants and participates in physiological activities such as plant growth and development, stress, immune response and so on. In previous research, we profiled the transcriptome of ‘Guisangyou 62’ which infested with mulberry vein binding-associated virus (MVBaV) to obtain the up-regulated expression gene. In order to explore the function of, the CDS sequence ofwas cloned from mulberry for bioinformatics and expression pattern analysis, and MaUBC-C was obtained by prokaryotic expression. The results showed that the coding region ofwas 567 bp, coding 188 amino acids, and it was predicted to target the nuclear. MaUBC-C was 21.03 KDa and belonged to hydrophilic, acidic and unstable protein with a conserved UBC domain. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of UBC inand other species showed thatMaUBC-C had the highest similarity with the homologous MnUBC from, which was 98.40%. Thereal-time fluorescence quantitative PCR data showed thatwas expressed in roots, stems and leaves, and the highest expression was in roots, which were 1.24 and 1.71 times higher than those in stems and leaves, respectively. And we foundresponded to differently to different (ABA, GA, MeJA, SA) and abiotic stress (low temperature, high temperature, high salt, drought).Among them,was significantly up-regulated after treatment with ABA and MeJA, as the expression at 24 h was 29.55 and 9.05 times of the normal level, respectively. It is speculated that MaUBC-C may extensively regulate the growth and development of mulberry, participating in the hormonal signal transduction and defense responses to abiotic stresses. The prokaryotic expression vector pET-30a-was constructed and transformed intoBL21 to induce the expression ofwith 0.5 mmol/L IPTG at 37℃. SDS-PAGE gel showed that a band with a size of about 25 kDa appeared from 2 h, the size was basically consistent with the expectation. And Western-blot showed that it could react specifically with His-tag monoclonal antibody indicating thatwas successfully expressed, which provided basic materials for functional research of. The results of this study would providea theoretical basis for further exploring the mechanism of action of the ubiquitin proteasome pathway in mulberry.

mulberry; ubiquitin-conjugating enzyme; expression pattern; prokaryotic expression

S888.2

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.010

2022-01-25；

2022-03-14

廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 2017GXNSFDA198004）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31660036）。

趙鑫茹（1996—），女，碩士研究生，研究方向：植物病理學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：蒙姣榮（MENG Jiaorong），E-mail：mengjiaorong@163.com。