陽麗華 肖惠琳 何迎慶 車?yán)?張建忠

（1. 廈門中藥廠有限公司 廈門 361100；2. 上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司 上海 200020）

芪骨膠囊由淫羊藿、制何首烏、黃芪、石斛、肉蓯蓉、骨碎補(bǔ)、菊花組成，具有滋養(yǎng)肝腎，強(qiáng)筋健骨的功效。用于女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥肝腎不足證，癥見腰膝酸軟無力、腰背疼痛、步履艱難、不能持重[1-2]。目前芪骨膠囊產(chǎn)品質(zhì)量控制方法中沒有指紋圖譜技術(shù)，而中藥指紋圖譜技術(shù)具有信息量大，特征性強(qiáng)，可同時(shí)反映中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分的整體情況，較完整地反映中藥材及其制劑的質(zhì)量[3]。目前范興等[4]研究的芪骨膠囊指紋圖譜指認(rèn)出5個(gè)化合物，為了指認(rèn)出盡可能多的活性化學(xué)成分及控制盡可能多的處方藥味的質(zhì)量，我們進(jìn)一步深入研究了芪骨膠囊指紋圖譜，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世有限公司）；ME1002E電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

松果菊苷（批號(hào)111670-201706，含量89.7%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920-201606，含量97.6%）、柚皮苷（批號(hào)110722-201815，含量91.7%）、淫羊藿苷（批號(hào)110737-201516，含量94.2%）、朝藿定C（批號(hào)111780-201804，含量92.6%）、大黃素（批號(hào)110756-201512，含量98.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（批號(hào)must-18051611，含量99.44%）、朝藿定B（批號(hào)must-18071403，含量99.23%）、朝藿定A（批號(hào)must-18072304，含量98.13%）、淫羊藿次苷Ⅰ（批號(hào)must-18102120，含量97.78%）、寶藿苷Ⅰ（批號(hào)must-18042203，含量99.58%）購自成都曼思特生物科技有限公司；芪骨膠囊來自廈門中藥廠有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；檢測(cè)波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相[4]為甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫（表1）。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

1.3.2 溶液的制備

1）供試品溶液 精密稱量芪骨膠囊內(nèi)容物0.5 g加入50 mL甲醇，稱定重量；超聲30 min，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析[4]。

2）對(duì)照品溶液 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含松果菊苷18.55 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷25.22 μg、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷30.95 μg、柚皮苷 26.89 μg、朝藿定 A 25.75 μg、淫羊藿苷18.92 μg、朝藿定 B 20.00 μg、淫羊藿次苷Ⅰ 26.60 μg、朝藿定 C 22.48 μg、大黃素 16.07 μg、寶藿苷Ⅰ 22.70 μg的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

分別取空白溶劑和芪骨膠囊供試品溶液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明，空白溶劑（甲醇）對(duì)供試品溶液的分析不存在干擾，專屬性良好（圖1）。

圖1 專屬性考察用HPLC分析

2.2 精密度試驗(yàn)

吸取供試品溶液進(jìn)樣6次分析，以淫羊藿苷的峰面積和保留時(shí)間為參照，計(jì)算15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD在0.09%～2.29%之間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.01%～0.09%之間，表明儀器的精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液分別于室溫放置0、2、4、6、10、16、24、36、48、72 h時(shí)進(jìn)樣分析，以淫羊藿苷的峰面積和保留時(shí)間為參照，計(jì)算15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD在0.49%～3.18%之間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.01%～0.62%之間，表明供試品在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批芪骨膠囊粉制備6份芪骨膠囊供試品溶液，進(jìn)樣分析，以淫羊藿苷的峰面積和保留時(shí)間為參照，記錄15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD在0.20%～2.95%之間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.01%～1.15%之間，表明實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立與相似度、共有峰分析

取21批芪骨膠囊粉末進(jìn)樣和分析，運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）進(jìn)行21批樣品HPLC圖譜分析，得HPLC指紋圖譜（圖2、3）。

圖2 21批樣品的HPLC疊加指紋圖譜

2.6 相似度評(píng)價(jià)

運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì)照，對(duì)整體相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。各樣品圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明21批樣品質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

圖3 樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜

2.7 共有峰的指認(rèn)

通過與各味藥材、陰性樣品色譜圖比對(duì)，對(duì)15個(gè)共有色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)了14個(gè)峰的藥味歸屬[4-10]，其中峰7、8、9、10、11、12、13、14歸屬淫羊藿；峰4、15歸屬何首烏；峰5、6歸屬骨碎補(bǔ)；峰3歸屬黃芪；峰2歸屬肉蓯蓉。與混合對(duì)照品色譜圖比對(duì)，指認(rèn)出了11個(gè)峰的化學(xué)成分，峰2為松果菊苷、峰3為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、峰4為2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、峰6為柚皮苷、峰7為朝藿定A、峰8為朝藿定B、峰9為朝藿定C、峰10為淫羊藿苷、峰11為淫羊藿次苷1、峰14為寶藿苷1、峰15為大黃素。

3 討論

通過大量實(shí)驗(yàn)，對(duì)流動(dòng)相組成和流動(dòng)相洗脫條件的優(yōu)化研究，最終優(yōu)選出液相色譜條件，在該技術(shù)條件下所建立的指紋圖譜能同時(shí)檢測(cè)出芪骨膠囊的11個(gè)化學(xué)成分，比范興等建立的芪骨膠囊HPLC指紋圖譜可多指認(rèn)出6個(gè)化學(xué)成分，加嚴(yán)了產(chǎn)品的質(zhì)量控制。另外對(duì)15個(gè)峰進(jìn)行了藥味歸屬，可提升產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平。

本研究建立的芪骨膠囊指紋圖譜檢測(cè)方法，其專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果均符合要求，具有較好的可行性。后期將繼續(xù)收集大量批次的芪骨膠囊樣品來驗(yàn)證所建立的對(duì)照指紋圖譜的合理性，對(duì)其不斷完善，為產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更加全面的理論依據(jù)。