趙 琳，蘇世家，王嘉瑞，于英莉，2，周 昆，2

(1. 天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院， 2. 省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津 301617)

補骨脂是豆科植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL)的干燥成熟果實，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉的功效，是二神丸、青娥丸等經(jīng)典方劑的重要組成成分，已被廣泛用于治療白癜風、骨折、骨質(zhì)疏松癥等[1]多種疾病。隨著在臨床上的廣泛應(yīng)用，越來越多的臨床報告表明補骨脂具有潛在的肝毒性[2]，引發(fā)了學者對于補骨脂中毒性成分的關(guān)注。補骨脂素是補骨脂水煎液體內(nèi)吸收的主要活性成分之一，其含量是補骨脂藥材質(zhì)量控制的限定標準。現(xiàn)代藥理研究表明，補骨脂素具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、神經(jīng)保護、抗炎等藥理作用[3]。補骨脂素在長期或大劑量給藥情況下可引起大鼠、小鼠、斑馬魚等動物嚴重肝損傷，其毒性機制與膽汁酸代謝，細胞色素P450代謝以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等引起的氧化應(yīng)激、線粒體毒性、肝細胞凋亡等密切相關(guān)[3]。

人肝癌細胞(human hepatocellular carcinomas，HepG2)是分離自人類肝癌組織的細胞系，在培養(yǎng)中相對容易維持，具有許多正常肝細胞特征，也是目前用于肝毒性評估最常用的人類細胞模型之一[4]。然而，在傳統(tǒng)的2D單層培養(yǎng)中，HepG2細胞中細胞色素P450(CYP450)酶[5]表達水平較低，而CYP450酶的活性和誘導性是預(yù)測藥物體內(nèi)過程和毒性不良反應(yīng)的關(guān)鍵指標[6]。因此，在藥物開發(fā)和肝毒性研究中，細胞體外三維類(3D)組織聚球體培養(yǎng)成為近年來的研究熱點之一。相比傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)，3D培養(yǎng)可以更好地模擬細胞和組織功能，具有更好的建模效果。其最大特點是增強了細胞-細胞、細胞-基質(zhì)的相互作用并提高了肝臟特異性功能的表達，從而在體內(nèi)提供了生理上更相關(guān)的模型[7]。但體外肝臟3D模型在中藥毒性評價方面的應(yīng)用仍處于初級階段，有待進行更多的驗證和探索。

本研究首先利用低吸附U形底多孔板法構(gòu)建HepG2細胞的3D多細胞聚球體模型，并對該模型進行肝臟特異性功能檢測；分別使用2D和3D培養(yǎng)的HepG2細胞模型評價補骨脂素的毒性并比較其差異性，進一步探討補骨脂素的肝毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑補骨脂素(≥98%，19101703)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培基(2053260)購自以色列BI公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，1922693)購自以色列BI公司；青鏈霉素(MA0110)購自大連美侖生物有限公司；CCK-8(59122500)購自Biosharp；總RNA小量抽提試劑盒(P10301)，TRANZOL UP(P10301)，Trans Script First-Strand CDNA Synthesis Super Mix(P20610)均來自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ultra SYBR Mixture(33620)購自北京康為世紀生物科技有限公司；四甲基羅丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM，43818)購自美國Med Chem Express；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，4083S)購自美國Cell Signaling Technology；白蛋白(Albumin，ALB，200921)試劑盒和尿素氮(Urea nitrogen，BUN，201041)試劑盒均購自中生北控生物科技股份有限公司；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH，LE647)試劑盒購自日本Dojindo Laboratories。

1.2 儀器熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；高內(nèi)涵篩選儀(INcell Analyzer 2500 HS)購自美國GE公司；NanoDrop One超微量分光光度計購自美國Thermo公司；全自動血清生化儀購自日本Hitachi公司；酶標儀(SPARK)來自瑞士THCAN公司。

1.3 細胞培養(yǎng)HepG2細胞系取自中國科學院(上海)細胞庫，將HepG2細胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，使用含F(xiàn)BS(10%)、青霉素(100 kU·L-1)和鏈霉素(100 kU·L-1)1% DMEM，于37 ℃、5% CO2條件下進行單層培養(yǎng)。培養(yǎng)基隔天更換，細胞貼壁生長覆蓋瓶底80%～90%時可傳代。

1.4 3D細胞模型的構(gòu)建本研究使用低吸附U形底多孔板法構(gòu)建3D細胞模型[8]。以每孔1 500、4 500和7 500個細胞接種于超低吸附U型底96孔板(購自美國Corning公司)中，每孔100 μL懸液，在超凈臺中放置5 min，使用顯微鏡觀察細胞，放于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天進行半換液；于接種后d 1～4，6、8、10進行顯微鏡觀察，用顯微鏡拍照記錄不同接種密度的3D HepG2聚球體的聚集形態(tài)。

1.5 肝功能評價將細胞分別進行2D和3D細胞模型培養(yǎng)。通過全自動血清生化檢測儀檢測3D培養(yǎng)條件下HepG2細胞聚球體在d 2、4、6、8、10中，以及2D培養(yǎng)條件下細胞d 2的ALB和BUN分泌的含量。

1.6 Q-PCR檢測將HepG2細胞分別進行2D和3D細胞模型培養(yǎng)，取2D培養(yǎng)2 d,以及3D條件下培養(yǎng)4 d和10 d的細胞聚球體為樣本，通過實時定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，Q-PCR)測定其CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4以及UGT1A1的mRNA表達水平。另取3D條件下培養(yǎng)4 d，不同濃度補骨脂素給藥24 h的細胞聚球體為樣本，通過Q-PCR測定其線粒體動力相關(guān)蛋白 1(dynamin-related protein 1，DRP1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn-2)以及視神經(jīng)萎縮蛋白 1(optic atrophy 1，OPA1)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。其引物由上海生工生物科技有限公司合成。采用通用型總RNA提取試劑盒進行樣本RNA提取，使用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計測定所提取的細胞中RNA的濃度和純度。隨后采用TransScript First-Strand CDNA Synthesis Super Mix進行CDNA反轉(zhuǎn)錄，將配置完成的反應(yīng)體系充分混勻后放入Q-PCR儀上進行PCR反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min(收集熒光)；40個PCR循環(huán)。Q-PCR所用引物見Tab 1，為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，從60 ℃緩慢加熱到90 ℃。以GAPDH為內(nèi)參，采用Livak(2-ΔΔCt)法進行相對基因表達分析。

Tab 1 Q-PCR target gene primer sequences

1.7 2D細胞模型評價補骨脂素毒性補骨脂素分為5個劑量組，分別為對照組、50、100、200和400 μmol·L-1組。2D細胞模型以4.5×103個/孔的密度接種于普通96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄去全部的舊培養(yǎng)基，再給予100 μL藥物進行處理。24 h后換成100 μL含CCK-8試劑的培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育2 h后，使用酶標儀450 nm測光密度(optical density，OD)值，檢測細胞存活率。

1.8 3D細胞模型評價補骨脂素毒性補骨脂素分為5個劑量組，分別為對照組、50、100、200和400 μmol·L-1組。3D聚球體細胞模型以4.5×103個/孔的密度接種于低吸附U型底96孔板，培養(yǎng)4 d后，棄去全部的舊培養(yǎng)基，再給予100 μL藥物進行處理。24 h后換成100 μL含CCK-8試劑的培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育4.5 h后，使用酶標儀450 nm測OD值，檢測細胞存活率。

1.9 LDH漏出量測定移取“1.7”“1.8”中2D單層細胞，3D HepG2聚球體給藥24 h后的上清液50 μL在普通96孔板中，按照日本都津道分子技術(shù)公司的活性/細胞毒性復合檢測試劑盒的說明進行LDH漏出水平的測定。每孔加入50 μL工作液，室溫黑暗孵育25 min。每孔加入25 μL的stop溶液，用酶標儀記錄490 nm處的OD值，檢測LDH漏出量。

1.10 線粒體膜電位水平2D/3D細胞模型的培養(yǎng)及給藥方式如“1.7”“1.8”所示，給藥24 h后，使用TMRM和DAPI對細胞進行染色，分別用高內(nèi)涵篩選儀的2D和3D模式，以548 nm的激發(fā)波長、570 nm的發(fā)射波長檢測TMRM和以350 nm的激發(fā)波長、460 nm的發(fā)射波長檢測DAPI的熒光強度并進行圖像分析，通過高內(nèi)涵分析軟件計算平均熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 3D培養(yǎng)模型的建立和評價

2.1.1細胞聚球體的形成 由形態(tài)觀察可見，3D條件下，微球直徑隨著培養(yǎng)時間及初始接種密度的增加而增大，連續(xù)培養(yǎng)3 d細胞自發(fā)聚集形成致密穩(wěn)定的球形，以1 500、4 500、7 500個/孔的接種密度分別進行接種，如Fig 1A，B所示，對比3種接種密度的球體增長情況來看，1 500個/孔HepG2球體的初始直徑較小，球體體積總體較小。4 500個/孔的HepG2細胞聚球體生長速度明顯快于7 500個/孔細胞聚球體，體積變化幅度大，且符合在細胞球直徑為200 μm左右時活性較高，且不會出現(xiàn)大量的核壞死的條件[9]。因此選擇4 500個/孔的密度種板進行后續(xù)實驗。

2.1.23D模型具有較高的ALB和BUN分泌水平以及肝藥酶活性 通過不同的培養(yǎng)方式，在細胞培養(yǎng)的不同時間點，收集細胞培養(yǎng)上清液，分別對ALB和BUN含量進行檢測。如Fig 2A，B示，3D培養(yǎng)2 d后，白蛋白和尿素氮分泌都達到較高水平，且均顯著性高于2D培養(yǎng)水平。該水平一直維持到培養(yǎng)10 d后。該結(jié)果表明，3D模型可以長時間保持高水平ALB和BUN分泌，維持其肝臟功能。

肝藥酶活性是影響藥物肝毒性的重要因素。為檢測3D模型培養(yǎng)下細胞的代謝能力，通過Q-PCR測定重要的CYP450酶的活性，評價細胞模型的代謝功能，并與2D細胞進行比較。如Fig 2C所示，3D細胞培養(yǎng)至d 4和d 10時，CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和UGT1A1的mRNA表達與2D細胞相比均升高，其中3D細胞培養(yǎng)至d 4時CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和UGT1A1 mRNA的表達分別為2D細胞的2.49、6.44、4.17和3.78倍。

Fig 1 Formation of 3D HepG2 cell

2.2 比較補骨脂素對2D/3D培養(yǎng)HepG2細胞的肝毒性差異在2D和3D細胞模型中，補骨脂素均明顯降低細胞存活率。在2D細胞培養(yǎng)模型中，與對照組相比，400 μmol·L-1的補骨脂素處理后，細胞的存活率下降到86.78%(Fig 3A)，而LDH漏出量增加至115.33%(Fig 3B)。3D細胞模型相比于2D細胞，在更低的劑量下表現(xiàn)出細胞毒性，與對照組相比，100、200和400 μmol·L-1的補骨脂素處理后，細胞的存活率分別下降到83.97%、79.02%和72.45%(Fig 3C)。LDH漏出量也從100 μmol·L-1開始出現(xiàn)明顯增加，分別增加至111.21%、127.28%和137.60%(Fig 3D)。因此，結(jié)果顯示3D 細胞培養(yǎng)模型對補骨脂素的反應(yīng)更為敏感。

2.3 比較補骨脂素對2D/3D培養(yǎng)HepG2細胞的線粒體損傷差異線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)是評估線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)，細胞在發(fā)生凋亡時多伴有MMP的下降。使用熒光染料TMRM染色線粒體，一旦MMP喪失，TMRM積累將停止，信號變暗或消失。如Fig 4C，D所示，3D條件培養(yǎng)的細胞聚球體TMRM熒光強度明顯低于對照組。當補骨脂素為100、200和400 μmol·L-1時，3D聚球體的TMRM熒光強度明顯降低，分別為對照組的52.80%、55.54%和34.85%(Fig 4C)。相反，如Fig 4A，B所示，2D細胞模型與對照組相比，僅在400 μmol·L-1時，TMRM熒光強度明顯下降至88.23%。

Fig 2 3D model with higher levels of albumin and urea secretion and liver drug enzymatic

Levels of (A)albumin and (B)urea secretion in 2D/3D cell models; C：CYP3A4，CYP2E1，CYP1A2 and UGT1A1 mRNA level.*P<0. 05，**P<0. 01vs2D;#P<0. 05，##P<0.01vs3D-4 d.

Fig 3 Comparison of hepatotoxicity of psoralen in 2D/3D HepG2 cell

Fig 4 Psoralen induced mitochondrial membrane potential reduction in 2D/3D HepG2

2.4 補骨脂素誘導線粒體融合分裂失衡DRP1是介導線粒體分裂的主要蛋白之一。線粒體外膜之間的融合是由線粒體融合蛋白Mfn-1和Mfn-2介導的，而線粒體內(nèi)膜之間的融合是由OPA1介導。如Fig 5所示，Q-PCR檢測了3D HepG2細胞膜型中線粒體分裂-融合動態(tài)的關(guān)鍵指標，比照對照組，DRP1的表達明顯增加至162.84%；而線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn-2未有顯著性差異，OPA1表達明顯降低，為對照組的82.99%。提示補骨脂素誘導了線粒體分裂。

Fig 5 Effect of psoralen on expression of mitochondrial fusion and fission-related genes in 3D HepG2 cell model *P<0. 05 vs control

3 討論

由于傳統(tǒng)的2D細胞模型的局限性，建立合適的模型對于臨床前藥物開發(fā)和疾病研究非常迫切。與傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)相比，3D細胞培養(yǎng)通過模擬細胞-細胞和細胞-基質(zhì)相互作用，以及多種新技術(shù)提供類似體內(nèi)的生物物理環(huán)境[10]。低吸附U形底多孔板法構(gòu)建的3D HepG2細胞聚球體模型，操作簡單，成本相對較低，可大量快速進行肝細胞類組織球體構(gòu)建，模型功能表現(xiàn)突出，并能實現(xiàn)長期培養(yǎng)[11]，可進行常規(guī)的藥物安全性評估，直接應(yīng)用于高通量高內(nèi)涵等相關(guān)檢測設(shè)備，方便快捷。與2D模型相比，該模型可以長期培養(yǎng)，且能夠保持較高的白蛋白和尿素氮分泌水平和肝藥酶活性。

通過對細胞存活率以及LDH漏出量的檢測，結(jié)果表明補骨脂素對于3D培養(yǎng)的細胞損傷更為嚴重，而且更低濃度的補骨脂素即可造成細胞明顯損傷，提示3D細胞模型對補骨脂素的肝毒性更為敏感。3D培養(yǎng)模型中藥物代謝酶活性較高與人肝細胞代謝能力強的特征較為符合，這可能是2D/3D培養(yǎng)條件下同種細胞作用于相同化合物出現(xiàn)毒性差異的原因之一。3D細胞模型在評價藥物代謝后的肝臟毒性方面具有獨特優(yōu)勢。

線粒體在藥物性肝損傷中起著中心作用[12]。有研究顯示，補骨脂素能夠破壞肝細胞線粒體膜完整性，引起ATP合成障礙[13]。因此，明確補骨脂素對線粒體的影響尤為重要。正常的MMP是維持氧化磷酸化和產(chǎn)生 ATP 的先決條件，MMP下降是細胞凋亡的一個早期標志[14]。補骨脂素在3D HepG2聚球體上以更低的藥物濃度就可以誘導HepG2細胞MMP降低，表現(xiàn)出線粒體毒性。正常情況下，線粒體分裂和融合是動態(tài)平衡的，線粒體形態(tài)改變受線粒體融合分裂蛋白控制。線粒體動態(tài)平衡是保證膜結(jié)構(gòu)完整的重要條件，也是維持正常膜電位的重要機制，在維持線粒體功能方面起著關(guān)鍵作用，是保證細胞正?；顒拥闹匾A(chǔ)[15-16]。補骨脂素給藥后，3D HepG2細胞膜型中線粒體分裂蛋白DRP1表達明顯升高，而線粒體融合蛋白OPA1表達明顯降低，提示線粒體分裂增加、融合減少。過度的線粒體裂變會破壞線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，導致線粒體功能障礙并伴隨MMP的降低，激活線粒體途徑的細胞凋亡[17-18]。

綜上所述，由低吸附U形底多孔板法構(gòu)建的3D HepG2細胞模型與2D細胞相比，有更好的代謝特征。補骨脂素對3D細胞模型造成的細胞毒性和線粒體損傷作用強于2D模型。補骨脂素造成線粒體過度分裂，可能是其誘導線粒體功能失常、細胞凋亡的關(guān)鍵性因素，但補骨脂素如何導致線粒體DRP1和OPA1的具體機制還有待進一步研究。