謝高倩，高玉海，魏 朋，何玥穎，柏 鑫 ，陳 卓，秦 昆，郭建魁，陳克明，牛廷獻(xiàn)

(1. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2. 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院科訓(xùn)科，甘肅 蘭州 730050)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)病率逐漸增加的疾病，人口老齡化現(xiàn)象將導(dǎo)致世界人口中OP和脆性骨折的比例逐年增加[1]。骨形成和骨吸收之間的平衡對(duì)于保持骨骼健康至關(guān)重要[2]，骨吸收量高于骨形成量的骨代謝失衡是導(dǎo)致OP的重要原因之一，因此，抑制骨吸收是預(yù)防和治療OP的重要手段。例如雙膦酸鹽是目前公認(rèn)療效較為理想的抗骨吸收一線藥物[3]，但其缺點(diǎn)是對(duì)消化道有刺激損傷作用，而且長(zhǎng)期使用存在導(dǎo)致下頜骨壞死的風(fēng)險(xiǎn)[4]。近年來(lái)的研究表明，提高峰值骨量(peak bone mass，PBM)可以降低晚年發(fā)生OP及脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)增加峰值骨量來(lái)預(yù)防OP是一種有效且可靠的策略[5]。所謂PBM是指人或脊椎動(dòng)物一生所能達(dá)到的最高骨量，主要由遺傳因素決定，但也可能受到營(yíng)養(yǎng)和生活方式等因素的影響[6]。本課題組最先報(bào)道淫羊藿苷可提高大鼠峰值骨量，是淫羊藿苷可能用作抗骨質(zhì)疏松藥物的重要機(jī)制之一[7]。杜仲又稱“思仲”、“木棉”、“思仙”，味甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎之效，是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥[8]。已有研究表明，杜仲提取物能有效改善實(shí)驗(yàn)大鼠的骨代謝，起到抗骨質(zhì)疏松的作用[9-11]，但發(fā)揮作用的有效成分至今尚無(wú)定論。松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)是杜仲皮中的一種木脂素類物質(zhì)，也是杜仲藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)。吳思敏等[12]曾報(bào)道，PDG能體外促進(jìn)大鼠顱骨成骨細(xì)胞的增殖與分化，但有關(guān)PDG的抗骨質(zhì)疏松體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道。

本文報(bào)道PDG對(duì)青年大鼠骨代謝的影響，以提供PDG是否為杜仲主要抗骨質(zhì)疏松有效成分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)源自杜仲的抗骨質(zhì)疏松新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體質(zhì)量在100 g左右的1月齡SPF級(jí)SD雌性大鼠30只，許可證編號(hào)：SYXK(軍)2017-0047，倫理審核編號(hào)：2021KYLL112，飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度60%～70%，自由攝水與進(jìn)食，所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照“3R”原則進(jìn)行，盡可能減少對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害。

1.1.2主要試劑與儀器 PDG購(gòu)于成都儀睿生物科技有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：YRS003-210301)；4%多聚甲醛中性組織固定液購(gòu)于武漢塞維爾生物科技有限公司；四環(huán)素購(gòu)于日本TCI公司，鈣黃綠素購(gòu)于德國(guó)Sigma公司；OPG、RANKL定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于泉州睿信生物科技有限公司；一抗：Runx-2和RANKL購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，OPG購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，BMP-2、Osterix和β-actin購(gòu)于美國(guó)Affinity公司；二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；Micro CT購(gòu)于平生醫(yī)療科技(昆山)有限公司(型號(hào)：NMC-100)；雙能X線骨密度儀購(gòu)于美國(guó)GE公司(型號(hào)：Prodigy)；熒光顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司(型號(hào)：BX51+DP71)；硬組織切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)LEICA公司(型號(hào)：鋸式Leioa sp1600)；電泳儀和電轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 將實(shí)驗(yàn)大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只，分別為Control組、PDG-25組和PDG-50組。低劑量給藥組(PDG-25)灌胃25 mg·kg-1PDG，高劑量給藥組(PDG-50)灌胃50 mg·kg-1PDG，對(duì)照組(Control)灌胃等體積蒸餾水。每周周一到周六上午灌胃，周日不灌胃。持續(xù)灌胃6周后，取材并開(kāi)展各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2組織病理學(xué)檢測(cè) 大鼠處死后，取出心、肝、脾、肺、腎及子宮，剝離周圍的脂肪組織并迅速固定于4%多聚甲醛固定液中。將各器官固定2周后取出，進(jìn)行包埋、切片與HE染色，在顯微鏡下觀察各器官有無(wú)明顯病理學(xué)改變。

1.2.3離體骨密度檢測(cè) 處死大鼠后剝離得到椎骨和右側(cè)股骨，整齊且方向統(tǒng)一的擺放于雙能X線骨密度儀上檢測(cè)離體骨密度。

1.2.4Micro CT分析 從每組新鮮剝離的左側(cè)股骨中隨機(jī)取5根固定在4%的多聚甲醛中。Micro CT掃描條件：電壓70 kV，電流200 μA，分辨率為中度。用Cruiser軟件掃描獲得原始圖像并得到縱截面最大剖面圖，選擇骨骺線下1.5～3.5 mm區(qū)域通過(guò)Avatar系統(tǒng)重建，得到骨小梁立體圖以及松質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)。

1.2.5血清骨代謝生化指標(biāo)檢測(cè) 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，采用腹主動(dòng)脈采血法抽取血樣，4 000 r·min-1離心15 min，取上清，-80 ℃保存。采用ELISA檢測(cè)450 nm處的OD值，按照試劑盒說(shuō)明說(shuō)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出大鼠骨保護(hù)素OPG和RANKL的含量，結(jié)果表示為ng·L-1。

1.2.6雙熒光標(biāo)記與不脫鈣切片制作 大鼠處死前13、14 d皮下注射四環(huán)素，劑量為30 mg·kg-1；處死前3、4 d皮下注射鈣黃綠色，劑量為5 mg·kg-1；處死取材時(shí)分離出左側(cè)脛骨保存于70%的酒精中，脫水處理后進(jìn)行不脫鈣塑料包埋。包埋完成后使其固定于切片機(jī)上，切片厚度為7～10 μm，經(jīng)1 500～2 000目的砂紙打磨后，在顯微鏡下觀察雙熒光標(biāo)記的結(jié)果。

1.2.7Western blot檢測(cè) 從左側(cè)股骨中隨機(jī)取5根并剔除周圍肌肉等組織，剪碎后放于組織勻漿儀中研磨，研磨完成后加入高效組織蛋白裂解液，取上清用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，以最低濃度進(jìn)行稀釋并加入蛋白上樣緩沖液，98 ℃變性15 min待恢復(fù)室溫后，-80 ℃保存。取蛋白樣品，配制10%SDS-PAGE分離膠分離蛋白，110 V電轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上，放于5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別置于裝有一抗的自封袋中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜后，二抗孵育1.5 h，清洗后曝光檢測(cè)蛋白信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 給藥安全性分析自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1周至第6周，給藥組大鼠和對(duì)照組大鼠的進(jìn)食量和飲水量無(wú)明顯差別，體質(zhì)量差異無(wú)顯著性(P<0.05)，且均精神狀態(tài)良好。各組大鼠主要臟器的組織病理學(xué)觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯病變(Fig 1)。這些結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)所采用的兩種劑量的PDG對(duì)青年大鼠無(wú)明顯毒副作用。

Fig 1 Histopathological examination results of main organs of rats in each group (HE,scale bar=100 μm)

2.2 離體骨密度檢測(cè)灌胃6周后處死所有大鼠檢測(cè)離體骨密度。如Fig 2所示，PDG-25組的股骨骨密度和椎骨骨密度均明顯高于Control組(P<0.05)，PDG-50組明顯高于Control組(P<0.01)。PDG-50組雖高于PDG-25組，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明，PDG能明顯提高青年大鼠骨密度。

Fig 2 Results of bone mineral density in different of rats in each *P<0.05，**P<0.01 vs control

2.3 股骨Micro CT成像分析股骨Micro CT分析得到的最大剖面圖顯示，PDG-25組和PDG-50組松質(zhì)骨骨小梁數(shù)量明顯增多(Fig 3)。重建得到的3D效果圖可以看出，PDG-25組和PDG-50組骨小梁更加密集且骨小梁間距更小(Fig 4)。如Fig 5所示，PDG-50組骨體積分?jǐn)?shù)(BS/TV)和骨小梁數(shù)(Tb.N)明顯高于Control組(P<0.01)、骨小梁厚度(Tb.Th)明顯高于Control組(P<0.05)，且骨小梁分離度(Tb.Sp)極明顯低于Control組(P<0.01)。結(jié)果提示PDG可促進(jìn)青年大鼠骨形成從而增強(qiáng)骨微結(jié)構(gòu)。

Fig 3 Maximum profile of micro CT imaging analysis of femur in each group

2.4 血清骨代謝生化指標(biāo)結(jié)果如Fig 6所示，PDG-25組血清OPG含量顯著高于Control組(P<0.05)，PDG-50組OPG含量明顯高于Control組(P<0.01)；PDG-50組RANKL含量顯著低于Control組(P<0.01)。說(shuō)明PDG促進(jìn)青年大鼠骨形成的同時(shí)也能抑制骨吸收作用。

Fig 4 3D reconstruction map of Micro CT imaging analysis of femur in each group

Fig 5 Quantitative analysis of Micro CT indexes of femoral cancellous bone in each *P<0.05，**P<0.01 vs control

Fig 6 Content of OPG and RANKL in serum *P<0.05，**P<0.01 vs control

2.5 脛骨雙熒光標(biāo)記結(jié)果如Fig 7、8所示，黃色為四環(huán)素標(biāo)記，綠色為鈣黃綠素標(biāo)記，雙熒光間的間距代表10 d內(nèi)骨的生長(zhǎng)。PDG-25組和PDG-50組四環(huán)素和鈣黃綠素之間的標(biāo)記均明顯大于Control組，且PDG-50組的間距大于PDG-25組。說(shuō)明在相同時(shí)間內(nèi)，給藥組的骨形成作用有明顯提高。

2.6 骨形成與骨吸收相關(guān)蛋白表達(dá)情況如Fig 9所示，PDG-25組和PDG-50組BMP2、Runx-2、OSX和OPG的蛋白表達(dá)量均明顯高于Control組，RANKL的蛋白表達(dá)量明顯低于Control組，此結(jié)果與血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果相一致。提示PDG可能通過(guò)上調(diào)BMP2、Runx-2、OSX和OPG的表達(dá)，下調(diào)RANKL的表達(dá)，來(lái)提高青年大鼠的骨形成。

3 討論

OP常常在第一次骨折發(fā)生之前沒(méi)有癥狀，被認(rèn)為是一種無(wú)聲的慢性疾病，其特征是骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨骼強(qiáng)度降低[12]。在全球范圍內(nèi)，OP每年導(dǎo)致890萬(wàn)起骨折，平均每3 s就會(huì)發(fā)生一次骨質(zhì)疏松性骨折。骨質(zhì)疏松癥及其相關(guān)并發(fā)癥也是老年人發(fā)病和死亡的常見(jiàn)原因[13]。因此，向所有健康的青少年、成年人提供預(yù)防OP的措施迫在眉睫。PBM被定義為生命中最高的骨密度值[14]。有研究顯示，青春期PBM的增加可以降低晚年OP和骨折的發(fā)生率[15]。因此，OP的預(yù)防可以從提高PBM的角度展開(kāi)研究。

杜仲是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，其主要化學(xué)成分有木脂素類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、酚酸類、萜類、甾體類和多糖類等，其中木脂素類大多是以PDG為代表的苷類化合物[16]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，木脂素是一種植物雌激素，具有類雌激素作用，在促進(jìn)骨形成的同時(shí)又避免了雌激素可能帶來(lái)的各種不良反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)首次研究了PDG對(duì)青年大鼠骨代謝的影響，結(jié)果提示PDG可能通過(guò)促進(jìn)骨形成與抑制骨吸收來(lái)提高青年大鼠骨質(zhì)量與骨強(qiáng)度。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，25 mg·kg-1、50 mg·kg-1的PDG都能提高生長(zhǎng)期大鼠離體股骨骨密度和離體椎骨骨密度，且高劑量給藥組比低劑量給藥組的作用效果更好，提示PDG提高青年大鼠離體骨密度可能具有劑量依賴性；Micro CT成像分析直觀反映了骨微結(jié)構(gòu)，骨微結(jié)構(gòu)的好壞與骨質(zhì)量的高低密切相關(guān)。Micro CT量化結(jié)果顯示，25 mg·kg-1、50 mg·kg-1的PDG均能增加骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量以及骨小梁厚度，并減小骨小梁間距，且高劑量組的效果更為明顯，最大剖面圖和3D重建圖也反映了與之一致的趨勢(shì)；血清骨代謝生化指標(biāo)直接反映了骨轉(zhuǎn)換率，血清骨形成指標(biāo)OPG和骨吸收指標(biāo)RANKL作為重要的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物，反映了體內(nèi)骨形成和骨吸收的狀態(tài)。血清檢測(cè)顯示，50 mg·kg-1的PDG具有促骨形成和抗骨吸收的雙重作用，25 mg·kg-1促骨形成作用明顯但抗骨吸收作用并不明顯；脛骨雙熒光標(biāo)記中雙熒光間的距離能從動(dòng)態(tài)的角度反映骨微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示25 mg·kg-1、50 mg·kg-1的PDG能明顯增加大青年大鼠脛骨中段雙熒光間的距離，且高劑量給藥組雙熒光間的間距大于低劑量給藥組。說(shuō)明給藥組的骨礦鹽沉積增長(zhǎng)速度相比于對(duì)照組而言有所提高，且高劑量給藥組的骨礦鹽沉積增長(zhǎng)速度高于低劑量給藥組，提示了PDG對(duì)青年大鼠的骨形成有促進(jìn)作用；BMP-2/Runx-2/OSX信號(hào)途徑與骨形成密切相關(guān)，參與調(diào)控成骨細(xì)胞的分化，OPG/RANKL信號(hào)途徑也是骨代謝過(guò)程中重要的信號(hào)途徑之一。Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，25 mg·kg-1、50 mg·kg-1均能上調(diào)BMP-2、Runx-2、OSX與OPG的表達(dá)量，降低RANKL的表達(dá)量，這與血清的檢測(cè)結(jié)果一致。骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)量的增加與骨吸收相關(guān)蛋白表達(dá)量的降低提示，PDG可能通過(guò)刺激骨形成與抑制骨吸收來(lái)調(diào)節(jié)骨代謝，提高青年大鼠骨質(zhì)量。

Fig 7 Double fluorescent labeling of cortical bone in middle tibia fluorescent markers in each group (200×)

Fig 8 Comparison of distance between double fluorescent markers**P<0.01 vs control

Fig 9 The protein levels of BMP2，Runx-2，OSX，OPG and RANKL in each group*P<0.05，**P<0.01 vs control

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，PDG可明顯提高青年大鼠的骨密度，因而有可能通過(guò)提高峰值骨量而預(yù)防大鼠骨質(zhì)疏松，且其作用機(jī)制可能與影響骨形成和骨吸收有關(guān)。這些結(jié)果表明，PDG很可能是杜仲抗骨質(zhì)疏松的有效成分，應(yīng)具有開(kāi)發(fā)為抗骨質(zhì)疏松藥物的潛力。但此種作用與其他已報(bào)道能提高峰值骨密度的天然產(chǎn)物或藥物相比有何優(yōu)勢(shì)？PDG對(duì)于由切除卵巢引起的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有無(wú)預(yù)防或治療作用？其作用機(jī)制如何？與其他藥物相比有何優(yōu)勢(shì)？本課題組接下來(lái)將對(duì)這些問(wèn)題予以研究。